单个细胞分离技术PBMC教材
免疫细胞的分离及检测技术课件
Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液， 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死 亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细 胞而使细胞着色（蓝色）。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标， 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群；目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
单个细胞分离技术PBMC
1个大方格中16个中方格
计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
4个大方格内 细胞总数
单个核细胞总数/ml=
一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）
（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞
• 密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转
1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间） 将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分离 液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。
◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层， ◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的
单个核细胞
分离液 粒细胞 红细胞
用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内 加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min. 弃去上清，留约50μl. 加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。
肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释 方法
分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
4
× 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104
单个核细胞分离及E花环形成试验 医学课件
主要的试剂和器材
• Ficoll分层液 • 250U/ml 肝素溶液 • 5g/L台盼兰 • Hanks液、含20％灭活小牛血清的Hanks液 • 注射器、一次性试管、一次性吸管、细胞计数板、
实验结果
• PBMC计数结果记录和计算
• 单个核细胞活力计数结果记录和活力计算
注：死细胞染成蓝色，活细胞不染色
注意事项
• 将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高 单个核细胞的收获量。
• 分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。
• 将稀释的全血加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以 影响分离效果。
• 该方法简便易行，曾被广泛应用，但影响因素 较多，结果偏差较大，已经被CD抗原免疫检测 法取代。
Байду номын сангаас
同学们：
中午离开前，请将细胞计数板冲洗干 净，关闭显微镜光源。下午实验后，请 将使用过的一次性器材丢入垃圾桶，使 用过的玻璃器材冲洗干净后放入水槽边 上的回收桶中，整理好自己的台面再离 开！
值日生请认真做好本职工作！
E花环形成试验
实验原理
• 人外周血中的T细胞表面具有能与绵羊红细胞 （SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体 （CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面 标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细 胞表面，呈现花环状。通过花环形成检测T细胞的方 法，称为E花环形成试验。根据花环形成的多少，可 测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能 状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。
单个细胞分离技术PBMC
临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六 单个核细胞分离及细胞免疫功能检测 【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周
围，形
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
资料：SOP-CC-PC-002-00 PBMC分离标准操作规程
XXXX 生物科技有限公司文件编码SOP-CC-PC-002-00文件页数共 4 页文件名称PBMC分离标准操作规程颁发部门：审核人：批准人：起草人：审核日期：批准日期：起草日期：分发部门：生效日期：变更记载变更原因及目的：修订号批准日期执行日期PBMC分离标准操作规程【目的】：规范化细胞培养中外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分离操作。
【范围】：应用于细胞培养过程中患者单个核细胞的分离。
【责任】：实验室负责人、细胞培养操作人员及PBMC技术应用人员对本规程负责。
【内容】：背景介绍：本操作规程应用于外周血单个核细胞（PBMC）的分离，分离方法为密度梯度离心法：不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。
细胞分离液的主要成分Ficoll为蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，密度约为1.2g/ml。
