ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键

E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]

E L L M A N试剂测定自由巯基

试验基于的原理：

5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)

5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。

DTNBTNB2-

根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为

1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.

我们的条件可以达到这个检测限度。

ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：

1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。

2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的

吸收也不

3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。另外，TNB的分光光度法分析对SDS

很敏感[6]。

4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。在pH7.0，其降解速度为

0.02%/h，在

5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在

pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。

6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].

试验方案

主要材料：

1.材料

PEG-G-CSF批号：080229浓度4.32mg/ml

G-CSF批号：080126浓度6.9mg/ml

10k超滤膜PALL

2.试剂

SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。20ug/小

瓶。加入20ul50mMNH4HCO3，pH7.8溶解，配成1ug/ul的酶液。

1MDTT刘春凤提供

TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114

乙腈：FisherScientificLot#055848

StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-208241-

001(includingα-Cyano-4-

hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,protein

calibrationstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)

PEG肽段反相分离流动相

A液：0.1%TFA/H2O

B液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O

3.仪器

质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号

KC2007-011)

Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039）

BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）

恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003）

反相柱：S ymmetryC185um300à4.6*150mm，LotNO

高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector）

试验过程：

一、缓冲液替换

PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为

50mMNH4HCO3，pH7.8。使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用

50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。

PEG-G-CSF的浓度约6.29mg/ml，G-CSF的浓度约10.81mg/ml。

二、酶切处理

1）取37ulG-CSF,共400ug，加入125.5ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。

取63.ulPEG-G-CSF,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。

2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。另做一空白对

照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。

37℃反应，开始时间为。

三、肽段反相分离

G-CSFTrypsin+DTT反相分离

PEG-G-CSFTrypsin+DTT反相分离

收集到之间的信号峰，交由崔文喜冻干

四、ELLMAN试剂测定自由巯基

由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：

反应缓冲液：0.10M磷酸钠+0.001MEDTA，pH7.27

温度：25℃

在这些参数下，摩尔吸收光系数为14.15±0.09*103LM-cm-[9].

1)标准曲线

用反应缓冲液配制10umDTT，20umDTT，40umDTT，80umDTT，

160umDTT，320umDTT。用缓冲液配制10mM的ELLMAN试剂。准备两个

比色皿。

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收

值，吸收值调节到0.

②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品

管中，在412nm测定吸收值A

DTNB

。

③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品

管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A

final

。

④A

412nm =A

final

-（3.1/3.2）(A

DTNB

-A

buffer

),制作标准曲线。

2）样品巯基测定

①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收值，吸收值调节到0.

②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品管中，在412nm测定吸收值A

DTNB

。

③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品

管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A

final 。