在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中双酚A等4种内分泌干扰物

DOI :10.11895/j.issn.0253-3820.140892
在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法
测定乳制品中双酚A 等4种内分泌干扰物
张品1,2 张晶1,2 陈洁君3 段鹤君2 邵兵*1,2
1
(首都医科大学公共卫生学院,北京100058)2(北京市预防医学研究中心,食物中毒诊断溯源技术北京重点实验室,北京100013)3(中国生物技术发展中心,北京100039)
摘 要 建立了乳制品中三氯生㊁三氯卡班㊁双酚A 和壬基酚4种内分泌干扰物的在线固相萃取超高压液相色谱-串联质谱(On-line SPE LC-MS /MS)检测方法㊂液态乳制品或奶粉样品中加入乙酸缓冲液,目标物经β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶酶解后,用乙腈提取,冷冻离心10min 后,取上清液,用水稀释,在线固相萃取串联质谱法测定㊂样品溶液经Xbridge C 8柱富集,BEH C 18色谱柱分离,甲醇和水梯度洗脱,三重四极杆质谱电喷雾负离子模式下采集数据,同位素内标法定量㊂4种目标化合物的线性范围为0.005~5.0μg /L,相关系数R 2>0.99;方法的定量限为0.03~1.0μg /kg,3个添加水平的平均加标回收率为80.2％~106.7％,RSD<15％㊂本方法快速㊁简单㊁灵敏度高,适用于乳制品中4种内分泌干扰物的同时检测㊂应用本方法对原料乳和北京市售液奶样品进行了分析,结果表明,壬基酚的检出率最高㊂
关键词 乳制品;三氯生;双酚A;壬基酚;在线固相萃取;液相色谱-串联质谱
2014-09-24收稿;2014-10-07接受本文系质检总局公益性行业科研专项(No.2012104003-03)和国家自然科学基金(No.21177014)资助项目*E-mail:shaobingch@
1 引 言
环境内分泌干扰物也称为环境激素,是能够干扰生物体内分泌系统的外源性化学物质㊂流行病学研究显示,某些动物和人类的生殖发育系统和行为异常以及肿瘤发生率上升,与环境内分泌干扰物有关㊂三氯生(Triclosan,TCS)与三氯卡班(Triclocarban,TCC)作为广谱的抗菌剂,广泛用于沐浴露㊁牙膏等日用品中㊂已有的研究表明,TCS 会影响蝌蚪时期甲状腺激素相关基因的表达[1],能够降低雄性大鼠的精子数量与激素水平[2];TCC 可协同增强雌二醇和睾酮的生物活性[3,4]㊂这些潜在的内分泌干扰效应引发了公众对TCS 危害人体健康影响的担忧㊂双酚A(Bisphenol A,BPA)和壬基酚(Nonylphenol,
NP)是广受关注的酚类内分泌干扰物,具有弱雌激素效应[5~8]㊂食品中的内分泌干扰物的污染问题是当前的研究热点之一㊂由于使用的广泛性及较高的亲脂性,NP 和BPA 被发现在水产品㊁肉制品㊁乳制品及谷物等多种食物中广泛存在[9~11],三氯生在母乳中的检出率也很高[12]㊂为了满足食品中相关物质检测的需要,许多分析方法相继建立起来,包括气相色谱质谱法[13]㊁高效液相色谱法[14]㊁液相色谱串联质谱法[15~17]㊂气相色谱质谱法通常需要衍生化,步骤繁琐;液相色谱法灵敏度较低,不适合复杂基质中的痕量污染物检测㊂此外,这些方法多采用液/液萃取或离线固相萃取技术对食品中的目标物进行富集和净化,会耗费大量有机溶剂,且操作较为复杂,耗时费力㊂
在线固相萃取技术是近年来发展起来的全自动样品处理技术,在饮用水检测领域应用较多㊂本研究利用双三元超高压液相色谱,实现了乳制品中TCS㊁TCC㊁NP 和BPA 4种内分泌干扰物的同时在线固相萃取,结合三重四极杆串联质谱建立了原料乳㊁奶粉等样品中目标物的痕量检测方法㊂
2 实验部分
2.1 仪器和试剂Ultimate TM 3000UHPLC 双三元超高压液相色谱系统(配备DGP 3600M 双三元梯度泵㊁SRD 3600溶第42卷
2014年12月 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第12期1811~1817
剂架和内置脱气机㊁TCC23200柱温箱,两个6通阀㊁3000RS 进样器㊁变色龙色谱软件,美国Dionex 公司);Xevo TM TQ-S 三重四极杆串联质谱仪(美国Waters 公司);AL204-IC 天平(瑞士Mettler Toledo 公司);X-22R 台式冷冻离心机(美国Beckman 公司)㊂
