噬菌体ppt-医学微生物学PPT课件
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Bacteriophage
汇报人：孙建
果马
2020年10月2日
1
1
噬菌体概述
2
噬菌体展示技术
3 细菌的检测与治疗
4
噬菌体载体
5
噬菌体转导
2020年10月2日
2
第一章 噬菌体概述
概念
简史
分类 结构
特性
2020年10月2日
3
1.1噬菌体概念
噬菌体是感染细菌、真菌、 放线菌、螺旋体等微生物的 病毒，只能在活的微生物细 胞中复制增殖。
溶菌周期
溶原周期
24
第二章 噬菌体展示技术
1985年,Smith第一次
成功地将EcoRI核酸内
切酶基因插入丝状噬菌 体基因pⅢ中,并在噬菌 体表面表达出了融合的 蛋白。
2020年10月2日
25
2.噬菌体展示技术
噬菌体
？
噬菌体展示技 术
2020年10月2日
26
2.1 噬菌体展示技术的发展
• 1988 噬菌质粒系统
根据噬菌体与宿主的关系： （1） 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能
够使宿主细胞裂解的噬菌体。 （2）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其
核酸整合到宿主的核DNA上，并且可以随宿 主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况 下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。
2020年10月2日
20
1.7 噬菌体侵染细菌实验
2020年10月2日
16
1.6 噬菌体分类
按遗传物质类型进行划分：
线状双链DNA（多数） 1.DNA噬菌体：
环状单链DNA（少数）
2.RNA噬菌体：
2020年பைடு நூலகம்0月2日
线状单链RNA（多数） 线状双链RNA（少数）17
2020年10月2日
18
1.6 噬菌体分类
2020年10月2日
19
1.6 噬菌体分类
• 2001 Automated phage display
selection
2020年10月2日
27
2.2 噬菌体展示技术的原理
以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白 的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新 组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达 有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量 富集，从而获得目的多肽或蛋白质。
2020年10月2日
13
1.6 噬菌体的分类
按照基本形态可划分为三类： 蝌蚪状（T4）、微球状（ ∮x174） 和丝状（M13）。
2020年10月2日
14
根据噬菌体结构的不同可将其分为：
1
2
3
无尾部结 构的二十
面体
2020年10月2日
有尾部结 构的二十
面体
线状体
15
1.6 噬菌体的分类
• 迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构 的二十面体，到目前为止，研究者至少对 5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数( 占96.2% )为有尾噬菌体。
确。至今仍是定量测定噬菌体浓度的有效
手段，而且为动物病毒定量滴定所借鉴，
建立了病毒空斑滴定法。
2020年10月2日
8
1.3 噬菌体的特性
1 个体微小、可通过细菌滤器 2 无细胞结构专性细胞内寄生
3
分布广泛
2020年10月2日
9
1.3 噬菌体的特性
4 裂解或不裂解细菌
5 有抗原性可刺激机体产生抗体
T7噬菌体
32
2.5 噬菌体展示技术的优点
非展示系统
展示系统
2020年10月2日
33
2.5 噬菌体展示技术的优点
• 特定分子的基因型和其表型统一在同一个 病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛 选合二为一。
• 被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的 空间结构和生物活性，以利于靶分子的识 别和结合。
• 由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分
离扩增，因此此技术又合并了选择能力和
扩增能力的优势，使得噬菌体展示技术成
为高效的筛选体系。
2020年10月2日
34
• 操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子 克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选 106～108克隆，筛选获得抗体库可以用于原 核系统表达，无需组织培养，极大地降低 了成本。
• 筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体 积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩 增等突出优点。
