分子生物学在兽医中的应用

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分子生物学技术在中医临床中的应用
• 在中兽医辨证施治的原则下，从分子水平寻求中药制剂疗效确切的客观依据，不仅证 实了中药的有效性，而且展现了中医药防治疾病的广阔前景。如马增春等用蛋白质组 技术考察四物汤对血虚证小鼠血清蛋白的影响，在分子水平上探讨四物汤补血的作用 机制。成玉斌等探讨了肾虚型糖尿病肾病(DN)与肾素血管紧张素转移酶(ACE)基因多 态性的相关性。虚证的主要病因之一可能是由于某些机体功能受到抑制等原因导致基 因功能普遍下降。所以在基因芯片技术中可见大规模基因下调。例如．NM一002462 人类黏液病毒(流感病毒)抵抗子l一干扰素类蛋白p78(小鼠)mRNA，该基因不但与RNA 聚合酶亚单元PB2作用，并且与流感NP作用而抑制流感病毒的转录，是嗜中性粒细胞 独立的旁分泌因子抗病毒基因。该基因表达下调：与中医理论“正气存内，邪不可干 ”有关，正常机体的防御卫外功能下降正是虚证的病机病理之一。另外虚证会导致某 些机体功能的虚性亢奋。与部分上调基因可能有关，如NM一005896IDH[，它的活性 与脂肪的生物合成相关。 吴志奎等根据中医理论，采用补肾生血对B一地中海贫血进行治疗，能明显提高地中 海贫血患者血红蛋白和抗碱血红蛋白，提高血红蛋白链比，通过BT—PCR检测，该药 物能促进珠蛋白的mRNA基因转录和表达，诱导HbF合成，从而代偿了β-珠蛋白基因缺 陷。王振义从分子生物学水平研究早幼粒细胞白血病的发病机理，运用砒霜治疗白血 病，印证了中医“以毒攻毒”的治疗方法，疗效十分理想。最近报道，半胱氨酸酶的 激活可能是砒霜诱导NamMwa细胞凋亡的机制之一。
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目前运用分子生物学技术对于脏腑辨证的研究比较多，在一定程度上揭示了这些理论的分子生物 学基础。如钟历勇等观察补肾、健脾、活血三类复方对下丘脑一垂体一肾上腺一胸腺轴(HPAT)受抑 模型的下丘脑促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)基因表达的影响，从分子水平阐明药物对阳虚证的 主要调节点。结果表明惟有补肾药可通过提高下丘脑CRF mRNA表达来保护HPAT轴免受外源性皮 质酮的抑制。
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分子生物学技术与中药鏊定
• 我国中药材资源丰富，种类繁多，过去一直采用形态学分类法来鉴定 中药材。这种建立在宏观监测水平上的方法往往不完善，尤其是动物 药及破碎中药的鉴定，这也是中药质控的难点，而蛋白质电泳法和核 酸分析法作为新的分子生物学技术正在中药鉴定中广泛应用。 • 任冰如等用RAPD技术(随机扩增多态性DNA)对南、北苍术不同居 群间的亲缘关系做了鉴定，从DNA水平上证实了南、北苍术亲缘关系 很近，差异很小，从而证实了北苍术是南苍术的变种，而非不同种。 罗志勇等m’运用AFLP技术(扩增片断长度多态性法)成功构建出多态 性丰富和重复性好的人参、西洋参指纹图谱，并运用计算机软件对结 果进行二维图象处理，计算出不同样品间相似度指数，并从相似度指 数发现西洋参与引种到我国吉林的西洋参的DNA发生一定的变异，但 变异程度小于人参与西洋参间的差异。国外学者运用各种分子标记法 对淫羊藿属、黄芪属、贝母属、栝楼属、苍术属、沙参属、紫苏属、 天南星属等药用植物进行了较为系统的研究。此外，DNA分子标记方 法还可用于中成药质量分析，如台北医学院利用RAPD标记技术成功 检出玉屏风散中的白术、黄芪和防风3味药材，台湾药物食品检测局 利用PCR技术成功鉴别出四物汤中当归和中降汤中大和当归成分。
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分子生物学技术在中药研究中的应用
