高效液相色谱分析方法的建立PPT课件
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高效液相色谱法 PPT课件
①固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极 性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等 应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有 有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论 （solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理： 朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号 （吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点： 灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性 范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品， 应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样 气相流动相 液相流动相 气相柱温 液相柱温
气体、 容易转
气体、 常用氢气 液体、 、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节 高效液相色谱法的主 要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography） 吸附色谱法（adsorption chromatography） 离子交换色谱法（IEC） 空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故 选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
高效液相色谱分析法.ppt
3.固定相及分离柱
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱 的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
二、分离类型选择
choice of separation types
三、 HPLC的应用
application of HPLC
影响分离的因素与操作条件的选择 一、影响分离的因素
factors influenced separation
1.
•
影响分离的因素与提高柱效的途径
在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一， H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。
则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳> 环己烷>己烷>煤油(最小)
电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
五、 离子对色谱(Ion pair chromatography)
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（ 对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏 水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢 氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对 离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有 对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入 流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
高效液相色谱分析ppt课件
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性
2019/7/7
2019/7/7
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/7/7
2019/7/7
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
2019/7/7
与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
2019/7/7
2019/7/7
影响色谱峰扩展及分离的因素
• 基本概念及基础理论同气相色谱：保留值、分 配系数、分配比、分离度、选择性因子(分离 因子)、塔板理论及速率理论。
• 由于流动相的差别，对色谱过程必然产生影响。
2019/7/7
2019/7/7
二、液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使 用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；
sm
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗
忽略固定相传质阻抗
HPLC：H A Cm u Csm u
dp 2 Cm Csm Dm
dp 2 C
Dm
T Dm
dp C H ，n 柱效
Dm H ，n 柱效 T Dm C ，但易产生气泡 T Dm ， ，柱阻
3. 经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
2019/7/7
与GC相比，流动相差别
GC：流动相为惰性气体 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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2、样品情况 样品的复杂情况：HPLC适用于复杂样品的分析，
如中药分析、环境分析、体内药 物分析、临床药物分析等。
HPLC方法建立的前期工作
样品情况的了解：
样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中 间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等） …… 样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响） ，从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方 法的确立设计一个大致的方向。
文献查阅时应注意的基本内容
液相色谱实验所需的基本参数 样品预处理方案 对照品（标准品）的配制方法 流动相：种类及配比，等度或梯度？ 固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称 色谱分析条件。
，开创了应用吸附原理分离植物色素 的新方法。
1906年正式命名
色谱法；Chromatography
30年代开始广泛研究和应用
主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家 M. S. Tswett
正式命名“色谱”的文献中的一段话
什么情况下使用HPLC？
一般情况下HPLC不是分析方法的首选
分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）： 滴定分析（原料药、制剂定量分析） 紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析） 薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析） HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的
检查；复杂样品定量分析等）
什么情况下使用HPLC？
1、对分析结果、测定速度和效率的要求 准确度要求：准确定量（RSD<5％） 测定速度和效率：快速，单一或多组分测定。
在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平， 并高速发展。
HPLC的基本配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
手动/自动 进样器
色谱泵
检测器
废液
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 泵系统 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱的发明人——茨维特（M. S. Tswett）
俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理
反相高效液相色谱（RP-HPLC） 分析方法的建立
什么是色谱？
色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离 方法（工具、手段）。
除色谱之外，经典（常见）的分离方法： 蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等
色谱
是一种高效能 的分离方法
色谱分析
以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基 础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析 方法。
什么是高效液相色谱法？
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法 的高效能分析方法： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度、高选择性的检测器……
广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样 品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。
富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测 限。
进行样品预处理的必要性
样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。 虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力，但
待测成分的性质：极性、水溶性、脂溶性、酸碱性 等
对方法的建立，有重要的指导意义。
样品情况的了解：
待测成分的结构特征： 对色谱柱的选择具有一定的指导意义（不是很明
显）； 对检测器的选择具有指导意义， 如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别
是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器 待测成分的含量：