HP XBridge TM C 8柱(30mm ˑ2.1mm,10μm),ACQUITY UPLC TM HSS T3柱(50mm ˑ2.1mm,
1.8μm),BEH C 18色谱柱(50mmˑ
2.1mm,1.7μm),色谱柱均购自美国Waters 公司㊂甲醇㊁乙腈(LC-MS 级,Sigma 公司);β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶溶液(β-Glucuronidase /aryl-sulfatase,瑞士罗氏公司);乙酸和无水乙酸钠(优级纯,国药集团化学试剂有限公司);双酚A(98.5％,德国Dr.Ehrenstorfer 公司);壬基酚(4-NP,日本TCI 公司);同位素内标BPA-d 4和4-n-NP-d 4(纯度均大于97.8％,加拿大CDN 公司);三氯生(TCS,99.5％,德国Dr.Ehrenstorfer 公司)和三氯卡班(TCC,
99％,加拿大TRC 公司);TCS-13C 12和TCC-13C 6(99％,英国剑桥同位素实验室)㊂2.2 标准溶液的配制分别准确称取10mg 标准品,置于10mL 容量瓶中,用甲醇定容,配制成1000mg /L 的标准储备液,
于-20ħ保存㊂临用时用20％甲醇稀释上述标准溶液,配制成不同浓度的标准工作液,4ħ保存㊂
2.3 样品前处理称取液态奶样品2.0g,奶粉样品1.0g 于50mL 玻璃离心管中,加入2mL 乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 5.2)和50μL β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶,于37ħ水浴摇床中酶解6h㊂加入5mL 乙腈涡旋30s,超声提取20min,然后于4ħ㊁3000r /min 离心10min,取0.2mL 上清液于进样瓶中,加入0.8mL 水混匀后待测㊂
实验中所用的器具均为玻璃材质,使用前在马弗炉中400ħ烘烤4h㊂每10个样品做1个溶剂空白㊂每一批样品做3个过程空白㊂2.4 色谱质谱条件
超高压液相色谱富集柱:HP XBridge TM C 8柱(30mmˑ2.1mm,10μm );分析柱:ACQUITY UPLC TM BEH C 18(50mmˑ2.1mm,1.7μm);柱温:40ħ;两套泵系统的流动相相同:A 相为甲醇,B 相为水;梯度洗脱程序如表1所示;进样量100μL㊂该部分由变色龙色谱软件控制,富集柱和分析柱开始串联时,软件发送信号,触发质谱系统进入数据采集状态㊂
表1 双三元液相色谱流动相梯度条件Table 1 Mobile phase gradient of online-SPE liquid chromatography
时间Time (min)富集泵SPE pump 流速Flow rate (mL /min)A (％)B (％)分析泵Analytical pump 流速Flow rate (mL /min)A (％)B (％)曲线Curve 阀位置Position 0.00 2.0020.080.00.3035.065.01-22.00 2.0020.080.00.3090.010.051-24.000.5020.080.00.3090.010.056-15.000.5050.050.00.3090.010.056-15.10 2.00100.00.00.30100.00.056-17.00
2.00100.00.00.30100.00.056-17.10 2.0020.080.00.3035.065.051-212.00 2.0020.080.00.3035.065.051-2 质谱部分由Waters 公司的Masslynx 软件控制㊂离子源:电喷雾离子源,负离子模式(ESI -);毛细管电压:2.0kV;离子源温度:150ħ;脱溶剂温度:400ħ;脱溶剂气流量:1000L /h;锥孔气流量:50L /h㊂碰撞室压力:0.9ˑ10-2Pa;MRM 模式采集数据,各目标物质谱参数见表2㊂3 结果与讨论
3.1 仪器条件的优化3.1.1 分析柱的选择 由于TCS,TCC,NP 和BPA 均具有一定的亲脂性,且前三者的亲脂性较强,因此2181 分析化学第42卷
表2 4种目标化合物及其内标物的质谱检测条件Table 2 MS /MS acquisition parameters for 4target compounds and related internal standards 化合物Compound 保留时间Retention time (min)
