粪便细菌学规范

粪便细菌学检验操作规范

实验室常规检查是细菌培养，沙门氏菌、志贺氏菌、邻单胞菌和气单胞菌、副溶血性弧菌、致泻性大肠杆菌作为实验室常规培养的主要腹泻病原菌。

一、标本采集与运送：

1．标本采集

（1）标本采集尽可能在发病早期和应用抗菌药物治疗之前。在不同的时间采集2~3份标本可以提高致病菌的分离率。

（2）自然排便采集粪便标本时，取有脓血、粘液、组织碎片部分的粪便1～3g。液体粪便则取絮状物，一般取1～3ml，直接装入粪便容器或保存液或运送培养基中送检。

（3）直肠拭子采集粪便标本，检查带菌者时可以采取肛拭（棉拭先用保存液或增菌培养基湿润），深入肛门内7~10cm除采样，不能及时接种时，应将标本放入保存液内。

(4)容器应清洁、带盖、广口的（不宜使用纸盒）、送检的标本中不能加入防腐剂。

2．标本运送

（1）粪便标本应尽快送检，室温条件下不能超过2h。如不能及时送检可加入pH7.0的磷酸盐甘油或转运培养基，但不宜超过24h。使用改良Cary-Blair培养基时，不能运送培养志贺氏菌的标本。

（2）直肠拭子采集的标本必须置入运送培养基或GN肉汤中送检，转运时间不宜超过2h。

（3）高度怀疑霍乱弧菌感染的标本运送必须符合特殊标本的安全要求。

（4）直肠活检标本用粪便容器送检，内盛少量无菌蒸馏水以防止沉淀。

3．标本保存

不能及时检验的标本通常4-6℃保存，用磷酸缓冲盐甘油溶液保存培养沙门氏菌和志贺氏菌的标本，保存培养弯曲杆菌和弧菌的标本，需加CaCl2(100mg/L)。

二、标本镜检

粪便标本直接镜检找到大量多核白细胞，提示侵袭性致病菌感染。如果是由肠道菌群紊乱引起的腹泻，革兰氏染色结果可以提示是酵母菌还是葡萄球菌感染。

2. 革兰氏染色

制备一张薄的粪便涂片，采用常规革兰氏染色方法。镜下观察是否有大量WBCs，成丛的革兰氏阳性球菌，酵母菌。

3.水样粪便的标本，采用悬滴法暗视野（或相差显微镜）镜检，如发现细菌呈穿梭状极活泼的运动，则考虑为弧菌感染。加入O1群霍乱弧菌诊断多价血清或O139血清，显微镜下观察若运动停止则为抑动试验阳性。

采用悬滴法镜检发现投镖式或螺旋式运动的细菌，革兰阴性弧形、S 形或螺旋形的小杆菌，提示弯曲杆菌感染。

三、细菌培养及培养基的选择

1．腹泻病原菌常规培养

对患者粪便标本进行腹泻病原菌常规培养，包括沙门氏菌、志贺氏菌、致泻性大肠杆菌、邻单胞菌、气单胞菌，致病性弧菌。此外，也包括可引起菌群失调的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和酵母菌。粪便标本至少应接种血平皿、HE（XLD或SS）、EMB（或MAC或中国兰）等培养基。沿海地区还需增加TCBS琼脂培养基。

补充说明：

（1）SS培养基对部分志贺氏菌有抑制作用。

（2）常用的肠道选择性培养基（如SS等）对气单胞菌、邻单胞菌有抑制作用，初次分离时应接种血平皿和MAC。

（3）若用EMB（伊红美兰）、MAC（麦康凯）等培养基培养后，未检出常见致病菌，但感染性腹泻症状明显，可重新采集粪便标本接种GN 肉汤，35℃培养4-6h，再转种HE（肠道琼脂）等培养基，进一步分离培养。

（4）如怀疑沙门氏菌感染，可先用SF肉汤（亚硒酸盐增军液），以提高检出率。

（5）正常人体肠道内可以存在金黄色葡萄球菌，因此只有每克粪便细菌数达到105CFU时才有临床意义。

（6）气单胞菌能够在常规的鉴别培养基如MAC和EMB上生长，但选择性培养基更有助于检出气单胞菌。选择性培养基：每10ml的BAP（血琼脂平板）培养基加入10mg氨苄西林（BAP-AMP）。（7）邻单胞菌可以在一些常规鉴别培养基如MAC或HE生长，但

选择性培养基更有助于检出邻单胞菌。选择性培养基：IBB琼脂（肌醇-亮绿-胆盐琼脂）。

2．腹泻病原菌的增菌培养

早期培养物传代培养后使用增菌肉汤培养，能提高低数量菌的检出率。常用增菌液有：

GN肉汤：用于沙门氏菌和志贺氏菌的增菌培养，严格保证培养4-6h 后即进行传代。

SF肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，经36℃培养24h后，接种鉴别培养基进行分离培养。

TT肉汤：主要用于沙门氏菌的增菌培养，但不包括伤寒沙门氏菌和副伤寒沙门氏菌，培养12h后尽快传代。

碱性蛋白胨水：主要用于弧菌增菌，35-37℃培养5-8h后，传代到TCBS平板上培养。

四、培养物鉴定

1、志贺氏菌的鉴定

志贺氏菌属包括4个种即痢疾志贺氏菌（S.dysenteriae）、福氏志贺氏菌（S.flexneri）、鲍氏志贺氏菌（S.boydii）、宋内氏志贺氏菌（S.sonnei）。志贺氏菌血清学分群分为A、B、C、D四群。目前，A群含有15个血清型，B群含有8个血清型（前5个血清型又进一步分为11个亚型），C群含有19个血清型，D群只含有1个血清型。对于肠道培养基上可疑为志贺氏菌的菌落，首选鉴定试验：赖氨酸脱羧酶试验、动力试验、葡萄糖产气试验、粘液酸盐试验、克氏柠檬酸

盐试验、乙酸盐实验。志贺氏菌上述这7个试验均为阴性。志贺氏菌还必须进行血清学鉴定，可使用玻片凝集方法。但对于生化试验符合志贺氏菌而血清凝集试验弱阳性或不凝集时，应制备生理盐水菌悬液，100℃水溶15~30min，冷却后观察自凝现象，如果自凝试验阴性，再进一步使用抗血清做凝集试验。

2、沙门氏菌的鉴定

沙门氏菌种及其亚种鉴定

沙门氏菌属在含有乳糖的鉴别培养基经36℃培养18-24h后，其菌落一般为无色透明或半透明，中等大或叫较小，边缘整齐、光滑，稍呈隆起。多数沙门氏菌因产生硫化氢，在SS、HE培养基上可形成中心带黑色或墨绿色的菌落。

生化反应鉴定为沙门氏菌或志贺氏菌的菌株还要进行血清学鉴定确定菌体抗原（O抗原）。沙门氏菌和志贺氏菌都应进一步进行血清学和全面生化鉴定。

3、弯曲杆菌的鉴定

培养24-48h后检查弯曲杆菌的特征性菌落：有扁平的、能扩散的、可以弥漫整个平板表面的菌落；有很小的、凸起的、半透明的菌落。颜色可为灰色、黄色或粉红色。氧化酶试验阳性。

取可疑形态菌落进行革兰氏染色。由于常规革兰氏染色时弯曲杆菌不易着色，可用蕃红或石炭酸复红染液染片3min。最适于弯曲杆菌的染色方法是用0.1% 的碱性复红染液染片3min。显微镜下观察弯曲杆菌是小的、轻度弯曲的G—杆菌，呈“S”型或海鸥型。