多糖提取分离的基本流程

长期以来，天然药物化学与药理学研究工作侧重于脂溶性化学成分，如生物碱，苷类等，而对水溶性多糖类有效成分重视不够，在天然药物活性成分研究中往往将多糖作为杂质除去。近年来，国内外对多糖的研究比较活跃，其作为生物效应调节剂，主要具有抗肿瘤，抗炎，抗凝血，抗病毒，降血糖，降血脂等活性。

多糖的提取分离方法。

(一)提取

水提得到的粗多糖水溶液，加入95%乙醇使含醇量达80%，4摄氏度静置过夜，多糖析出。减压抽滤，用95%乙醇洗至上清液无色，挥干醇。

(二)除蛋白

这是至关重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在会干扰多糖的纯化。一般选用sevage法萃取或离心，多糖浓度为1mg/ml, 氯仿-正丁醇比例通常在3:1~5:1之间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一条白色的带。建议进行小试，确定最佳比例，同时确定除蛋白的次数，如果含量较多建议八次以上，含量较少的话四到五次即可。

(三)检测

除蛋白前后用紫外分光光度计检测280nm(蛋白质)和260nm(核酸)下的吸收值，多糖浓度为0.4mg/ml对照验证除蛋白的效果。需注意的是氯仿的比例不宜太大，否则可能会破坏多糖。萃取时产生的乳化现象，可用超声除去。除蛋白后的多糖水溶液会有很浓的有机试剂味道，可以用悬蒸除去。

(四)离子交换纤维素(DEAE-纤维素)进行初步分离

一般选用DE-52型离子交换纤维素

<1 >柱的预处理

加蒸馏水浸泡过夜，期间换几次水，每次除去细小颗粒，，用0.5mol/LHCl溶液浸泡1~2h, 蒸馏水漂洗至中性;再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡1~2h, 蒸馏水漂洗至中性。

<2>洗脱

样品浓度在20mg/ml左右。先用水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，小试时的梯度应密集一些，0.05, 0.1, 0.3, 0.5mol/L洗脱，每瓶8ml, 10min左右一瓶即可。根据紫外检测的结果，再进行梯度的修改。

< 3>合并流分

硫酸-蒽酮法结合紫外检测

(1)硫酸-蒽酮试剂的配制

称取0. 1g蒽酮至容量瓶中，加少量浓硫酸，搅拌使其溶解，加浓硫酸至50ml摇匀，得0.2%的硫酸-蒽酮试剂，尽量现配先用，也可放4摄氏度冷藏备用，若颜色变绿，则说明已变质不能使用。

(2)方法

馏分隔管检测，每管取0.5ml，在冰浴中加入2ml硫酸-蒽酮试剂，然后在沸水中煮10~15min, 自来水冷却，放至室温。

(3)紫外检测

主要看610nm出吸收值，合并馏分。

(五)凝胶G进一步纯化

通常采用G-100或G-200不断进行纯化

(六)纯度检测

采用高效液相凝胶柱进行检测