基因工程学习资料

识别序列的结构
回纹结构(palindromic sequence) 或旋转对称或二重互补对称
识别序列可以以5’→3’ 走向的单链DNA表示： 5‘-ABCC’B’A’-3’
限制酶识别序列的特殊情况
间断对称：对称轴之间含若干任意碱基
♦ 有些识别序列呈间断对称： AlwN I CA GNNNC↓TG GT↑CNNNG AC ♦ 有些识别序列完全不对称： AccBS I CCG↓CTC GGC↑GAG C↓TNA G G ANT↑C
2.1.10 限制性核酸内切酶的星活性
• 星活性（star activity）： 指限制性内切酶在非标准条件下，对与识 别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出 现非特异性的DNA片段的现象。 • 易产生星活性的内切酶用*标记。 • 引起星活性的原因： （1）DNA纯度不够 含有DMSO、乙醇等 （2）高甘油浓度：>5% （3）酶量 /DNA的比值高 >100U/μl （4）盐浓度偏低 <25mmol/L （5） pH过高 >8 （6）其它二价阳离子代替Mg离子
H.O.Smith and D.Nathans(1973)年提议的命名系统 • 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母的略 语表示寄主菌的物种名。 如：Escherichia coli 用Eco表示。 • 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，如：EcoR。 • 以罗马字母表示同一菌株中不同的限制和修饰体系。如： EcoRI 和EcoRV （EcoR I, EcoR V)。 • 例：Hind III 表示为从流感嗜血菌Rd 菌株（Haemophilus influenzae Rd）中分离到的第三种限制性内切酶。
Dra III
Ear I
同裂酶（isoschizomer)
• 指来源不同但具有相同识别序列的一类限制酶，但其切割位点可能不同。 • 可分为如下几种情况： 1 ） 同 序 同 切 酶 ， 如 BamH I 和 BstY I 具 有 相 同 的 识 别 切 割 位 点 G↓GATCC； 2）同序异切酶，如Kpn I（GGTAC↓C）和Acc65 I（G↓GTACC）； 3 ） 识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶识别序列，如 EcoR I （ G↓AATTC ）和 Apo I （ R↓AATTY ）、 Sal I （ G↓TCGAC ）和 Acc I （GT↓MKAC）、Hinc II（GTY↓RAC）。
指限制性内切酶在双链DNA上能够 识别的特殊核苷酸序列。 • 专一 • 通常4～6/8个特定的核苷酸对组成。
限制性内切酶的识别序列
• 识别序列出现的概率： 1/4n（n＝识别序列核苷酸组成的数目）。 识别序列为4bp,则每隔256（ 44 ）bp会出 现一个识别位点。 识别序列为6bp，则每隔4096（ 46 ）bp会 出现一个识别位点。 • 稀切酶： 指识别序列长和识别序列富含GC或富含AT 的限制性核酸内切酶。 • 有的限制性内切酶可识别两种以上序列。
2.1 限制性核酸内切酶
2.1.1 限制与修饰 2.1.2 限制性核酸内切酶的发现与命名 2.1.3 限制性核酸内切酶的类型 2.1.4 限制性内切酶的识别序列 2.1.5 限制性内切酶的切割位点 2.1.6 限制性内切酶的切割方式 2.1.7 DNA末端长度对限制性酶切的影响 2.1.8 位点偏爱 2.1.9 酶切反应条件 2.1.10 星活性 2.1.11 酶切注意事项 2.1.12 限制酶酶切位点的引入
第二章 分子克隆的工具酶
2.1 限制性核酸内切酶 2.2 聚合酶 2.3 DNA连接酶 2.4 其它分子克隆工具酶
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2.1 限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease) “分子剪刀”或