监测离子对Ion transition (m /z )锥孔电压Cone voltage (V)碰撞能量Collision energy (eV)Triclosan,TCS 2.88
287>35*289>35201012Triclocarbon,TCC 2.79
313>160*313>126301420Bisphenol A,BPA 2.05
227>212*227>13302618Nonyphenol,NP 3.31219>133*219>147352520TCS-13
C 12 2.90299>35*2012TCC-13C 6 2.78319>160*3014BPA-d 4 2.04231>216*30204-n -NP-d 4
3.78223>110*3520*定量离子(Quantification ion)㊂考虑使用反相色谱柱进行分离,为了避免系统压力过高,这里均使用50mm 短柱,对比了BEH C 18和HSS T3两种色谱柱㊂使用5μg /L 的混合标准溶液在表1分析泵的流动相条件下进行分析,发现4种物质在C 18柱上峰形良好,而在使用HSS T3柱时,BPA 的色谱峰展宽较为明显:使用C 18柱为0.19min,T3柱时为0.35min㊂推测原因为T3柱填料键合相的比例低于C 18柱,使得极性较强的BPA 扩散所致㊂
因此,选择BEH C 18柱作为分析柱㊂3.1.2 液相条件的优化 双三元超高压液相色谱可通过两套泵系统及六通阀的转换实现样品在萃取柱和分析柱上的传送,自动完成固相萃取的上样㊁淋洗和洗脱3个过程,达到样品的在线净化浓缩的目的㊂淋洗条件和洗脱条件的优化是本方法的关键,本实验中对淋洗液和洗脱时间进行了优化㊂淋洗液中加入一定量的有机溶剂能够改善淋洗效果,在此比较了10％甲醇-水和20％甲醇-水和30％甲醇-水,发现30％甲醇-水淋洗4min 时BPA 损失严重,平均回收率仅为24％,其余3种物质的回收率高于85％;10％甲醇-水和20％甲醇-水作为洗脱溶液时未发现目标物流出,因此选择20％甲醇水作为淋洗溶液,淋洗时间为4min㊂洗脱步骤中的转载时间直接关系到方法的回收率,本实验以5.0μg /L 20％甲醇-水配制的混合标准溶液为上样溶液,考察了不同转载时间对目标物回收率的影响㊂当转载时间为2min 时,NP 的回收率低于30％,这是由于保留最强的NP 未能完全洗脱的缘故,其它3种目标化合物为55％~78％;将转载时间增加为3min,所有物质回收率在84％~109％之间,继续延长则对回收率无改善㊂因此,为了保障回收效果,最终转载时间选用3min㊂
3.2 提取条件的优化环境污染物或药物进入生物体后在肝脏酶系统的作用下会转化成葡糖糖醛酸结合态㊂Zhou 等[18]发现人体尿液中的三氯卡班及其代谢产物主要以结合态形式存在,尽管奶样中是否存在结合态还未有定论[19,20],但为了保证检测结果的准确性,本研究采用β-葡糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶进行酶解㊂由于4种目标化合物均有一定的亲脂性,因此,酶解后的样品提取过程比较了乙腈和甲醇两种与水互溶的极性有机溶剂㊂称取适量液奶样品,加标量为5μg /kg,如2.3节所述进行处理,每种提取溶剂做3个平行㊂离心后提取液直接测定,从表观上看,乙腈提取液比甲醇提取液更清澈透明㊂结果表明,乙腈提取液对TCS,TCC,NP 和BPA 的绝对回收率分别为95％,89％,91％和78％,比甲醇体系略高(分别为90％,85％,92％和69％)㊂综合表观结果和回收率数据,确定乙腈为提取溶剂㊂
3.3 背景污染的考察由于TCS,NP 和BPA 广泛应用于多个领域,因此这几种污染物在环境中普遍存在,甚至在Milpore 的超纯水中检测到了BPA [21]㊂而且,塑料器皿或橡胶制品等都会迁移出大量NP 和BPA,这些均会对分析结果造成干扰㊂由于离线固相萃取小柱的筛板为聚丙烯等塑料材质,有机溶剂浸润时会持续溶出NP,其浓度大于0.2μg /L [17];使用二氯甲烷㊁正己烷等非极性有机溶剂进行液液萃取时,其背景污染的3181第12期张品等:在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中4种内分泌干扰物
水平视溶剂体积㊁纯度㊁批号及浓缩方式有所不同,以10mL 的农残级二氯甲烷为例(挥干后1mL 甲醇定容测定),旋转蒸发至干时NP 的背景污染水平约为0.15μg /L,若使用氮气吹干,背景污染水平则高达1.0μg /L㊂