决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限） 决定对检测器灵敏度的要求
查阅有关的文献资料
文献资料——无：
结合样品的情况，首先应作一些试探性的工
作。 （见后面）
评价高效液相色谱方法的标准
只有更好，没有最好！
问题：什么样的分离结果是好的？ 答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财 力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析 速度等）。
评价液相色谱方法的标准
理论塔板数n ：分离效率（柱效）的量度
n 100
tR与W 是一对矛盾，tR/W 可以很好地表达 这对矛盾的情况。
影响柱效的因素很多，可以从色谱理
论进行分析，如塔板理论、速率理论等， 具体内容参见有关教科书或专著。
评价液相色谱方法的标准 什么是色谱的分离度
tR1
tR2
分离度的公式：
R tR2 tR1
1 2
(W2
W1
)
R：分离程度的量度 简称分离度
素也都要考虑：
灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗
成本 容易使用（简单） 色谱柱寿命
根据评价液相色谱方法的标准， 进行试探性工作
文献资料查询——无 根据评价液相色谱方法的标准，结合样品的情
况，作一些试探性的工作
一、根据了解的样品信息以及分析目的， 建立样品预处理方案
色谱分析样品预处理的主要目的
将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于 分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效 （指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定 等。
影响分离度的因素：k、α及n
分离度方程：
Rk2k 2 11
n 4
k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料
之间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份容量因子
的相对大小。 α ＝ k2/ k1
n是理论塔板数，描述组分被保留的程度以及
色谱峰谱带展宽的程度
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
除分离度之外，在设计色谱方法时，以下几个因
理论塔板数计算公式：
n
16
tR
2
W
n
5.54
tR Wh/2
2
理论塔板数n ：描述组分被保留的程度以及色谱 峰谱带展宽的程度。
塔板数越大，柱效越高。
tR = 5
W = .5
n
16
t R
2
W
W= 2
n 16 t R 2 W
n
16
5
2
.5
n 16 5 2 2
n的数量以及性质相似程度： 单一成分的测定，最简单，随着测定成分的增
加，分析的难度增加； 组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。
问题：组分性质的相差越大，分析的难度越低，是否 越有利于多组分分析？
查阅有关的文献资料
文献资料——有： 在文献的基础上，调整、改善。
不排除在文献基础上全面创新。
如中药分析、环境分析、体内药 物分析、临床药物分析等。
HPLC方法建立的前期工作
样品情况的了解：
样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中 间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等） …… 样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响） ，从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方 法的确立设计一个大致的方向。
文献查阅时应注意的基本内容
液相色谱实验所需的基本参数 样品预处理方案 对照品（标准品）的配制方法 流动相：种类及配比，等度或梯度？ 固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称 色谱分析条件。
，开创了应用吸附原理分离植物色素 的新方法。
1906年正式命名
色谱法；Chromatography
30年代开始广泛研究和应用
主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家 M. S. Tswett
正式命名“色谱”的文献中的一段话
什么情况下使用HPLC？
一般情况下HPLC不是分析方法的首选
分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）： 滴定分析（原料药、制剂定量分析） 紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析） 薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析） HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的
检查；复杂样品定量分析等）
什么情况下使用HPLC？
1、对分析结果、测定速度和效率的要求 准确度要求：准确定量（RSD<5％） 测定速度和效率：快速，单一或多组分测定。
在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平， 并高速发展。
HPLC的基本配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
手动/自动 进样器
色谱泵
检测器
废液
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 泵系统 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱的发明人——茨维特（M. S. Tswett）
俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理
反相高效液相色谱（RP-HPLC） 分析方法的建立
什么是色谱？
色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离 方法（工具、手段）。
除色谱之外，经典（常见）的分离方法： 蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等
色谱
是一种高效能 的分离方法
色谱分析
以一定的科学理论为基础，在高效能的分离基 础上，结合先进的检测方法而建立的现代分析 方法。
什么是高效液相色谱法？
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法 的高效能分析方法： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度、高选择性的检测器……
广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样 品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。
富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测 限。
进行样品预处理的必要性
样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。 虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力，但
待测成分的性质：极性、水溶性、脂溶性、酸碱性 等
对方法的建立，有重要的指导意义。
样品情况的了解：
待测成分的结构特征： 对色谱柱的选择具有一定的指导意义（不是很明
显）； 对检测器的选择具有指导意义， 如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别
是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器 待测成分的含量：
决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限） 决定对检测器灵敏度的要求
查阅有关的文献资料
文献资料——无：
结合样品的情况，首先应作一些试探性的工
作。 （见后面）
评价高效液相色谱方法的标准
只有更好，没有最好！
问题：什么样的分离结果是好的？ 答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财 力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析 速度等）。
评价液相色谱方法的标准
理论塔板数n ：分离效率（柱效）的量度
n 100
tR与W 是一对矛盾，tR/W 可以很好地表达 这对矛盾的情况。
影响柱效的因素很多，可以从色谱理
论进行分析，如塔板理论、速率理论等， 具体内容参见有关教科书或专著。
评价液相色谱方法的标准 什么是色谱的分离度
tR1
tR2
分离度的公式：
R tR2 tR1
1 2
(W2
W1
)
R：分离程度的量度 简称分离度
素也都要考虑：
灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗
成本 容易使用（简单） 色谱柱寿命
根据评价液相色谱方法的标准， 进行试探性工作
文献资料查询——无 根据评价液相色谱方法的标准，结合样品的情
况，作一些试探性的工作
一、根据了解的样品信息以及分析目的， 建立样品预处理方案
色谱分析样品预处理的主要目的
将待测物质有效地从样品基质中释放出来，制成便于 分析测定的稳定液体试样。如：中草药或中成药有效 （指标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定 等。
影响分离度的因素：k、α及n
分离度方程：
Rk2k 2 11
n 4
k 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料
之间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份容量因子
的相对大小。 α ＝ k2/ k1
n是理论塔板数，描述组分被保留的程度以及
色谱峰谱带展宽的程度
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
除分离度之外，在设计色谱方法时，以下几个因
理论塔板数计算公式：
n
16
tR
2
W
n
5.54
tR Wh/2
2
理论塔板数n ：描述组分被保留的程度以及色谱 峰谱带展宽的程度。
塔板数越大，柱效越高。
tR = 5
W = .5
n
16
t R
2
W
W= 2
n 16 t R 2 W
n
16
5
2
.5
n 16 5 2 2
n的数量以及性质相似程度： 单一成分的测定，最简单，随着测定成分的增
加，分析的难度增加； 组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。
问题：组分性质的相差越大，分析的难度越低，是否 越有利于多组分分析？
查阅有关的文献资料
文献资料——有： 在文献的基础上，调整、改善。
不排除在文献基础上全面创新。