在细胞分离过程中Ficoll 试剂不会超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。
将全血细胞加载于Ficoll液面上，由于红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底液体分为四层；最上层为血浆，淋巴细胞和单个核细胞的比重小于或等于Ficoll试剂比重，离心后处于血浆下层，漂浮于分离液的液面上；最下层为血小板、红细胞、粒细胞等。
吸取第二层细胞（俗称白膜层）液面的细胞，就可从外周血中分离得到单个核细胞。
1操作时间采血后得到的血样应在采血后6小时之内进行PBMC分离操作，以防止凝血、溶血发生。
血样在采血后越短时间间隔内处理得到的PBMC活性越好。
2设备、耗材和试剂2.1 设备生物安全柜、台式大容量离心机、生物倒置显微镜、二氧化碳培养箱、涡旋振荡器、生化培养箱2.2 耗材50ml离心管、250ml离心管、5ml移液管、10ml移液管、25ml移液管、200μl吸头、1.5ml计数管、T175细胞培养瓶2.3 试剂Ficoll试剂、生理盐水、细胞培养基、Turk液、台盼蓝、哥伦比亚血平板3操作流程3.1 操作前准备3.1.1 开启生物安全柜，运行10分钟后方可在生物安全柜内进行PBMC分离操作。
外周血单个核细胞的分离及其寿命
外周血单个核细胞的分离及其寿命外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)外周血单个核细胞外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
体外检测淋巴细胞首先要分离外周血单个核细胞，目前主要的分离方法是Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。
红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。
血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。
本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。
分类表：血细胞寿命1、红细胞-携带氧的“运输兵”红细胞是血细胞中最多的细胞，内含血红蛋白，它能把人体从肺部吸入的氧气结合后，通过备注徨再释放给各组织，因此被称为携带氧气的“运输兵”。
红细胞的平均寿命为120天，每天均有细胞衰老、死亡、也就是说，每天约有20亿个红细胞死亡。
2、白细胞—人体健康的“卫士”白细胞能吞噬进入人体的细菌和病毒以及代谢产生的对人体有害的“异物”，白细胞还有免疫功能。
白细胞的平均寿命很短，约7-14天。
粒细胞在骨髓内经10天左右释放入血液，在血液不到1天然后溢出血管进入组织或体腔内。
在组织或体腔内可以行使防御功能2－3天。
素爱老的粒细胞被单核-巨噬细胞系统清除，也有一部分从口腔、气管、消化道和泌尿生殖道排出。
淋巴细胞：B淋巴细胞寿命较短，一般3－4天，景观抗原刺激后分化为浆细胞，产生特异性抗体，参与体液免疫。
T淋巴细胞寿命较长，可达数月，甚至数年，经抗原致敏后，可产生多种免疫活性物质，参与细胞免疫。
单个细胞分离技术PBMC概要
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
细胞存活率 = ×100% 活细胞数+死细胞数 200 例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
活细胞数(N)
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，
取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
单个细胞分离技术PBMC
多组学分析
结合基因组、转录组、蛋白质 组等多组学分析，深入揭示 PBMC在生理和病理状态下的 分子机制。
临床转化研究
加强PBMC分离技术的临床转 化应用，推动其在疾病诊断、 治疗和预后评估等方面的实际 应用。
伦理和社会问题
关注PBMC分离技术的伦理和 社会问题，确保研究遵循相关 法规和伦理准则，保护受试者 的权益和隐私。
单个细胞分离技术（C
目
CONTENCT
录
• 引言 • PBMC的分离方法 • PBMC的应用领域 • PBMC分离技术的挑战与展望 • 结论
01
引言
目的和背景
研究细胞类型和功能
PBMC分离技术用于研究人体内不同免疫细胞的类型、功能和相 互作用，有助于深入了解免疫系统的运作机制。
疾病诊断和治疗
PBMC分离技术为免疫学、生物学和医学研 究提供了重要的基础，使得科学家能够深入 研究单个细胞的特性和功能。
药物研发
PBMC分离技术为药物研发提供了实验模型 ，有助于筛选和验证药物的疗效和安全性。
对未来研究的建议和展望
01
02
03
04
技术创新与优化
进一步探索和开发更高效、准 确的PBMC分离技术，提高细 胞纯度和回收率。
个体化用药
根据患者PBMC的反应差异，可 以为患者选择合适的药物和剂量， 实现个体化用药。
04
PBMC分离技术的挑战与展望
细胞活性与纯度问题
细胞活性
在分离过程中，PBMC的活性可能会受到影响，导致其功能和代谢活动的改变。 为保持细胞活性，需要优化分离条件，如选择适当的抗凝剂、离心速度和时间等 。
流式细胞分离法
总结词
一种高效、快速的分离技术
外周血单个核细胞分离方法
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等;取得有活性的细胞应根据不同目的,采用不同方法,考虑1细胞纯度；2细胞获得量；3细胞活力；4使用方法的简易程度和本室条件等;目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞;一原理:常用来分离人外周血单个核细胞PBMC的分层液比重是±的聚蔗糖Ficoll-泛影葡胺UrografinF／H分层液;Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,犌W水性高,平均分子量为400,000,当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜;红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中;吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞;二方法:1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液;2.25000rpm离心5-10分钟,吸取上清,取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面;水平离心2000rpm×20分钟;3.