NEB保护碱基
NEB保护碱基-各种酶切位点保护碱基
0
0
0
0
0
0
0
0
75
>90
75
>90
Nhe I
GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG
0
0
10
25
10
50
Not I
TTGCGGCCGCAA
0
0
ATTTGCGGCCGCTTTA
10
10
AAATATGCGGCCGCTATAAA
10
10
ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT
酶 Acc I Afl III Asc I Ava I BamH I Bgl II BssH II BstE II BstX I Cla I
EcoR I
PCR 设计引物时酶切位点的保护
寡核苷酸序列
GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG
CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG
0
0
0
25
0
50
75
>90
Pst I
GCTGCAGC
0
0
TGCACTGCAGTGCA
10
10
AACTGCAGAACCAATGCATTGG
>90
>90
AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA
>90
>90
CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT
0
0
Pvu I
CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA
25
90
AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA
各种酶切位点的保护碱基 引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 μg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
NEB公司提供的保护碱基序列表
Eco130I (StyI)
0
Eco147I (StuI)
0
Eco24I (BanII)
50-100
Eco31I (BsaI)
20-50
Eco32I (EcoRV)
20-50
Eco47I (AvaII)
50-100
Eco47III (AfeI) 0
Eco52I (EagI)
0-20
Eco57I (AcuI)
8 10 12
8 10 12 14
8
% Cleavage
2 hr 20 hr
10
>90
10
>90
0
50
0
50
0
0
0
25
10
50
>90 >90 >90
>90 >90 >90
0
0
>90
>90
75
>90
75
>90
0
0
CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG
10
10
25
12
10
75
XmaI
CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA
20-50
Esp3I (BsmBI)
50-100
FaqI (BsmFI)
0-20
20-50 0-20 50-100
50-100 50-100
0-20 50-100 50-100 50-100 50-100
50-100 0-20 50-100
50-100
50-100
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看
各种酶切位点的保护碱基引物设计必看酶切位点是指特定的序列，酶可以识别并在该位置切割DNA分子。
这些位点的特异性使得酶在分子生物学中广泛应用于DNA片段的定位和切割。
然而，在一些实验中，我们可能需要保护酶切位点周围的碱基，以免酶切，并且只在特定的位置引导酶切。
因此，保护碱基引物的设计对于实验的成功非常重要。
以下是保护碱基引物设计的一些建议。
首先，保护碱基引物的设计需要考虑引物的长度。
引物的长度通常为18到30个碱基，具体的长度需要根据实验的需求和酶切位点周围的序列特征来确定。
引物的长度应足够长，以确保引物和靶序列的特异性，但不应过长，以免引物形成二级结构或与非特异性位点结合。
其次，保护碱基引物的设计需要考虑引物的碱基组成。
在设计引物时，建议尽量避免引物中出现酶切位点周围的碱基序列，以防止酶的误切。
例如，如果我们希望保护酶切位点周围的AATTC序列，可以设计一个引物，其中没有AATTC序列。
同时，引物的碱基组成应尽量避免多聚核苷酸或含有GC碱基的片段，以防止引物之间的结合或引物与非特异靶序列的结合。
此外，保护碱基引物的设计需要考虑引物的特异性。
在设计引物时，建议使用特异性的引物序列，以确保引物只与目标酶切位点结合。
可以通过使用生物信息学工具，如BLAST，来验证引物的特异性。
引物的特异性还可以通过调整引物的长度和碱基组成来进一步提高。
最后，保护碱基引物的设计需要考虑引物的热力学性质。
引物的热力学性质包括引物的熔解温度（Tm值）和引物之间的配对。
引物的Tm值与引物的碱基组成、长度和引物与靶序列之间的碱基配对相关。
可以使用在线工具，如NEB的Tm计算器，来计算引物的Tm值，并对不同的引物进行比较。
此外，引物之间的配对可以通过设计引物的末端序列来调整，例如末端的碱基配对或非配对等。
总结起来，保护碱基引物的设计需要考虑引物的长度、碱基组成、特异性和热力学性质。
通过合理设计引物，可以保护酶切位点周围的碱基，并在特定位置引导酶切，为实验的成功提供有力的保障。
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切
(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A
260
核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别
, 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl
2
5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
保护碱基
首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragme nts (oligo nu cleotides))为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用r[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1卩已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl （pH , 10 mM MgCI, 5 mM DTT 及适量的NaCI或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
DNA合成，新链的延伸方向是573因此，需要在5端加上酶切位点，因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（573）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选（小虾米酶切位点分析）。
其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变DNA合成，新链的延伸方向是5T3因此，需要在5端加上酶切位点，因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform 让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（573）:保护碱基+酶切位点+原来的引物序列•。