• 是一类能识别双链DNA 中特殊核苷酸序列，并 使每条链的一个磷酸二 酯键断开的内脱氧核糖 核酸酶。 • 是生物细胞内限制性修 饰系统的一部分，防止 外源DNA的入侵。 “分子手术刀”
2.1.9.3 酶量
• 根据酶的活性和DNA底物的量、反应时间而定。 限制性核酸内切酶活性单位定义： 在最适反应条件下，60分钟内完全切割1μg λDNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） • 容积活性： U/ μl • 与DNA分子上识别位点的密度、位点偏爱有关： 密度大用酶量多；密度小用酶量少。 • 常用酶量：酶和底物比例为2~10U/ μgDNA
Sau3A I ↓GATC CTAG↑ Bcg I ↓10(N)CGA(N)6TGC(N)12↓ ↑12(N)CGA(N)6ACG(N)10↑
TspR I
NNCAC(G)TGNN↓ ↑NNGTG(C)ACNN
2.1.6 限制性内切酶的切割方式
• 交错切割（staggered cut）: DNA双链断开的位置对称地分布在识别序 列中心位置的两侧，使切割后的DNA末端为单 链突出的末端。 黏性末端；非对称突出末端 • 平切割（blunt cut） ： DNA双链断开的位置处在识别序列的对称 中心，使切割后的DNA末端为平齐的平末端。
BamH I 识别序列：G↓GATCC Bgl II 识别序列： A↓GATCT
2.1.7 DNA末端长度对限制性酶切的影响 • DNA上识别序列的侧面序列：大多数限制 性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸不具 催化活性，识别位点两侧至少要有一定数 量的核苷酸，才能被有效切割。 • 不同酶对末端长度的要求不同
• 1968年，首次从大肠杆菌K中分离到限制 酶，没有特定的切割位点（I型） • 1970年，美国的H. Smith首先在流感嗜血 杆菌中发现了第一个限制性内切酶（Hind II） • 2006年2月，共发现了3773种限制酶，其中 商业化的限制酶有609种。
2.1.2 限制性核酸内切酶的发现与命名
• 设计PCR引物在末端引入酶切位点，为了保证 PCR扩增片段顺利切割，应在设计引物末端加上 满足要求的碱基数目。一般在引物末端加3～4个 碱基能满足常规酶切的要求 • 双酶切多克隆位点时选择酶切秩序 CTCGAG GAATTC CTGCAG Xho I EcoR I Pst I 97％ 1 37％ 1 100％ 88％ 1
2.1.9.4 底物DNA
• DNA的纯度：高。不含蛋白质、酚、氯仿、 酒精、EDTA、SDS等。 • DNA的浓度：适量。 • DNA分子构型：线性DNA切割效率>超螺 旋质粒DNA和环状病毒DNA。 • DNA上识别序列的侧面序列 • 甲基化程度：识别序列中的核苷酸被甲 基化会影响限制性内切酶的切割效率。
具有相同的识别序列和切割位点， 但来源菌不同，甲基化敏感程度 , 作用条件以及酶活性可能不同。
同尾酶（isocaudamer）
• 指来源不同，识别序列可能不同，但可以产生相同黏性末 端的限制性内切酶。如Spe I（A↓CTAGT）、Nhe I （G↓CTAGC）和Xba I（T↓CTAGA）。 • 一组同尾酶切割产生的粘性末端可进行互补连接。 • 两个同尾酶形成的黏性末端连接之后，一般连接处不能够 再被其任何一种同尾酶识别。
3’黏性末端
5’黏性末端
平末端
只有一个碱基突出 的黏性末端（识别 序列核苷酸为奇数）
限制酶切割非对称识别序列产生 非对称的突出末端
BbvC I Acc I
CC↓TCAGC GGAGT↑CG GT↓MKAC CAKM↑TG CACNNN↓GTG GTG↑NNNCAC CTCTTCN↓ GAGAAGNNNN↑
教材p17表2－2
三亚基双功能
二亚基双功能
不需ATP
非对称
回文结构
非对称
REBASE(The Restriction Database), 由NEB(New England Biolabs)公司维护(http://rebase.neb.com)。
2.1.4 限制性内切酶的识别序列
• 识别序列：
• 通用缓冲液 • 双酶切缓冲液的选择
