生物发光检测

相 对 光 单 位
三、ATP生物发光法的食品应用研究
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食品微生物检测:与传统微生物检测方法相比，ATP生
物发光法具有简便、灵敏、快速等优点，小型化的测试仪器便 于随身携带，非常适合现场卫生监测。在现场使用，可迅速发 现可能存在的污染环节，及时采取措施，从而尽可能避免产品 和资金的浪费。
2 可以用于食品、饮品及空气卫生检测中细菌总数的现场测定。 用于卫生监督,口岸监察及企业自检。
发光生物
有许多微小甲壳动物和腔肠动物，在 被惊动时会发出闪光。有一些动物虽 然自己不闪光，但把荧光素和荧光素 酶分泌入水中，让它们相互作用，产 生光雾，掩护自己逃走。 但后来在好多鱼类、鱿鱼类和甲壳类 中，也都找到了这种腔肠动物型的荧 光素。 多年前，科学家已经将生物萤光应用 到生命科学领域。与化学荧光 （fluorescence）相比，生物萤光 （bioluminescence）更灵敏、更 可信、效果更好。
●ATP生物发光法检测微生物，需要先将微 生物体内的ATP提取出来，测量其发光值， ●对照由标准ATP试剂测量所得发光值和 ATP的浓度标准曲线，根据发光值得到ATP 的浓度，最后转化为微生物的浓度。
1、试剂与仪器
主要试剂： 荧光素/荧光素酶试剂 标准ATP试剂 缓冲液 ATP提取剂 主要仪器： TD-20/20荧光光度计 抽滤器及真空泵 pH计
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
检测原理
各生长期的微生物均有较恒定水平的ATP含 量，微生物死亡后，ATP将很快被分解掉, 因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测 出ATP含量后，即可推算出样品中的含菌 量，整个过程仅为几分钟。 优点: 由于生物发光法无需培养微生物过 程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可 得到检测结果，具有其他微生物检测方法无 可比拟的优势，是目前检测微生物最快的方 法之一。
第五讲 ATP生物发光检测技术
自然界有很多发光生物体
真菌、甲虫、蠕虫、海星，等等，还有我们 最熟悉的萤火虫 海洋中有好几千种发光生物。深夜，在海中 游泳或岸边漫步时，都会看到海上的“磷光” 现象。这往往是大群甲藻——一种单细胞浮 游生物——受到机械干扰后留下的道道光痕 它们几乎对任一种刺激，如海水中化学成份 的波动、压力突变、超声波和激光刺激等 等，都会有闪光反应, 大多海洋生物都靠荧光 素——荧光素酶系统发光 . 不同的荧光素——荧光素酶反应产生不同的 光
海肾荧光素酶
2、ATP的提取
1)在测量微生物的ATP前，需要将ATP从微生 物内提取出来，ATP的提取效率直接影响生 物量测定结果。因此，ATP的提取也就成为 ATP生物发光法测定生物量的重要步骤之一。 2)提取方法:TCA(三氯醋酸)法和加热煮沸法提 取ATP。
3、 ATP的检测
1)先用标准ATP试剂作一条标准曲线。测量得到样品 的相对发光值. 2)测定样品发光值,与标准曲线对比，得到样品中的 ATP含量, ATP含量可以转化为微生物的浓度. 3)测量荧光所用的仪器: TD-20/20荧光光度计 。
AT P 生 物发光法是利用ATP与虫荧光素一虫荧光素酶反应， 产生光子，再用荧光照度计检测发光值，从而得到ATP的量.
海肾荧光素酶海肾荧光素酶(Renilla luciferase)催化的发光反应， 具有很好的浓度线性范围，酶的检测灵敏度达到10-18 mol。
二、ATP生物发光法检测过程
食品细菌快速测定仪
量程范围 0--107cfu/ml 检出时间 : 小于5分钟，
所得试验结果90%以上与标准培养 法所得结果一致。精确度和重复性也 和培养法测定菌落总数相差无几
萤光素酶做报告基因
报告基因是研究基因调控的有力工具，利用萤光素 酶做报告基因的基本的研究方法，是将一段待研究 的DNA序列这段序列——可以是启动子、增强子 或具有潜在调节功能的一段DNA序列——克隆在 一个含有萤光素酶基因的载体上 再将这个载体转染真核细胞，经过一段时间的培养 和不同的外界刺激后，收获细胞并将细胞裂解，然 后测量细胞裂解物的萤光强度。 通过与对照组（未经外界刺激的）细胞裂解物萤光 强度的比较，确定这一段DNA序列的调节功能 （即：启动子功能，增强子功能， 等等）。 萤火虫萤光素酶作为报告基因:因为该蛋白不需要 翻译后加工，所以一旦翻译立即产生报告活性
一 ATP生物发光法检测原理
ATP生物发光技术的原理是荧光素酶（Lu ciferase）以荧光素（Luciferin）、 三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg2＋ 存在时，能将化学能转化为光能。 ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又 是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素 酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范 围内，其浓度与发光强度呈线性关系。