卤虫的分类地位、生物学特征和分布及蛋白提取方法的优化

卤虫的分类地位、生物学特征和分布及蛋白提取方法的优化摘要：卤虫（Artemia）又称盐水丰年虫或盐虫子、卤虫子、丰年虾、卤虾等，除南极以外，所有大洲均有该属动物分布。

在分类学上隶属于节肢动物门（Phylum Arthropoda），甲壳纲（Class Crustacea），鳃足亚纲（Subclass Branchiopoda），无甲目（Order Anostaca）,卤虫科（Family Artemiidae）,卤虫属（Genus Artemia）。

中国卤虫（Artemia sinica）属于节肢动物门（Phylum Arthropoda），甲壳纲（Class Crustacea），鳃足亚纲（Subclass Branchiopoda），无甲目（Order Anostaca），卤虫科（Family Artemiidae），卤虫属（Genus Artem ia）。

主要分布于山西、西藏、新疆、青海、内蒙等内陆盐湖、盐井等高盐水体中，于是渗透调节就成了维持其生存的一个重要方面。

在卤虫胚胎发育早期，其渗透调节功能主要由盐腺和肠管来承担。

本文采用常规免疫组化和整体免疫组化对0小时、5小时、10小时、15小时、20小时、40小时、3天的卤虫NFAT5基因表达部位情况进行了研究，采用免疫印迹对卤虫NFAT5基因在不同条件下的表达情况进行了研究。

世界上很多学者致力于NFAT5基因的研究，以哺乳动物研究最多，低等动物中，以果蝇的NFAT5研究最多，卤虫的渗透压相关基因也研究了很多，但卤虫的NFAT5基因在国内外还无人进行研究。

本研究得到如下实验结果：1、发现0小时、5小时的卤虫其原肠胚内胚层处均有NFAT5的阳性表达，10小时的卤虫其膜内无节幼体内胚层处表达较为集中，前端有微量表达；15小时、20小时、40小时、3天的卤虫其NFAT5的表达主要分布在头部和肠管，以头部最为集中，且随着卤虫的早期胚胎发育，在头部的表达越来越明显。

2、发现在相同温度、相同盐度、相同光照强度的条件下0小时、5小时、10小时、15小时、20小时、40小时、3天的卤虫其NFAT5的表达量变化不明显，没有太大的浮动。

而在相同温度、相同光照强度、相同时期、不同盐度的条件下，对3天卤虫的NFAT5表达量变化进行研究分析得出随着盐度的增大，NFAT5的表达量呈递增趋势。

说明NFAT5受盐度的影响很大，在调控盐度渗透压时起到重要的作用。

关键词：卤虫、NFAT5、渗透压、卤虫的分类一、卤虫的分类地位、生物学特征和分布卤虫（Artemia）又称盐水丰年虫或盐虫子、卤虫子、丰年虾、卤虾等，除南极以外，所有大洲均有该属动物分布。

在分类学上隶属于节肢动物门（Phylum Arthropoda），甲壳纲（Class Crustacea），鳃足亚纲（Subclass Branchiopoda），无甲目（Order Anostaca）,卤虫科（Family Artemiidae）,卤虫属（Genus Artemia）。

卤虫为广盐性生物，在自然条件下，生活于高盐度的盐田和咸水湖中。

在盐度高于27％的盐水中仍可生存。

体色和大小与栖息的水体盐度有密切关系，在高盐度水体中，体呈红色，个体小，随着盐度的下降，体色逐渐变淡，体长逐渐增加。

该属动物的生长还与食物和温度有密切关系。

在自然水域中，它们以单胞藻类和有机碎屑为主要食物，最适生长温度为25～30℃左右。

卤虫的卵和幼体富有营养价值，是养殖鱼虾贝类幼体的优质饵料，成体作为水产养殖动物饵料也普遍受到重视。

不少国家已进行人工培养。

干卵及成虫蛋白质含量分别为57%-60%、18%，氨基酸、微量元素、维生素、不饱和脂肪酸含量丰富，并含有激素，这些物质均有利于生长、发育、提高抗病率、改善鱼虾的成熟和提高产卵率，同时卤虫也是基础理论研究的良好实验动物。