• • 3．1 分子生物学技术与中药作用机理的研究 我国的中药资源丰富，具有完整的理论体系应用法则，中药中的有效成分通过多途径、多环节、多 靶点调节机体内部的动态平衡。中药多采用复方，讲究君、臣、佐、使。以求各味药之间能协同作 用。由于成分复杂，研究起来比较困难，这就要求采用分子生物学技术分离中药有效成分进行中药 现代化的研究。 1994年，Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组。化学蛋白质组学是利用化学小分子直接从功能 角度切入蛋白质组的研究，通过化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示，研究蛋白质的翻译后修 饰过程。这种研究模式为中药对机体的作用机制提供了研究平台。 分子生物学技术应用于中药药理的研究开始于中药单体的研究，集中于人参三醇皂苷、云芝多糖 等中药单体对细胞内相关因子及受体mRNA转录、基因表达上有调控作用。对于中药复方的研究尚 处于起步阶段。我国学者曾对人参、黄芪、青蒿、淫羊藿、银耳、灵芝等药物对体内重要的细胞因 子(IL—l、IL一2、IL一3、IL一6、TNF等)的基因表达调控机体的免疫反应做了探讨。曹颖英等[26 J应 用斑点杂交法研究表明，淫羊藿苷(ICA)可促进刀豆蛋白(ConA)诱导的淋巴细胞IL一3 mRNA、IL一 6 mRNA的表达，其促进作用具有一定的剂量依赖性，且它对IL一6 mRNA表达的促进作用优于IL一 3 mRNA，初步阐明了ICA促进某些细胞因子产生的分子机制。王平等研究了加味温胆汤对日本快 速老化模型鼠肝细胞核活性基因的影响，结果表明，加味温胆汤具有提高SAM—P／10鼠肝细胞核 活性基因水平、增强其转录活性的作用。
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健脾药对免疫系统有直接的促进作用，而活血药对HPAT轴无任何影响，其结论是药物 对肾阳虚证的主要调节位点在下丘脑。刘福春等通过H2一TdR掺入细胞核DNA的方法 。 发现“阳虚”动物骨髓细胞DNA合成率下降，认为中医肾主骨生髓藏精理论与促进核 酸蛋白质代谢有关。 通过对中药抗衰老作用机制的研究发现端粒长度缩短与衰老有关。端粒是线形染色 体末端的特殊结构，含有DNA’高度重复序列，随着细胞的衰老，血液及结肠黏膜细 胞中端粒的平均长度在不断减少，抗衰老中药的作用可能表现在对端粒DNA重复序列 有保护作用。而中药通过提高DNA的修复能力、清除自由基、增强神经生长因子 (NCF)受体等作用来达到抗衰老之目的。 标准化、规范化是涉及中医药科研各个领域亟待解决的难题，也是中医药现代化、 国际化的基础。要实现这一目标，引入被医学界公认为对指导临床实践、制定计划、 解释结果和临床决策具有重要价值的方法学是完全有必要的。目前对于证的研究只是 从某一角度进行了分子生物学微观阐述，但却为辨证施治提供了一条新的思路
随着中医药防治肿瘤研究的广泛与深入，疗效高、副作用小、多靶位、多环 节抗肿瘤中药的研制，将是未来肿瘤防治的希望。日本学者对小柴胡汤的研 究发现，柴胡汤水溶液能诱导肝癌细胞KIM一1和胆管细胞KMC—l凋亡。而 不影响正常细胞。另有日本学者报道，黄芪苷元能有效抑制扑拓异构酶一2的 活性和3种肝癌细胞系的增殖，并能诱导KIM一1细胞发生凋亡，诱导HuH一7 、HLF细胞坏死。孙饶鸿等采用流式细胞技术发现消瘤饮(根据益气解毒抗癌 的原则组成的治疗肿瘤中药方剂)具有明显的抑瘤作用，可促使b娃基因表达 ，诱导肿瘤细胞凋亡。
分子生物学在兽医中的应用
目录
分子生物学在中兽医中的应用
分子生物学软件在动物医学研究中的 应用
分子生物学技术在兽医领域中的应用 分子生物学技术在兽医细菌学研究中 的应用现状及前景
一：分子生物学技术在中兽医药学中的应用进展
• 中兽医学起源于中国古代，经过数千年的发展而形成了独 特的理论体系和丰富的诊疗手段，是中国历代劳动人民同 疾病进行斗争的经验总结，其主要内容包括基础理论、诊 法、中药、方剂、针灸和病证防治等部分。然而，要使中 兽医学走向世界，仅凭传统中兽医理论是不够的，必须使 之与现代医学结合，从现代医学的角度阐明中兽医辨证原 理及中兽药的作用机理，实现传统中兽医药学现代化。而 分子生物学使人类对生命现象、生物结构和功能的认识已 产生了一系列的突破，中兽医药理论与分子生物学虽然属 于两种不同的体系，但两种科学研究生命活动的物质基础 是一致的，因此，从分子水平研究中兽医药，对推动中西 兽医结合、促进中兽医药学的发展和防病治病很有意义。
分子生物学技术与中药品质改良
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由于野生药材资源日益减少，栽培品种品质退化，有效 成分含量不足以及农药残留量超标等一系列问题，给中药 材质量控制和临床应用带来了一定困扰。胡之璧引用植物 细胞培养技术进行洋地黄培养细胞的生物转化研究，筛选 出高产细胞并获得了遗传稳定性。另外，还可以应用转基 因技术开发新药。如国外报道可从转基因绵羊羊奶50％蛋 白质中提取出抗胰蛋白酶用于临床疾病的治疗。