2020年10月2日
4
1.1噬菌体概念
2020年10月2日
噬菌体 分裂中的大肠杆菌
大肠杆菌
电镜扫描图
5
附在细菌上的噬菌体
• 噬菌体
2020年10月2日
6
1.2 噬菌体发展简史
1896年，英国细菌学家Hankin发现了水中 存在抗细菌现象，并认为有种不明物质引 起了这种现象。
1915年，英国Twort在葡萄球菌中发 现噬菌体。
1917年，加拿大人F.d，Herelle在法国巴 斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。
2020年10月2日
7
1.2 噬菌体发展简史
现象：本来混浊的菌悬液经一夜振荡培养后
反而变清。为了弄清原因，他把变清的培
养液用细菌过滤器过滤，并把滤液滴在痢
疾杆菌菌液里，奇怪的现象再次发生。他
还建立了空斑滴定法，此法简单，方便准
2020年10月2日
28
基因型
表达型
融合蛋白 PIII
Lead Hv Link Lv E
PIII
2020年10月2日
29
2.3 噬菌体展示技术流程
2020年10月2日
30
2020年10月2日
31
2.4 常用的噬菌体展示系统
常用的噬菌体展示系统
M13丝 状
噬菌体
2020年10月2日
λ噬菌 体
T4噬菌 体
烈性噬菌体侵染细菌的过程
（1）吸附 （2）注入 （3）增殖 （4）装配 （5）裂解
2020年10月2日
21
1.7 噬菌体侵染细菌实验
2020年10月2日
22
1.7 噬菌体侵染细菌实验
噬菌体的侵染实验的结果 证明了DNA是遗传物质
2020年10月2日
23
1.7 温和噬菌体与菌细胞的作用
2020年10月2日
6 能够抵抗热、低温、冰冻等
2020年10月2日
10
1.4 噬菌体结构
2020年10月2日
11
1.5 噬菌体的化学组成
核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质
蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部
2020年10月2日
12
1.5噬菌体的化学组成
• 噬菌体的一些结构蛋白
• 1990 抗体片段的展示
• 1993 展示cDNA文库
• 1994 研发了‘phage two-hybrid’技术
• 1996 首次体内in vivo 淘选试验
• 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体
• 1999 Combination of phage display
with high-density arrays
汇报人：孙建
果马
2020年10月2日
1
1
噬菌体概述
2
噬菌体展示技术
3 细菌的检测与治疗
4
噬菌体载体
5
噬菌体转导
2020年10月2日
2
第一章 噬菌体概述
概念
简史
分类 结构
特性
2020年10月2日
3
1.1噬菌体概念
噬菌体是感染细菌、真菌、 放线菌、螺旋体等微生物的 病毒，只能在活的微生物细 胞中复制增殖。
溶菌周期
溶原周期
24
第二章 噬菌体展示技术
1985年,Smith第一次
成功地将EcoRI核酸内
切酶基因插入丝状噬菌 体基因pⅢ中,并在噬菌 体表面表达出了融合的 蛋白。
2020年10月2日
25
2.噬菌体展示技术
噬菌体
？
噬菌体展示技 术
2020年10月2日
26
2.1 噬菌体展示技术的发展
• 1988 噬菌质粒系统
根据噬菌体与宿主的关系： （1） 烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能
够使宿主细胞裂解的噬菌体。 （2）温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其
核酸整合到宿主的核DNA上，并且可以随宿 主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况 下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。
2020年10月2日
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1.7 噬菌体侵染细菌实验
2020年10月2日
16
1.6 噬菌体分类
按遗传物质类型进行划分：
线状双链DNA（多数） 1.DNA噬菌体：
环状单链DNA（少数）
2.RNA噬菌体：
2020年பைடு நூலகம்0月2日
线状单链RNA（多数） 线状双链RNA（少数）17
2020年10月2日
18
1.6 噬菌体分类
2020年10月2日
19
1.6 噬菌体分类
• 2001 Automated phage display
selection
2020年10月2日
27
2.2 噬菌体展示技术的原理
以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白 的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新 组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达 有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量 富集，从而获得目的多肽或蛋白质。