酶切位点所加保护碱基
28
30
32
0
10
10
0
50
75
Sca I
GAGTACTC
AAAAGTACTTTT
8
12
10
75
25
75
Sma I
CCCGGG
CCCCGGGG
CCCCCGGGGG
TCCCCCGGGGGA
6
8
10
12
0
0
10
>90
10
10
50
>90
Spe I
CCGATCGG
ATCGATCGAT
TCGCGATCGCGA
8
10
12
0
10
0
0
25
10
Sac I
CGAGCTCG
8
10
10
Sac II
GCCGCGGC
TCCCCGCGGGGA
8
12
0
50
0
>90
Sal I
GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC
GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG
CCATATGG
CCCATATGGG
CGCCATATGGCG
GGGTTTCATATGAAACCC
GGAATTCCATATGGAATTCC
GGGAATTCCATATGGAATTCCC
8
10
12
18
20
22
0
0
0
0
75
75
0
0
0
0
关于保护碱基
关于保护碱基1.首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA 作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
2.添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
3.添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
NEB酶切位点保护碱基
PCR设计引物时酶切位点的保护切割率%酶 寡核苷酸序列2 hr20 hrAcc I G GTCGAC CCG GTCGAC CGCCG GTCGAC CGG 0Afl III C ACATGT GCC ACATGT GGCCC ACATGT GGG>90>90>90>90Asc I GGCGCGCCA GGCGCGCC TTT GGCGCGCC AA >90>90>90>90>90>90Ava I C CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA50>90>90>90>90>90BamH I C GGATCC GCG GGATCC CGCGC GGATCC GCG10>90>9025>90>90Bgl II C AGATCT GGA AGATCT TCGGA AGATCT TCC7525>90>90BssH II G GCGCGC CAG GCGCGC CTTTG GCGCGC CAA50>90BstE II G GGT(A/T)ACC C010BstX I AACTGCAGAA CCAATGCATTGGAAAACTGCAG CCAATGCATTGG AACTGCAGAA CCAATGCATTGG ATGCAT252550>90Cla I C ATCGAT GG ATCGAT CCC ATCGAT GGCCC ATCGAT GGG>9050>9050EcoR ICG GAATTC CG CCG GAATTC CGG >90>90>90>90Hae III GG GGCC CCAGC GGCC GCTTTGC GGCC GCAA >90>90>90>90>90>90Hind III C AAGCTT GCC AAGCTT GGCCC AAGCTT GGG1075Kpn I G GGTACC CGG GGTACC CCCGG GGTACC CCG>90>90>90>90Mlu I G ACGCGT CCG ACGCGT CG2550Nco I C CCATGG GCATG CCATGG CATG5075Nde I C CATATG GCC CATATG GGCGC CATATG GCGGGGTTT CATATG AAACCCGGAATTC CATATG GAATTCCGGGAATTC CATATG GAATTCCC7575>90>90Nhe I G GCTAGC CCG GCTAGC CGCTA GCTAGC TAG10102550Not I TT GCGGCCGC AAATTT GCGGCCGC TTTAAAATAT GCGGCCGC TATAAAATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTATAAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA10102525101090>90Nsi I TGC ATGCAT GCACCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT10>90>90>90Pac I TTAATTAAG TTAATTAA CCC TTAATTAA GG 025>90Pme IG GTTTAAAC CGG GTTTAAAC CC AGCTTT GTTTAAAC GGCGCGCCGG752550>90Pst I G CTGCAG CTGCA CTGCAG TGCAAA CTGCAG AACCAATGCATTGGAAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAACTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT10>90>9010>90>90Pvu I C CGATCG GAT CGATCG ATTCG CGATCG CGA102510Sac I C GAGCTC G1010Sac II G CCGCGG CTCC CCGCGG GGA50>90Sal I GTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGACGC GTCGAC GTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA10105075Sca I G AGTACT CAAA AGTACT TTT 10752575Sma I CCCGGGC CCCGGG GCC CCCGGG GGTCC CCCGGG GGA10>90101050>90Spe I G ACTAGT CGG ACTAGT CCCGG ACTAGT CCGCTAG ACTAGT CTAG 1010>90>905050Sph I G GCATGC CCAT GCATGC ATGACAT GCATGC ATGT102550Stu I A AGGCCT TGA AGGCCT TCAAA AGGCCT TTT >90>90>90>90>90>90Xba IGC TCTAGA GC TGC TCTAGA GCA CTAG TCTAGA CTAG >907575>90>90>90Xho I C CTCGAG GCC CTCGAG GGCCG CTCGAG CGG10102575Xma I C CCCGGG GCC CCCGGG GGCCC CCCGGG GGGTCCC CCCGGG GGGA2550>9075>90>90注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
酶切位点保护碱基表
酶切位点保护碱基表：PRC引物保护碱基的设计首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