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用细胞培养的方法研究发现，复方补益剂(四君子汤、四物汤、八珍汤、十 全大补汤)对细胞生长均有显著促进作用，而且不同补益剂对同种细胞的促生 长作用明显不同，同种补益剂对不同细胞或同种细胞的不同生长时期作用也 不完全相同。贺双腾等运用No．hem杂交检测到，加入补肾醒脑解毒复方中 药煎液后，感染神经元NGF和BDNF表达较正常海马神经元明显提高并且能持 续增加，维持潜伏感染神经元存活达lO周以上。凌云彪等[30 J利用核素掺人 试验、流式细胞术观察到，通过两种不同途径制备的中药复方“肝纤方”可 以抑制大鼠肝星状细胞(HSC)的增殖及其胶原合成。
1．3 中兽医证的研究与分子生物学技术
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证，即证候，是对疾病发展过程中某一阶段病因、病机、病性、邪正双方力量对比等方面情况的 概括，是中医的核心问题。而辨证施治就是针对证的差异，以四诊为依据，认识疾病、诊断疾病的 过程。故中医有“有诸于内必行诸于外”的说法。
中兽医中的同病异治、异病同治在分子生物学上的体现就是将同一疾病不同证候和同一证候不同 疾病的动物进行基因图谱表达，观察分析其基因突变、异常表达同疾病的关系。从中西医结合的角 度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的动态变化过程。 证研究的突破，对于解释中兽医的科学内涵，推动中医各学科的发展具有十分重要的意义。分子 生物学对于蛋白质研究的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础，在这一方面，有关蛋白质芯 片的深入研究和纳米技术的使用将为蛋白质的研究与中医证候的研究提供发展的契机。而证候一基 因组学也是中医现阶段研究的一个重要课题，将宏观的中医证候与微观的基因功能相联系。为中医 证候的现代化研究提供了新的探索路径。
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1．2脏腑学说与分子生物学技术
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脏腑学说是研究动物机体各脏腑器官的生理活动、病理变化及其相 互关系的学说。 肾藏精，主命门之火，是机体的先天之本，对机体的生长、发育、 生殖有重要影响。杨金蓉运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠，造成子鼠先 天肾气亏虚的动物模型，然后检验子鼠胸腺核酸含量，发现恐吓各组 DNA、RNA含量及RNA／DNA值均有所降低，且恐吓程度越重，降 低越明显。王米渠报道受惊吓母鼠所产子鼠大脑皮层厚度变薄，尤以 分子层明显变薄，说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长 发育。用RT—PCR技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激 素的mRNA表达受抑，将肾阳虚证定位在下丘脑。脾统血，主运化， 是机体的后天之本。王晓明等通过脾气虚证大白鼠模型LPO及其相关 抗氧化酶变化研究，提示中医认为“脾为后天之本”在生理上同分子 生物学水平的抗氧化酶活性和(含量)的正常，从而维持了生物膜的正 常功能的认识相类似，对中医“脾”的本质的现代化科学解释有一定 的学术意义。这一切都说明中医脏象学说是有分子生物学基础的。
1分子生物学技术在中兽百度文库基础理论中的应用
• • 1．1 阴阳学说与分子生物学技术 阴阳学说贯穿于中兽医学理论体系的各个方面，用以说明动物体的组织结 构、生理功能和病理变化，并指导临床诊断和治疗，是中兽医理论的高度概 括。 近几年来，我国对cAMP、cGMP与中兽医阴阳学说进行了研究。李芳生 …报道，阳虚者cAMP水平升高，cAMP／cGMP比值下降；阴虚者cGMP 水平升高，cAMP／cGMP比值升高。进一步分析cAMP、cGMP与阴虚和 阳虚的关系可知，阳虚者表现副交感神经系统活动加强；阴虚者主要表现交 感神经系统活动加强。这些研究都为推动中医理论向现代化迈进有重要意义 。 《素问·至真要大论》中说“谨察阴阳所在而调之，以平为期”，是中医临 床诊断和治疗的基本原则。与此理论相一致，分子生物学技术研究发现，正 常细胞染色体上存在非活化状态的原癌基因，同时还存在抑癌基因。如前者 激活，基因异常表达；或后者缺失而不能发挥正常细胞生长调节和终止分化 作用，就可导致肿瘤发生，这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤 发生起着重要作用。