本实验所用实验器具均为玻璃材质,液相色谱管路为聚四氟乙烯,在线固相萃取柱为不锈钢柱,所有溶剂均为LC-MS 级㊂过程空白中TCC 的背景污染水平低于0.005μg /L,其余3种物质TCS㊁NP 和BPA 均低于0.05μg /L,且较稳定㊂该结果明显低于离线固相萃取㊁液液萃取等方法所致的背景污染㊂究其原因,本方法前处理方法步骤简单,可引入污染的环节少;溶剂耗费量低,减少了实验试剂可能的污
染;本方法的自动化程度高,使得背景污染稳定性高㊂
3.4 线性范围和定量限配制TCS,NP 和BPA 的质量浓度均为0.05,0.10,0.20,0.50,1.0,2.0和5.0μg /L 的系列混合标准工作液,内标浓度均为0.4μg /L;TCC 的浓度为其它3种物质的1/10,即0.005,0.010,0.020,0.050,0.10,0.20和0.50μg /L㊁内标浓度为0.04μg /L㊂以目标组分峰面积与相应内标峰面积的比值Y 对相应浓度X (μg /L)进行线性回归,4种目标化合物在相应的线性范围内相关系数(R 2)均大于0.99㊂以加标样品中待测化合物色谱峰的信噪比等于3(S /N =3)对应的浓度为方法的检出限(LOD),S /N =10对应的浓度为方法的定量限(LOQ)㊂最终确定液态奶样品中TCS,NP 和BPA 的LOQ 为0.5μg /kg,LOD 为0.2μg /kg;TCC 的LOQ 为0.03μg /kg,LOD 为0.01μg /kg㊂奶粉样品中的TCS,NP 和BPA 的LOQ
为1.0μg /kg,LOD 为0.3μg /kg;TCC 的LOQ 为0.10μg /kg,LOD 为0.04μg /kg㊂
3.5 方法的回收率和精密度选取30份原料乳及液态奶样品,采用本实验室前期所建方法[17]进行初筛,所得阴性样本用于方法学评价㊂在阴性原料乳和奶粉两种基质中添加不同量的混合标准溶液,液态奶中TCS,NP 和BPA 的加标水平分别为1.0,2.0和5.0μg /kg,TCC 的加标水平分别为0.1,0.2和0.5μg /kg;奶粉的加标水平为液奶的2倍,每个水平设6个平行㊂按上述条件进行处理和测定,内标法计算4种内分泌干扰物质的回
收率和相对标准偏差(RSD)㊂结果见表3,原料乳样品的回收率为81.5％~106.7％,相对标准偏差为2.6％~14.0％;奶粉样品的回收率为80.2％~101.3％,相对标准偏差为1.0％~13.6％;此外,选择市场上常见的液态奶产品,如全脂奶㊁低脂奶㊁酸奶㊁优酸乳饮料,进一步开展了方法确证,加标浓度为中间浓度,每种基质设6个平行㊂结果表明,4种目标化合物在几种液奶产品中的回收率在80％~110％之间,相对标准偏差小于20％㊂
表3 原料乳和奶粉中4种目标化合物的回收率和相对标准偏差(n =6)Table 3 Recoveries and RSDs of 4target compounds in raw milk and infant formula (n =6)化合物Compounds 原料乳Raw milk
加标水平Spiked (μg /kg)回收率Recovery (％)
RSD (％)奶粉Infant formula 加标水平Spiked (μg /kg)回收率Recovery (％)RSD (％)TCS TCC NP BPA
1.085.01
2.2 2.085.0 5.72.0101.69.5 4.092.41
3.65.0106.7 2.610.090.7 5.50.182.51
4.00.280.27.00.291.68.50.488.5
5.50.590.4 2.6 1.08
6.0 1.01.083.1 4.2 2.083.8 5.72.090.59.6 4.089.1
7.25.087.39.110.092.910.51.081.5
8.7 2.080.68.72.08
9.99.1 4.0101.3 3.65.084.27.310.099.3 2.83.6 实际样品的检测
应用本方法对20份原料乳和21份液态奶产品样品进行了检测㊂原料乳由某品牌乳业公司提供,4181 分析化学第42卷
液态奶产品购自当地超市,包括全脂奶㊁高钙奶㊁低脂奶㊁脱脂奶㊁舒化奶㊁酸奶㊁果粒酸奶㊁乳饮料等㊂图1给出了标准溶液㊁过程空白样品和1份液奶产品的色谱图㊂20份原料乳样品中有1份检出了BPA,含量为0.54μg /kg;3份检出了NP,含量为0.5~2.66μg /kg㊂21份奶粉样品中有4份检出BPA,含量为0.50~1.20μg /kg,15份检出了NP,含量为0.60~62.4μg /kg㊂由于液奶产品中NP 的检出浓度和检出率均显著高于原料乳,推测前者的NP 主要是由于加工工艺和辅料引入的㊂此外,所有样品均未检出TCS 和TCC㊂
