流式细胞仪检测细胞凋亡
流式细胞仪检测早期细胞凋亡：AnnexinVPI双染色法
流式细胞仪检测早期细胞凋亡：AnnexinVPI双染色法流式细胞仪检测早期细胞凋亡:Annexin V/PI双染色法作者：发布日期：(2009-06-24) 浏览次数：0次细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。
这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。
PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。
巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。
Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。
因此，该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
因此，可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如（PI）有拒抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞DNA可被PI着染而产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号，正常活细胞与此相似。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为Annexin V -/PI-；右上象限是凋亡晚期细胞或凋亡继发性坏死细胞，为Annexin V +/PI+；而右下象限为早期凋亡细胞，显现Annexin V +/PI-（图1）。
图1 细胞凋亡的Annexin V-FITC/PI检测法试剂准备结合缓冲液：10mmol/L HEPES/NaOH，PH 7.4，140mmol/L NaCl，5mmol/L CaCl2Annexin V-FITC溶液碘化丙锭（PI）溶液实验步骤1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，500~1000r/min离心5min，弃去培养液。
《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。
33. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡细胞凋亡的检测方法众多，流式细胞仪检测凋亡，是常用的方法。
由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。
因此，具有其它方法无可比拟的优越性。
本文主要结合我室的一些实际经验，力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。
在凋亡诱导剂的作用下，首先是细胞色素C和apa f－1形成复合体，线粒体的功能发生衰退；后是caspase家族激活，磷脂酰丝氨酸外翻，这时细胞的形态已经发生了改变，可以看到细胞变小，胞核皱缩；最后是细胞内DNA断裂，形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中，都有相应的流式细胞仪的检测方法，我室曾经检测过的方法包括：1线粒体功能2DNA Cycle3 Caspases4Annexin V Assay6DNA Fragmentation Assays基本上涵盖了细胞凋亡的各个期，对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒（产品编号为BVK250）和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。
其检测主要采用阳离子型荧光染料。
原理是：正常细胞中，染料可以在线粒体内聚集，发出明亮的红色荧光；而细胞凋亡后，其线粒体膜电位发生改变，染料无法进入线粒体，只能在胞质中以单体形式存在，发出绿色的荧光。
可以在荧光显微镜下，或流式检测。
采用488nm激发，其检测波长分别是527nm和590nm。
整个实验过程操作简单，只需要30min就可以见到结果。
Caspase家族可以检测的分子非常多，也有不少商业的试剂盒可以应用。
即使没有相应的试剂盒，只要有相应抗体基本上是可以检测的，具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变，细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。
在凋亡细胞中，细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。
Annexin－V是一种35－36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白，它对PS具有较高的亲和力。
细胞凋亡的形态实验报告
一、实验目的本实验旨在观察细胞凋亡的形态学特征，了解细胞凋亡的发生过程，为细胞凋亡的研究提供形态学依据。
二、实验材料1. 细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3细胞）；2. 试剂：H2O2（双氧水）、Annexin V-FITC、PI（碘化丙啶）、RPMI-1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS缓冲液；3. 仪器：倒置显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪、超净工作台、CO2培养箱。
三、实验方法1. 细胞培养：将小鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2的CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%左右时，进行实验处理。
2. 实验分组：（1）正常组：不做任何处理，作为对照组；（2）凋亡组：加入0.8mol/L H2O2溶液处理细胞24小时。
3. 细胞染色：（1）Annexin V-FITC/PI双重染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入Annexin V-FITC和PI，室温避光孵育15分钟；（2）H.E染色：收集细胞，用PBS缓冲液洗涤2次，加入H.E染色液，室温避光孵育15分钟。
4. 细胞观察：（1）荧光显微镜观察：用荧光显微镜观察细胞凋亡形态学特征，包括细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等；（2）流式细胞仪检测：用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
5. 数据分析：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析。
四、实验结果1. 荧光显微镜观察：凋亡组细胞出现细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等形态特征，与对照组相比，凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。
