色谱柱常见问题及答案(二)

11、关于色谱柱的填装问题！我个人认为现在色谱柱的填装一般有3种情况：1.国外生产填

料并填装完成成品卖到国内；2.国外生产填料，国内填装销售；3.国内生产填料，国内填装

销售。一般情况下，第1种情况卖的最贵，也质量最好！可是我就不明白了：如果是填料的

生产很复杂的话，那么填装上国内也跟不上去吗？为什么换在国内填装就会出现或多或少的

一些小问题呢？

答：国内填装会出现质量小问题，和国内目前普遍做事没有国外严谨有关吧。如果工艺技术

上没有问题，又能制订并切实执行一整套严格的生产质量管理措施，国内填装和国外填装并

无区别。

12、国产色谱柱在市场上占有比例如何啊？

答：国内色谱柱市场还没有人进行过科学统计，连一年色谱柱销售总量也众说纷云，更别说

国内生产色谱柱所占份额了。我估计是占30%左右吧。

13、预柱或保护柱用还是不用的问题！原来分析中药品种时，我一直都是用保护柱。但来到

新公司后，发现大家都没有使用，几个实验室连保护柱都没找到一个，也就是说大家从来都

没有用过。后来问一个老员工，说是有可能影响药品分析。我就想问：安装保护柱后会影响

样品分析吗？我们做的大多是头孢类的抗生素。

答：应该这样说，加上保护柱，肯定有利于保护色谱柱不受一些颗粒物质的堵塞，肯定有害

于分离度和柱效，因为保护柱中间有着死体积的存在但是如果保护柱接得好，并且尽量控制

其匹配性和经常更换，分离度和柱效应该影响并不大。

头孢类的抗生素也要看到底是原料药还是制剂喽，有些原料药，可以根据色谱柱的损耗选择

添加预柱（中间是个筛板），制剂的话，如果有辅料严重干扰或者流动相盐分比较大，那还

是最好配个保护柱。

14、用的是四元梯度泵 A50%甲醇 B50%水经常出现停或进气泡这是什么原因？

答：水/甲醇比例在55：45时，黏度和柱压有个极大值。50：50接近了这个极值，柱压是比

较高的，但影响柱压最大的还是填料粒径和色谱柱内径，你这个实例中不知用的什么规格的

色谱柱？系统压力高，可能会因溶剂泵中的过滤头供液速度跟不上而导致气泡进入系统，停

机也应该是因为气泡进入压力下降的原因，可考虑更换液体通量更大的过滤头。

15、填料方法的前三种都是湿法吗，能不能对四种填充方法做一个简短的说明？

资料显示：在正常条件下，填料粒度＞20µm时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜20µm时，湿法填充较为理想。填充方法一般有4种①高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；②径向加压法，Waters专利；③轴向加压法，主要用于装填大直径柱；④干法。柱填充

的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。为什么以20um为分界点？

16、想请您具体说明一下反冲色谱柱的方法，是不连检测器吗？

答：反冲就是将柱子反向连到系统中。因为有污染物反冲出来，当然不连检测器，出液端直

接接到废液瓶就可以。

17、如果不使用不锈钢接头，而改用ＰＥＥＫ头，是否可以完全解决接头匹配问题？

答：色谱柱接头其实大都不是色谱柱厂商自己生产的，供货商有多个，VICI，Upchurch，Parker等，他们的标准相互之间不统一，那色谱柱接头的标准就统一不起来。不过一般这个

问题也不难解决的，换个接头就可以了，而且现在有了万用接头，可以配所有不同类型的柱头，不泄露，连接死体积又很小。

18、有的厂商为避免堵塞，使用了较大孔径（2-5um）的前筛板，这种情况反冲会将填料冲出。那么，你们在使用说明书中会说明前后筛板的孔径吗？

答：如果前后筛板孔径不对称，厂商肯定也会在说明书里特别提到的。

19、我在做多肽药物时遇到下列问题：1）. 基线不稳定波动大，流动相 A ：1％TFA水溶液B:1％TFA乙腈溶液检测波长210nm 流速1.0ml/ml 什么原因？怎么解决？TFA有什么作用？

流动相中不加TFA见不到主峰，基线良好。2）做完肽类样品时怎么冲洗C18比较好；3）药典上介绍测定分子量大于2000的样品，选择柱子填料的孔径为30nm，30nm与10nm对结果

有什么区别？

答：应该是起“离子对”的作用吧。在做多肽类样品的时候，300A孔径的填料相对100A孔径

肯定要选择性好点，也就是分离度相对比较好点。流动相加入TFA，在反相色谱分离多肽和

蛋白质的实验中，使用三氟乙酸 (TFA) 作为离子对试剂是常见的手段。流动相中的三氟乙酸

通过与疏水键合相和残留的极性表面以多种模式相互作用，来改善峰形、克服峰展宽和拖尾

问题。

三氟乙酸优于其他离子修饰剂的原因是它容易挥发，可以方便地从制备样品中除去。另一方面，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于 200nm ，对多肽在低波长处的检测干扰很小。

20、waters AtlantisC18柱可以用较高比例的流动相，那麽用完后应该怎麽清洗？在什麽体系

中保存比教合适？

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗维护：

流动相中不含缓冲盐

分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min

流动相中含有缓冲盐

分析完成后，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向冲洗45min，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向冲洗色谱柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌，使用

时间不可超过3天）；

水性柱保存体系也不特别：短期保存在所用的流动相中（不含缓冲盐），中长期保存在纯甲

醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中。