目前尚无食品中BPA㊁NP 等物质的限量标准,但欧洲食品安全管理局(EFSA)规定BPA 的每日耐受限量(Tolerable daily intake,TDI)为5μg /kg (bw /day)[22],丹麦环境保护署推荐NP 的TDI 同为5μg /kg(bw /day)[23]㊂基于本文检测结果计算所得北京市成年人通过液态奶产品暴露BPA 和NP 的量
在1μg /kg(bw /day)以下,低于上述机构推荐的安全限值㊂但考虑到乳制品仅是目标化合物的暴露途径之一,且BPA 在低剂量长期作用时也可能引发雌激素效应,因此,食品基质的环境内分泌干扰物质仍应引起相关部门重视㊂
本研究采用凝胶渗透色谱液相色谱质谱方法[17]对液态奶产品中的BPA 和NP 存在水平进行了复核,结果表明,两种检测手段所得数据无显著性差异㊂进一步说明超高压液相色谱串联质谱法适用于液态奶等乳制品中4种目标化合物的检测
㊂图1 过程空白样品(A),标准溶液(TCC 的浓度为0.05μg /L,BPA,NP 和TCS 为0.5μg /L)(B)和阳性牛奶样品(C)Fig.1 LC-MS chromatograms of the target compounds as well as the internal standards in different samples (A:procedural blank sample;B:standard solution,in which the concentration of TCC is 0.05μg /L,while BPA,NP and TCS are 0.5μg /L;C:a positive sample,pure milk)5181第12期张品等:在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中4种内分泌干扰物
6181分析化学第42卷References
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ZHANG Pin 1,2,ZHANG Jing 1,2,CHEN Jie-Jun 3,DUAN He-Jun 2,SHAO Bing *1,2
1
(School of Public Health ,Capital Medical University ,Beijing 100058,China )2(Beijing Key Laboratory of Diagrostic and Traceability Technologies Food Poisoning ,Beijing Centers for Preventive Medical Research ,Beijing 100013,China )
3(China National Center for Biotechnology Development ,Beijing 100038,China )
Abstract A simple analytical method by means of on-line solid phase extraction followed liquid chromatography-tandem mass spectrometry (SPE-LC-MS /MS)was developed for the simultaneous quantitation of 4endocrine disruptors (triclosan,triclocarban,bisphenol A and nonylphenol)in dairy products.Infant formula and milk samples were dissolved in acetic acid buffer and hydrolyzed by β-glucuronidase /arylsulfatase.Acetonitrile was used as the extract.Then,the mixture was freeze-centrifuged for 10min and the supernatant was diluted with water,and analyzed via on-line SPE-LC-MS /MS.The sample extracts were concentrated by an Xbridge C8cartridge and separated on a BEH C 18column with a gradient mobile phase of methanol and water;then analyzed by triple quadrupole mass spectrometry.Mass acquisition was conducted under negative electrospray ionization mode.Quantification was performed by isotopic internal standard calibration.Acceptable linearity (R 2>0.99)was achieved over the range of 0.005-5.0μg /L,with limits of quantification of 0.03-1.0μg /kg.Average recoveries of four target compounds (spiked at three concentration levels)ranged from 80.2％-106.7％,with relative standard deviation less than 15％.Due to its rapidity,simplicity,and high sensitivity,the method is suitable for the analysis of endocrine disruptors in dairy products.It has been applied in the analysis of raw milk and milk products collected in Beijing.As a result,nonylphenol was found with a high detectable frequency.
Keywords Dairy products;Triclosan;Bisphenol A;Nonylphenol;On-line solid phase extraction liquid
chromatography-tandem mass spectrometry (Received 24September 2014;accepted 7October 2014)This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21177014)
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181第12期张品等:在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中4种内分泌干扰物
在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中
双酚A等4种内分泌干扰物
作者：张品， 张晶， 陈洁君， 段鹤君， 邵兵， ZHANG Pin， ZHANG Jing， CHEN Jie-Jun ， DUAN He-Jun， SHAO Bing
作者单位：张品,张晶,邵兵,ZHANG Pin,ZHANG Jing,SHAO Bing(首都医科大学公共卫生学院，北京100058; 北京市预防医学研究中心，食物中毒诊断溯源技术北京重点实验室，北京
100013)， 陈洁君,CHEN Jie-Jun(中国生物技术发展中心,北京,100039)， 段鹤君
,DUAN He-Jun(北京市预防医学研究中心，食物中毒诊断溯源技术北京重点实验室，北
京100013)
刊名：
分析化学
英文刊名：Chinese Journal of Analytical Chemistry
年，卷(期)：2014(12)
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引用本文格式：张品.张晶.陈洁君.段鹤君.邵兵.ZHANG Pin.ZHANG Jing.CHEN Jie-Jun.DUAN He-Jun.SHAO Bing在线固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳制品中双酚A等4种内分泌干扰物[期刊论文]-分析化学 2014(12)。