卤虫身体细长,虾形。

第一触角细小，呈棒状，不分节，末端有感觉毛。

雌、雄第二触角构造显著不同，雌虫的第二触角粗短，具毛，末节平扁；雄虫的第二触角极为发达，末节大而平扁，特化成抱器。

头部腹面中央伸出一叶上唇，第1小颚发达,第2小颚退化为极不明显的小片；头部背面中央有一个单眼，两侧有一对带柄的复眼。

胸部由11个体节组成。

各有一对叶状的胸肢。

胸肢分成外叶、内叶、扇叶和鳃叶。

鳃叶为呼吸器官，胸肢具有运动和呼吸双重功能。

腹部由8个无附肢的体节构成，第一、二两节愈合成生殖节，雌性成虫腹面具有一倒梨形卵囊，该节末端有生殖孔。

雄虫有交接器，最后一节为肛节，肛门位于肛节末端的尾叉基部之间，尾叉较短，呈狭叶状。

卤虫属包括两种生殖方式：营单性生殖或孤雌生殖以2 及两性生殖。

行孤雌生殖的卤虫雌体不经过交配就能产出卵子。

随外界环境条件的不同，卵子有不同的命运，如外界条件适宜，卵在孵育囊内不久便孵化为无节幼体，进入水中；如果外界环境不佳，也可形成滞育卵[1] 。

行两性生殖的卤虫成体合抱仰泳，进行受精，排出滞育卵。

卤虫的整个胚胎发育过程包括休眠卵、无节幼体前期、无节幼体期、后无节幼体期、拟成虫期和成虫期。

而胚胎发育早期包括休眠卵、无节幼体前期、无节幼体期、后无节幼体期。

本文选取0小时、5小时、10小时、15小时、20 小时、40小时以及3天的卤虫，包括了卤虫胚胎发育早期从休眠卵到后无节幼体期的整个时期。

高渗诱导因子NFAT5 ，NFAT家族和NF-kB Rel蛋白家族包括NFAT蛋白、NF-kB 蛋白以及NFAT5蛋白。

在脊椎动物中，NFAT5 是该家族最大的蛋白成员，其大小约为1500个氨基酸左右，并且它还有一个较长的反式激活区，其大小约为900多个氨基酸。

NFAT 是首次在T细胞中被发现的，当时它是被作为一种与人IL-2启动子末梢ARRE2结合的能快速诱导的核因子。

在哺乳类动物中，NFAT基因被分为四种，分别是NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4，他们编码约700—1000个氨基酸残基的蛋白。

NFAT蛋白存在两个非常保守的区域，NFAT同源区（NHR）和DNA结合区（DBD），NFAT 同源区约300个氨基酸残基，DBD约270个氨基酸残基，这两个保守区域彼此相邻。

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$$分页$$二、卤虫渗透压应答相关基因的研究trh基因相关研究工作卤虫长期生存在盐湖、盐池以及盐井等高盐水体中，因此，渗透压调节便成了该种动物生存的重要方面。

喜盐动物吞食海水后由消化道来完成水分的吸收，而过量的盐分则被及时的排泄掉，卤虫的渗透压调节在不同的发育时期其承担渗透压调节功能的器官也不相同。

如胚胎发育早期，卤虫的主要渗透压调节器官为盐腺，盐腺是在卤虫胚胎发育早期形成的一种暂时性结构，从幼虫阶段开始，盐腺伴随着胸部附肢的出现而逐渐消失，到了拟成虫期和成虫期，卤虫胸部的附肢起到主要的排泄盐的功能。

关于渗透压调节的基因有很多，其中APH—1基因就是一个。

APH－1编码一个POU-III包含的转录因子，这个转录因子与果蝇的Dfr蛋白有很高的相似性。

果蝇Dfr蛋白的一个突出的作用就是与果蝇trh基因共同作用来控制气管的发育和转录。

在果蝇中，唾液组织、气管、后端的气孔以及中枢神经系统中均有trh基因的表达。

唾液组织中的唾液原基是trh基因表达的部位，果蝇到了发育后期，唾液腺和唾液管均已形成，唾液腺的形态建成依赖与唾液原基，而唾液管则不是，但这时的trh基因其表达只在唾液管中。