2.1.9.2 反应温度和时间
• 大多数限制酶的反应温度为370C。 • 个别特殊的内切酶则需要在300C 、500C、600C或650C 的温度下进行切割。 • 反应时间：一般在适宜的缓冲液和温度条件下，每微克 DNA用5U的酶，保温1~2小时。时间延长，则酶用量可 相应减少。 • 终止反应：加入EDTA、加热65、80度处理20min处理 或者用苯酚抽提、试剂盒纯化、电泳分离。
Dde I
↓
BssS I CTCGTG ↑ GAGCAC
♦ 有些限制酶既可识别对称序列，也可识别非对称序列： Acc I GT↓A(C)G(T)AC CAT(G)C(A)↑TG
2.1.5 限制性内切酶的切割位点
• 切割位点：DNA在限制性核酸内切酶的作用下，两条链断开
的位置。产生带3'-OH和5'-P的DNA产物。 • 一般在识别序列的内部或两侧附近。以↓或 ⁄ 表示。 • 环状DNA分子上某个限制性内切酶有n识别位点，完全切割得 到n个DNA片段。线性DNA分子，则会得到n+1个DNA片段。 大多数限制酶在识别序列内部切割，但也有少数在外部切割：
限制酶切割回文序列 产生粘性末端
平切割产生平末端
黏性末端 和平末端
• 黏性末端 (cohesive terminus/sticky ends)： DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一 个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这 样的DNA末端，称为黏性末端。 • 3’黏性末端： 3’ 突出的黏性末端（DNA末端的3’端 比5 ’长） • 5 ’黏性末端： 5’ 突出的黏性末端（DNA末端的5’端 比3 ’长） • 平末端（blunt ends）：DNA片段的末端是平齐的。
2.1.9.1 反应缓冲液
• • • • • pH 7.5~8.0 at 37°C Tris-HCl or Tris-HAc MgCl2 or MgAc2 10mmol/L 二硫基苏糖醇(DTT) or β-巯基乙醇 1 mmol/L 牛血清白蛋白(BSA) 100μg/ml NaCl 100mmol/L; 50mmol/L; 0mmol/L KAc
1 1
教材p15表2－1
核酸内切限制酶EcoRI及修饰的甲基化酶MEcoRI的限制与修饰作用
生物体内，甲基化是最常 见的修饰作用，甲基化酶 与限制酶二者对应并同时 存在。甲基化酶与对应的 限制酶识别相同的序列， 但其作用不是切割，而是 在两条链上对某个碱基进 行甲基化。
2.1.2 限制性核酸内切酶的发现与命名
2.1.8 位点偏爱 (site preference)
• 位点偏爱：同一DNA分子上不同位点的 相同的识别序列的切割效率不同的现象。 与识别序列两侧的核苷酸组成有关。 • 切割相同量的不同DNA时所需的酶量是 不同的。
2.1.9 限制性核酸内切酶的反应条件
2.1.9.1 2.1.9.2 2.1.9.3 2.1.9.4 反应缓冲液 反应温度和时间 酶量 底物DNA
2.1.1 限制(restriction) 与修饰(modification)
寄主控制的限制与修饰现象 ： (寄主控制专一性） 限制：寄主（细菌）能够识别自 己的DNA和外来的DNA，并 使后者降解掉。 EOP (efficiency of plate)：感染率 •修饰： 在寄主大肠杆菌K菌株生长的λ噬菌体（ λk）感染大肠杆菌 B菌株，因为受到限制，产生稀少的噬菌斑。但用这少量的噬菌 斑中的噬菌体再感染B菌株，这些噬菌体可以在B菌株上有效的生 长。B菌株赋予了λk噬菌体的这种非遗传变化，使得它再感染B菌 株时没有再次受到B菌株限制的现象，称为修饰。
2.1.11 酶切注意事项
• 选择正确的酶 • DNA的纯度和浓度 • 反应体系甘油的量<5%（酶保存在50％甘油中，故所 加酶液体积最多为酶切反应总体积的1/10）。 • 酶保存在－200C有霜冰雪；使用时在冰浴上操作。 • 反应体系各成分都加完后，再加酶。 • 每次取酶液用新的枪头，防止交叉污染。 • 酶切样品多时，可先取一定量的酶液，稀释后再分装。 • 使用时防止任何可能引起酶蛋白变性的因素，如：气 泡、去污剂等。