2020年10月2日
13
1.6 噬菌体的分类
按照基本形态可划分为三类： 蝌蚪状（T4）、微球状（ ∮x174） 和丝状（M13）。
2020年10月2日
14
根据噬菌体结构的不同可将其分为：
1
2
3
无尾部结 构的二十
面体
2020年10月2日
有尾部结 构的二十
面体
线状体
15
1.6 噬菌体的分类
• 迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构 的二十面体，到目前为止，研究者至少对 5568种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数( 占96.2% )为有尾噬菌体。
确。至今仍是定量测定噬菌体浓度的有效
手段，而且为动物病毒定量滴定所借鉴，
建立了病毒空斑滴定法。
2020年10月2日
8
1.3 噬菌体的特性
1 个体微小、可通过细菌滤器 2 无细胞结构专性细胞内寄生
3
分布广泛
2020年10月2日
9
1.3 噬菌体的特性
4 裂解或不裂解细菌
5 有抗原性可刺激机体产生抗体
T7噬菌体
32
2.5 噬菌体展示技术的优点
非展示系统
展示系统
2020年10月2日
33
2.5 噬菌体展示技术的优点
• 特定分子的基因型和其表型统一在同一个 病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛 选合二为一。
• 被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的 空间结构和生物活性，以利于靶分子的识 别和结合。
• 由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分
离扩增，因此此技术又合并了选择能力和
扩增能力的优势，使得噬菌体展示技术成
为高效的筛选体系。
2020年10月2日
34
• 操作简单易行，该技术采用经典的PCR分子 克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选 106～108克隆，筛选获得抗体库可以用于原 核系统表达，无需组织培养，极大地降低 了成本。
• 筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体 积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩 增等突出优点。
2020年10月2日
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1.1噬菌体概念
2020年10月2日
噬菌体 分裂中的大肠杆菌
大肠杆菌
电镜扫描图
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附在细菌上的噬菌体
• 噬菌体
2020年10月2日
6
1.2 噬菌体发展简史
1896年，英国细菌学家Hankin发现了水中 存在抗细菌现象，并认为有种不明物质引 起了这种现象。
1915年，英国Twort在葡萄球菌中发 现噬菌体。
1917年，加拿大人F.d，Herelle在法国巴 斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。
2020年10月2日
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1.2 噬菌体发展简史
现象：本来混浊的菌悬液经一夜振荡培养后
反而变清。为了弄清原因，他把变清的培
养液用细菌过滤器过滤，并把滤液滴在痢
疾杆菌菌液里，奇怪的现象再次发生。他
还建立了空斑滴定法，此法简单，方便准
2020年10月2日
28
基因型
表达型
融合蛋白 PIII
Lead Hv Link Lv E
PIII
2020年10月2日
29
2.3 噬菌体展示技术流程
2020年10月2日
30
2020年10月2日
31
2.4 常用的噬菌体展示系统
常用的噬菌体展示系统
M13丝 状
噬菌体
2020年10月2日
λ噬菌 体
T4噬菌 体
烈性噬菌体侵染细菌的过程
（1）吸附 （2）注入 （3）增殖 （4）装配 （5）裂解
2020年10月2日
21
1.7 噬菌体侵染细菌实验
2020年10月2日
22
1.7 噬菌体侵染细菌实验
噬菌体的侵染实验的结果 证明了DNA是遗传物质
2020年10月2日
23
1.7 温和噬菌体与菌细胞的作用
2020年10月2日
6 能够抵抗热、低温、冰冻等
2020年10月2日
10
1.4 噬菌体结构
2020年10月2日
11
1.5 噬菌体的化学组成
核酸：头部核心，DNA或RNA 作用：噬菌体的遗传物质
蛋白质：头部外壳和尾部 作用：保护核酸 构成外壳和尾部
2020年10月2日
12
1.5噬菌体的化学组成
• 噬菌体的一些结构蛋白
• 1990 抗体片段的展示
• 1993 展示cDNA文库
• 1994 研发了‘phage two-hybrid’技术
• 1996 首次体内in vivo 淘选试验
• 1998 噬菌体展示载体作为基因导入载体
• 1999 Combination of phage display
with high-density arrays