果蝇在发育过程中，气管的基板逐渐形成，而trh基因就是表达在气管的基板上，之后又在所有气管细胞中表达。

在发育前期的蜘蛛其体内trh基因主要表达于气管、结肠气管以及丝腺前体上，而丝腺则可认为是双翅类昆虫的唾液原基。

到了蜘蛛的发育后期，trh基因只在丝蛋白转运通道的丝腺后端表达，类似于果蝇trh基因的表达。

Trh基因对于气管的发育以及其表达的多少至关重要，如trh 基因突变会造成气管细胞的减少以及基因表达量的降低；trh基因缺失会导致气管形态异常。

Trh基因编码bHLH－PAS蛋白家族的转录因子，这类蛋白在整个进化过程中是保守的，它又与生物体的一系列发育和生理进程是密切相关的，在线虫、果蝇、人类的体内又有所不同。

bHLH－PAS蛋白包括一个DNA结合结构域、交互作用的PAS-1和PAS-2域以及蛋白伴侣HLH域。

bHLH－PAS蛋白与目的DNA相结合，从而使其复制转录。

DNA 的结合部位是一段包含了ACGTG的核心序列，该部位被作为一种CNS中线因子是一种控制CNS中线细胞的发育和转录表达的single-minded目的序列-Tgo异性二聚体。

张瑞丰在硕士毕业论文中对卤虫的trh基因进行了渗透压相关研究，发现卤虫中也存在这么一个在盐腺和胸部附肢中表达的基因，和其他昆虫的trh基因有很高的相似性，尽管在形态学和发育方面与其他昆虫完全不同，盐腺和附肢的渗透压调节功能却都相同，这说明了卤虫trh 基因可能也具有渗透调节功能，也说明了在形成卤虫渗透调节组织器官，控制昆虫气管、唾液管、丝腺等的发育，trh 均具有本质性功能。

三、中国卤虫免疫组化以及蛋白提取方法的优化免疫组化方法优化卤虫卵的直径为200-300微米，经适当的条件孵出无节幼体，刚孵出的卤虫Ⅰ-Ⅱ龄无节幼体体长约0.5-0.8mm，培养二周后体长0.5-0.8cm，卤虫成体长1-1.3cm左右，大者可达1.5cm。

由此可以看出胚胎发育早期的卤虫个体非常微小，需要在显微镜下才能看清整体构造。

免疫组化实验中，在对卤虫进行固定时，其固定时间要比正常的固定时间缩短很多，固定时间不超过8小时，若时间过长会造成卤虫组织脆更，切片时容易断裂。

未脱壳的卤虫卵在固定前用次氯酸钠去壳，否则厚厚的卵壳会阻止固定液的渗入。

在透明的过程中，卤虫体碰到二甲苯会立即变透明，这个时候不可以按常规方法等半个小时，需要立即取出浸入蜡液中，否则虫体组织在切片时易碎。

整体免疫组化的方法相对于常规免疫组化的方法更加优化，由于卤虫个体微小，常规免疫组化操作过程中会造成卤虫肢体的破坏，且在切片时无法调整卤虫的摆放位置，使得切出的卤虫不能呈现完整的个体形象。

而整体免疫组化则一直都是在小管中进行，不会造成肢体的损坏，不用切片，卤虫的完整个体会很好的呈现在显微镜下。

操作较常规免疫组化更为方便快捷。

卤虫蛋白提取方法优化由于卤虫个体微小，在提取蛋白的过程中不可能将肠管去掉，因此在添加常规蛋白酶抑制剂的前提下还会添加更多种的蛋白酶抑制剂，如市面上出售的混合蛋白酶抑制剂效果比较好，在添加蛋白酶抑制剂的量上也为常规的2倍。

对于未脱壳的虫卵，在提取蛋白的过程中，需用超声破碎仪进行充分破碎，打碎外层卵壳，使蛋白充分溶解在提取液中。

参考文献[1]堵南山，《甲壳动物学（上册）》，科学出版社，1987。