2. 流式细胞仪检测：凋亡组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），约为对照组的2倍。
五、实验讨论1. 细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，具有形态学特征，如细胞膜起泡、细胞收缩、凋亡小体形成等。
本实验中，凋亡组细胞出现这些形态特征，表明细胞凋亡已发生。
2. Annexin V-FITC/PI双重染色是一种常用的细胞凋亡检测方法，可以检测细胞凋亡率。
流式测凋亡原理步骤和结果判断
流式双染测凋亡原理、步骤和结果判断一、原理：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V是一种分子量为35～36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC）标记，以标记了荧光素（FITC）的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够穿透细胞膜而使细胞核红染，所以PI主要检测坏死或中晚期调亡细胞（二者的膜都发生了破裂）。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将早期凋亡细胞和中晚期以及坏死细胞区分开来。
二、步骤：1、无菌条件下获取新鲜的肝组织，置于事先消毒好的200目不锈钢细胞筛网上，下接50ml小烧杯。
用眼科剪把组织剪成小块，眼科镊去除小血管及结缔组织，用玻璃棒轻轻研磨组织，使细胞脱落。
待研磨充分后，用5％预冷的RPMI-1640液冲洗，收集小烧杯中单细胞悬液，随后以500-1000r/min离心5min ,弃上清。
重悬、离心洗涤2次 ,以获得较纯化的肝细胞。
将肝细胞悬液取样在光镜下用血细胞计数板计数，调节细胞数目至1×106 ∕ml。
2、取1ml单细胞悬液，用预冷的PBS洗涤两次，然后加入1×结合缓冲液1ml重悬细胞。
3、取100ul加入到5ml的培养管中，加入5ulFITC标记的Annexin-V和5ul PI，混匀后室温下避光孵育15min，然后再加入400ul的1×结合缓冲液。
整个操作过程动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞。
4、反应完毕后尽快在一小时内上机检测，用FL1通道检测FITC- Annexin V荧光，FL2通道检测PI荧光。
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读
流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度。
凋亡是一种正常的细胞死亡形式，它在维持机体内细胞平衡中起着重要的调节作用。
在流式细胞凋亡结果解读中，我们通常会关注两个参数：细胞凋亡率和凋亡程度。
细胞凋亡率是指在一定细胞总数中凋亡细胞数量所占的比例。
常用的流式细胞仪会使用特定的荧光探针，如Annexin V和PI，以区分细胞的生死状态。
Annexin V可以结合在凋亡细胞表面的磷脂，而PI则能够进入已损伤的细胞。
通过流式细胞仪的检测和分析，我们可以确定细胞的凋亡率。
凋亡程度是指凋亡细胞中发生的具体变化。
在凋亡过程中，细胞会发生DNA 断裂和染色质凝固，体积也会减小。
通过流式细胞仪可以进一步评估这些变化。
例如，可以使用荧光染料如Hoechst 33342染色核酸，以观察DNA断裂。
同时，还可以使用其他荧光探针或标记特定蛋白来检测凋亡相关的分子信号途径。
通过准确评估细胞凋亡率和凋亡程度，我们可以了解细胞对于各种刺激的响应和机体内细胞死亡的调节情况。
这对于研究疾病的发生机制、药物研发以及评估治疗效果都具有重要意义。
总之，流式细胞凋亡结果解读是通过流式细胞术来评估细胞中的凋亡程度和凋亡细胞比例。
这种评估可以为我们研究细胞死亡的机制和判断治疗效果提供重要的参考。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - 凋亡细胞的 DNA 断裂片段分析
凋亡细胞的D N A断裂片段分析
实验原理
在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA 断裂片段。
核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb 的片段，最终断裂为200bp 大小的DNA 碎片。
DNA 碎片检测的方法是外源性TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。
现在可以使用APO-DIRECT Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA 断裂，造成DNA 链3’-OH 增多的情况。
在APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化DNA 单链和双链3’-OH 末端非模板依赖性的dUTP FITC 掺入反应。
由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA 碎片。
APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：
实验用品
1.一次性12⨯75mm Falcon 试管
2.蒸馏水
3.PBS 缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C 保存
4.固定液：含1%多聚甲醛的PBS 缓冲液
5. 70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECT Kit 试剂盒
9.流式上机检测。
流式细胞术在细胞凋亡检测中应用
检测究竟是如何进行的呢？一、细胞凋亡检测的意义和方法正常细胞的周期时相 细胞凋亡和周期上图为流式测定细胞凋亡图，通过PI染色来测定细胞含量。
正常的细胞的周期为第一张图中所示的G1、G0期，S期、G2/M期，那么在G1、0期前面没有亚二倍体峰，也就是M1这个位置它的含量会很低。
这是一个正常细胞的周期时相，当这个细胞发生凋亡之后，在G1G0期的前面出现了一个亚二倍体峰，我们也把它叫做凋亡峰，M1这个位置细胞数百分率明显增多，相对其他的时相，G1G0、S期和G2/M期的含量就会相对减少。
（3）获取参数通过DNA含量分析所获取的、信息包括两个参数：凋亡细胞的百分率，和细胞周期当中其它时相的百分率。
（4）方法学评价DNA含量分析方法比较简便，而且经济，在临床上用的比较多，而且标本制备也比较容易，但是它有它的缺点：只有当凋亡细胞达到一定浓度的时候才能够检测出亡峰来。
所以在早期凋亡的时候采用DNA含量分析可能是不合适的，因为可能检测不出凋亡峰，含量太少。
所以比较适合的是中晚期凋亡的检测。
另外DNA含量分析也无法获取一些信息，也就是这个凋亡到底是S期还是G2/M期，有的时候无法反应这个情况。
2.Caspase-3活性的检测（1）原理检测原理主要是由于半胱氨酰基天冬氨酸蛋白酶家族，也叫做Caspases-3的家族有一种酶：是一个重要的凋亡指示蛋白，在凋亡发生的早期就可以被激活。
该酶的活性被激活之后，就在整个凋亡过程当中不断地升高，直到凋亡的晚期酶的活性才能够迅速下降。
因此，对Caspase-3酶的连续检测可以动态地观察凋亡的整个过程。
