分光光度法测定红细胞渗透脆性

生理学实验设计

————分光光度法测定红细胞渗透脆性

分光光度法测定红细胞渗透脆性

红细胞膜，有人称为鬼影(ghost)，是一种由磷脂、非酰化的胆固醇和糖蛋白等组成膜脂质和主体、膜蛋白质(转运蛋白和表面抗原)与周围膜蛋白质(膜骨架中的收缩蛋白和肌动蛋白以及膜骨架依靠的锚蛋白)所组成。这些成分要保证红细胞在120天寿命内50，000次通过“急流旋涡”仍能生存；要控制Na+和K+在细胞内的浓度，任何导致K+漏出增高超过Na+的漏入，均会导致细胞内单价阳离子和水分的丢失。这些生理功能的完善与否，可用简单且明白的膜渗透脆性试验来了解。

传统的测定方法采用目测观察其溶血情况，观察需要静置几个小时且过程中不能晃动。此法仅能观察到溶血的大致情况，不能量化红细胞破裂的程度。本实验采用分光光度法精确测定红细胞在低渗氯化钠溶液中的溶血情况，本实验操作简单、准确可靠、时间短，能消除常规目测观察的主观误差。

【实验原理】

正常红细胞悬浮于等渗的血浆中，若置于高渗溶液内，则红细胞会因失水而皱缩；反之，置于低渗溶液内，则水进入红细胞，使红细胞膨胀。如环境渗透压继续下降，红细胞会因继续膨胀而破裂，释放血红蛋白，称之为溶血。红细胞对低渗溶液有一定的抵抗力，这一特征称为红细胞的渗透脆性。

【实验目的】

1、理解细胞外渗透压对维持细胞正常形态和功能的重要性。

2、掌握红细胞渗透脆性的实验原理。

3、采用分光光度法精确测定红细胞在低渗氯化钠溶液中的溶血情况。

【实验材料】

1、仪器与试剂

LDZ4-0.8离心机、722S可见分光光度计、维生素C注射液0.5g/ml、桔梗煎剂0.16g/ml、20％氨基甲酸乙酯、肝素（1000U、ml）。

2、动物

家兔，体重（2.5±0.5）kg，雌雄兼用。

【实验操作】

1、不同浓度低渗氯化钠溶液的配置

取口径相同、清洁干净的小试管做好编号，制成不同浓度的低渗盐溶液，每管总量为2.5ml，第14管为蒸馏水。

具体见表一。

Tab 1 Preparation of different concentrations of hypotonic NaCl solution

试管编号1％氯化钠（ml）蒸馏水（ml）氯化钠浓度（％）

1 1.7 0.8 0.68

2 1.6 0.9 0.64

3 1.5 1.0 0.60

4 1.4 1.1 0.56

5 1.3 1.2 0.52

6 1.2 1.3 0.48

7 1.1 1.4 0.44

8 1.0 1.5 0.40

9 0.9 1.6 0.36

10 0.8 1.7 0.32

11 0.7 1.8 0.28

12 0.6 1.9 0.24

13 2.25 0.25 0.90

14 0 2.5 0

2、最大吸收波长的测定

取14管加入0.1毫升血液，轻轻颠倒混匀5分钟，3000r/min 离心10分钟，取上清液至比色皿中，以13管为空白对照，在722S 可见分光光度计上扫描，测得其最大吸收波长为535nm。

3、红细胞在不同浓度低渗氯化钠溶液中溶血率的测定

用20％氨基甲酸乙酯0.75--1.0g/kg麻醉家兔后注射肝素。从耳缘静脉取血，依次向14支试管内各加0.1毫升血液，轻轻颠倒混匀5分钟，置入干燥离心管中以3000r/min离心10分钟，取上清液在光度计545nm波长处检测。用13管生理盐水的上清液调零，测其他每管吸光度，分别计算出1到12管的溶血率：溶血率＝样品吸光

度÷最大溶血吸光度×100％。

4、桔梗煎剂、维生素C对红细胞渗透脆性的影响

取血方法同上，依次向14支试管内各加0.1毫升血液后，用加样器加入50微升桔梗煎剂或者维生素C，用上述相同方法分别测定各管溶血率。

5、统计结果

计算出每管平均溶血率，与目测法的结果进行比较。

【实验预期结果】

1、不同浓度低渗氯化钠溶液对红细胞渗透脆性的影响

常规目测法1—6管内红细胞肉眼观察无溶血，测其溶血率在9％以下，表明溶血程度很低；7—9管内红细胞肉眼观察部分溶血，测其溶血率在30％—67％，表明有部分溶血；9—12管内红细胞肉眼观察完全溶血，结果见表二。溶血率的测量结果与目测法观察结果一致。

2、桔梗煎剂、维生素C对红细胞渗透脆性的影响

在加入桔梗煎剂后家兔红细胞对低渗溶液抵抗力降低，0.68％—0.24%NaCl溶液内红细胞的溶血率均在89%—99%，溶血程度很高，说

明红细胞大多破裂溶解。在加入维生素C后家兔红细胞对低渗溶液抵抗力增大，0.68％—0.24%NaCl溶液内红细胞的溶血率1%—30%，溶血程度较低，说明红细胞破裂明显减少，见图一。

Fig 1 effect of campanulaceae decoction and vitamin C on red blood cell osmotic fragility 【实验讨论】

红细胞对低渗盐溶液具有一定的抵抗力，其大小可用氯化钠溶液浓度来表示。将血液加入不同浓度的低渗氯化钠溶液中后，开始出现溶血现象的溶液浓度为该血液红细胞最小抵抗力，出现完全溶血现象的溶液浓度为该红细胞的最大抵抗力。前者代表最大脆性，后者代表最小脆性。本实验采用分光光度计测量法代替肉眼观察法，通过计算溶血率分析了家兔红细胞在不同渗透压的渗透脆性，以量化指标客观地判断溶血情况。选择545nm波长为入射光，此处波长吸光系数高，测定的灵敏度高。此外，在加样中，改用微量加样器加样，加样准确。

正常红细胞为双凹盘形，在低渗盐水中吸水膨胀的适应性大(可增加70％的体积而不破裂)，遗传性球形红细胞增多症(HS)等红细胞的S／V比率小，对低渗盐水的适应性小(脆性大)，所以红细胞渗透跪性试验是检测HS最有用的方法，当红细胞混悬于不同浓度的NaCl 低渗溶液时，正常红细胞于O．4％一0．44％NaCl浓度时开始溶血，于o．32％一O．36％NaCl浓度时完全溶血。HS病人的红细胞大多于0．50％一0．75％NaCl时开始溶血，于0．4％NaCl浓度时完全溶血，患者红细胞渗透脆性试验与正常对照组相比提高0.04％(NaCl液)以上即为阳性，还可见于遗传性椭圆形红细胞增多症，某些伴有球形红细胞增多的自身免疫性溶血性贫血。