限制性内切酶酶切位点及保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides))为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
单位的寡实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260核苷酸。
取1 µg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl,25 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
限制性内切酶酶切位点保护碱基
寡核苷酸近末端位点的酶切(CleavageClosetotheEndofDNAFragments(oligonucleotides))为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A单位的寡260核苷酸。
取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别,5 mMDTT 反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mMTris-HCl(pH7.6),10 mMMgCl2及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列首先要看目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选(小虾米酶切位点分析)。
其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变DNA合成，新链的延伸方向是5→3因此，需要在5端加上酶切位点,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来.引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 µg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核昔酸近末端位点的酶切（Cleavage Close to the End of DNA Fragments（oligonucleotides）为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核昔酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用Y[32P]ATP在T4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1 A 260单位的寡核昔酸。
取1 Q已标记了的寡核昔酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCI （pH 7.6） , 10 mM MgCI 2,5 mM DTT S适量的NaCI 或KCI （视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核昔酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
TCC CCCGGG GGA 12 >90 >90参看目录，选择共同的buffero其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37 C进行同步酶切。
但BamH I在37 C下有时表现出star活性，常用30 C单切。
切。
3. 酶切底物DNA ,切不开1 ）底物DNA±没有相应的限制酶识别位点，或酶切位点被甲基化。
常用限制性内切酶酶切位点保护残基
酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
保护碱基
首先要明确什么是保护碱基限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
添加保护碱基的目的在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。
但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。
必须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。
因此在设计PCR引物时，为保护5` 端外加的内切酶识别位点，人为地在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高酶切时的活性，使酶切完全。
其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加保护碱基的原则添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。
什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。
如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA 末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
各种酶切位点的保护碱基
各种酶切位点的保护碱基酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。
一般情况下，在酶切位点以外多出3个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。
在资料上查不到的，我们一般都随便加3个碱基做保护。
寡核苷酸近末端位点的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments(oligonucleotides)为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。
实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。
在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。
实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。
取1 µg 已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°C条件下分别反应2小时和20小时。
反应缓冲液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及适量的NaCl或KCl（视酶的具体要求而定）。
20%的PAGE（7 M尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。
本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。
若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。
2.双酶切的问题参看目录，选择共同的buffer。
其实，双酶切选哪种buffer是实验的结果，takara公司从1979年开始生产限制酶以来，做了大量的基础实验，也积累了很多经验，目录中所推荐的双酶切buffer 完全是依据具体实验结果得到的。
有共同buffer的，通常按照常规的酶切体系，在37℃进行同步酶切。
但BamH I在37℃下有时表现出star活性，常用30℃单切。
两个酶切位点相邻或没有共同buffer的，通常单切，即先做一种酶切，乙醇沉淀，再做另一种酶切。