（2）检测试剂通常检测此酶的活性的试剂包括一个荧光底物，其中它的荧光基团被激活的Caspase-3切断后可以释放荧光物质，在380nm的紫外波长下发出450nm波长的荧光，这样就可以用流式细胞仪来检测。
我们通常通过对荧光强度的检测来测定出Caspase-3的活性并进行定量分析。
但是由于它是紫外激发的检测方式，因此对于没有紫外光的流式细胞仪是无法来获取Caspase-3的活性检测信息。
PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的影响因素
基本内容
、特异性和自动化程度，从而为细胞凋亡研究提供更加可靠的工具。
谢谢观看
解决方法：熟练掌握流式细胞仪数据分析的方法和技巧，理解细胞凋亡的生 物学过程。在数据分析中，应选择经验证的参数设置，并结合研究目的进行调整。 对于结果的解读，应结合凋亡相关文献和实验数据进行综合分析，避免主观偏见。
4、数据分析与解读
总结：使用PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡时，需要注意多个影响因素。这 些因素包括PI染料的浓度和作用时间、样本处理过程、流式细胞仪的操作和维护 以及数据分析与解读等。为了获得准确的实验结果，需要对这些因素进行严格的 控制和优化。
1、PI染料的浓度和作用时间
1、PI染料的浓度和作用时间
PI（Propidium Iodide）是一种常用的细胞凋亡染色剂，可以与DNA结合并 使其发出红色荧光。然而，PI的浓度和作用时间对实验结果有很大影响。如果PI 浓度过低，则不能有效地染色细胞；而如果浓度过高，则可能导致细胞膜通透性 改变，
基本内容
结果可以以图表形式展示，如散点图、柱状图和曲线图等，以便直观地反映 细胞凋亡状态。
基本内容
总之，流式细胞术在细胞凋亡检测中具有广泛的应用价值，可以提供快速、 准确和多参数的结果。随着生物学和医学研究的不断发展，流式细胞术在细胞凋 亡检测中的应用将不断完善和拓展。未来，随着技术的进步，流式细胞术有望实 现更高的灵敏度
第二部分：双脱氧核苷酸法
与DAPI、PMA-RPN和IBF-IP等其他几种方法相比，双脱氧核苷酸法在检测细 胞凋亡方面具有较高的灵敏度和特异性。然而，双脱氧核苷酸法操作较为繁琐， 且需要使用较多的双脱氧核苷酸，可能会增加实验成本。
第三部分：聚合酶链反应法
第三部分：聚合酶链反应法
细胞生物学中的细胞凋亡检测和分析技术
细胞生物学中的细胞凋亡检测和分析技术细胞凋亡是细胞生物学中的一个重要概念，指的是受到外界刺激或内部因素导致细胞自我死亡的生理过程。
细胞凋亡检测和分析技术对于研究细胞生命周期、生物发育、癌症等多个领域都具有重要意义。
本文将介绍几种常见的细胞凋亡检测和分析技术。
1. 流式细胞术流式细胞术是一种广泛应用于生物医学研究的技术，可以同时分析大量细胞的生物学特性。
在细胞凋亡检测方面，流式细胞术可以通过荧光标记检测凋亡细胞的数量和活性。
常用的凋亡指示剂有ANNEXIN V和PI（Propidium Iodide）。
2. TUNEL（端粒末端脱氧核糖核酸酶介导的dUTP尾标记）法TUNEL法是一种能够直接检测细胞凋亡的技术。
该方法利用末端转移酶将dUTP标记于凋亡细胞的DNA断口上，并通过荧光标记展示凋亡细胞的数量和特性。
TUNEL法对于体外和组织切片等多种样品形式均适用。
3. DNA Ladder实验DNA Ladder实验是一种常用的凋亡分析方法，通过检测DNA断裂形成的DNA Ladder模式来确定细胞是否发生了凋亡。
这种方法可以通过电泳分析DNA和碱性磷酸酶染色来获得结果。
4. caspase活性检测caspase是一类重要的细胞凋亡启动酶，因此检测和分析caspase的活性是判断细胞是否凋亡的有效方法。
常见的检测方法包括荧光检测和免疫印迹法。
5. 神经胶质酸性成纤维细胞酶染色法（Nissl染色法）神经胶质酸性成纤维细胞酶（Nissl体）是神经细胞体内的一个特殊结构，被广泛应用于神经细胞凋亡检测。
Nissl染色法通过对组织切片进行染色，可以观察到凋亡细胞和正常细胞的差异。
综上所述，细胞凋亡检测和分析技术在细胞生物学的研究中具有重要地位。
不同的技术手段可以提供不同的信息，帮助研究人员深入了解细胞凋亡及其在生物体内的功能及机制。
未来随着技术的不断发展，相信细胞凋亡检测和分析技术将进一步发展和完善，为细胞生物学领域的研究提供更好的工具和方法。
流式细胞术检测细胞凋亡问题
1、Q： Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？A：可以。
因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。
Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。
2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下：（1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min（2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度）（3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。
请问这是什么原因导致的？A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。
双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。
TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA 片段化。
而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。
但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。
双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。
细胞凋亡流式实验步骤
细胞凋亡流式实验步骤
1. 细胞分离：分离被试细胞，如置于离心机中中心转速达到200 rpm，约5 分钟左右即可去除悬浮细胞上的血小板（如红细胞）。
2. 是否置于缓冲液中：将细胞置于缓冲液中，配制如下：PBS（无血清、不加钠）（50％），离心机中细胞悬液（50％）；加入另一液体（如HBSS）使其总体百分比为80％；之后将液体混合至相对稳定，之后置于离心机中细胞悬液中稀释到所需浓度（常见为1∶1 的程度）。
3. 是否加入胁迫剂：是否加入胁迫剂，加入的胁迫剂应根据实验的要求添加，如应添加的为脂质体类胁迫剂，可以考虑使用多巴胺；如果应添加的为放射线，可以考虑使用γ射线或X 射线。
4. 活性检测：活性可以用活性抑制试验（LDH）、核碎裂染色试验等探测，探究细胞凋亡后会出现多大程度的染色，从而测定凋亡程度。
5. 数据获取：流式实验完成后，将数据获取到电子数据库中，避免混淆错乱，快速查看，从而获取凋亡程度及其他信息。
流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程 - Active Caspase-3 检测细胞凋亡
A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。
凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。
PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。
Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。
包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。
实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。
Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。
在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。
凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。
2.细胞37︒C 孵育4 小时。
2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。
流式细胞仪细胞凋亡检测技术
流式细胞仪细胞凋亡检测技术一、固定细胞的染色方法1）PI单染色法方法一1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．3ml PBS洗一次。
3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。
方法二1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
2．1ml PBS/FCS洗一次。
3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。
5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。
6．400目的筛网过滤1次。
7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。
染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。
2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。
2．1％多聚甲醛低温下固定15min。
3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。
4．PBS轻洗1次5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。
6．PBS轻洗1次。
7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。
8．含0.1％Triton-X 100的PBS轻洗1次。
4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。
第五章：流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程
第五章：流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程流式检测细胞凋亡Annexin V检测细胞凋亡Annexin V (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的断裂片段分析(7)DNA实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits检测细胞增殖BrdU Flow (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡(22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3检测细胞凋亡Active (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)A n n e x i n V检测细胞凋亡实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。
实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。
2. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
3. 微量加样器和加样头。
4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
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流式细胞仪检测细胞凋亡:PI单染色法
基本原理
其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：
1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
试剂与仪器
PBS溶液；
PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。
用棕色瓶4℃避光保存。
70%乙醇
400目筛网
流式细胞仪
实验步骤
1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。
2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小时。
4. 离心弃去固定液，3mlPBS重悬5min。
5. 400目的筛网过滤1次，500—1000r/min离心5min，弃去PBS。
6. 用1ml PI染液染色，4℃避光30min。
7. 流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激光光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。
8. 结果判断：在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上，凋亡细胞与正常细胞相比，前散射光降低，而侧散射光可高可低，与细胞的类型有关；在分析PI荧光的直方图时，先用门技术排除成双或聚集的细胞以及发微弱荧光的细胞碎片，在PI荧光的直方图上，凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。
如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0，则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45，可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准，两者分别为0.35和0.7，可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是完整的细胞。
注意事项
细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。
在分析结果时应该注意。