离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank"s液,下层主要为红细胞和粒细胞;中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带如下图,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞;此外,还含有血小板;4.用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞;置入另一短中管中,加入５倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640,2000rpm×20分钟,洗涤细胞两次;5.末次离心后,弃上清,加入含有10％小牛血清的RPMI1640,重悬细胞;取一滴细胞悬液与一滴％台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数;单个核细胞浓度细胞数／1毫升细胞悬液＝4个大方格内细胞总数──────────×10４×2稀释倍数46.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色;计数200个淋巴细胞;计算出活细胞百分率;活细胞数活细胞百分率＝──────×100％总细胞数用本法分离PBMC,纯度在90％以上,收获率可达80～90％,活细胞百分率在95％以上; %DMSO胎牛血清冻存;。
单个核细胞(PBMC)中CD4+细胞群Foxp3抗体染色方法
单个核细胞（PBMC）中CD4+细胞群Foxp3抗体染色方法
1.细胞计数。
2.300g离心10分钟，弃尽上清。
3.重悬细胞至10*6每90ulbuffer。
4.加10ulCD4-FITC和10ulCD25抗体。
5.混匀在黑暗条件下孵育10分钟。
6.用1~2mlbuffer洗涤10*6个细胞，然后4°，300g离心5分钟。
弃尽上清。
7.用新配置冷的固定液1ml重悬10*6个细胞（细胞较少按比列减少固定液）
8.混匀4°避光孵育30分钟。
9.用1~2ml冷的buffer洗涤10*6个细胞，然后4°，300g离心5分钟。
弃尽上清。
10.用1~2ml冷的1X透膜液洗涤10*6个细胞，然后4°，300g离心5分钟。
弃尽上清。
11.用80ul冷的1X透膜液重悬10*6个细胞。
12.加20ulFcR封闭液。
13.混匀4°避光孵育5分钟。
14.加10ulFoxp3抗体。
15.混匀4°避光孵育30分钟。
16.用1~2ml冷的1X透膜液洗涤10*6个细胞，然后4°，300g离心5分钟。
弃尽上清。
17.重悬细胞，流式分析。
单个核细胞分离试验
1.单个核细胞分离
1.采集静脉血用EDTA-K2抗凝管无菌采集静脉血2ml，立即轻轻摇匀，使血液抗凝。
2.稀释抗凝血用无菌吸管加入2ml等体积的Hanks液或磷酸缓冲盐溶液PBS 充分，使血液等倍稀释，降低红细胞的凝集，提高分离效果。
（此步骤可省去）
3.分离PBMC
（1）取淋巴细胞分离液3ml于灭菌离心管中，然后将离心管倾斜45度，将稀释的血液缓慢叠加于淋巴细胞分离液上，注意勿使血液混入淋巴细胞分离液中。
（2）平衡后，于离心机中室温2000r/min离心20分钟。
离心后，最上层为血浆层，第二层即为单个核细胞层。
（3）用毛细吸管吸取最上层的血浆、血小板后弃去。
再用另一毛细血管吸取单个核细胞于新的无菌离心管中。
4.洗涤PBMC预估转移的单个核细胞的体积，加入3~5倍体积的磷酸缓冲盐溶液PBS，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min离心10分钟，可去掉大部分混杂的血小板。
之后去掉上清，继续加入3~5倍的平衡盐溶液，用吸管轻柔重悬细胞，离心，1500r/min 离心10分钟，去上清后备用。
4.PBMC分离
外周血单个核细胞(PBMC)
包括淋巴细胞和单核细胞。
是免疫学实验最常用的细胞，也是T、B细胞分
离纯化的第一步。
常用分离方法：聚蔗糖-泛影葡胺(FicollUrografin)密度梯度离心法
1
2
2
1
1
2000rpm 20min
1
1000rpm 3 3 3 10min
3
方 法
稀释的抗凝静脉血1ml 取一只玻璃试管，加入1ml淋巴细胞分离液；转移血标 本于淋巴细胞分离液上层（注意：保持液面完整) 离心，2000rpm，20min 吸取单个核细胞（中间白膜层），转移至一新试管中
加入5倍量D-Hank’s ，混匀，离心，1000rpm，10min
弃上清，留少许重悬沉淀 滴一滴细胞悬液于载玻片上，盖盖玻片，镜下观察
结 果
(一)
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
(二) 镜下观察结果
实验报告
外周血单个核细胞(PBMC)的分离
方法、原理、步骤、结果
原 理
聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液 比重为1.077±0.001
红细胞、粒细胞比重1.09；
淋巴细胞和单核细胞的比重1.075
稀释抗凝血
血浆 单个核细胞
淋巴细胞分离液
凝兔子外周血 淋巴细胞分离液 D-Hank’s液 试管、吸管等
PBMCs的分离和计数
不着色）
活细胞数
活细胞百分率 =
细胞总数
× 100%
密度梯度离心法分离PBMCs：
纯度在90%以上 淋巴细胞约占90-95% 细胞收获率可达80-90% 活细胞百分率在95%以上
注意事项
• 稀释的肝素抗凝血，沿管壁轻轻叠加于分离液上 ，使两者形成一个清晰地界面。
• 细胞经离心分层后，缓慢小心吸取，切勿打破形 成的细胞层。
PBMCs的分离和计数
实验目的和要求
• 掌握PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)分离的方法 • 掌握细胞计数的方法
实验原理
外周血中细胞种类
细胞密度
红细胞和多核白细胞
1.092-1.093
PBMC(淋巴细胞和单核细胞)
1.074
淋巴细胞分离液：Ficoll-Hypague 1.077
实验步骤
稀释后的 抗凝血
淋巴细胞 分离液
肝素抗凝静脉血1-1.5
ml 加等体积的Hank’s液稀释
置于2ml淋巴细胞分离液上
(交界液面：一定不要打乱)
离心（2000rpm， 25min）
血浆
分液 红细胞 粒细胞
PBMCs层
用Hank′s液洗、离心 (1500 rpm，5min) 重复2次
细胞计数
数上不数下，数左不数右。
细胞计数板
细胞计数
用100ulHank’s液重悬细胞
取10ul细胞悬液+40ul Hanks'液 +50ul台盼兰, 混匀
取10ul于细胞计数板上
进行细胞计数
实验结果计算
细胞数量：
单个核细胞浓度（细胞数/ml)
= 2个大方格内细胞总数 ×104×稀释倍数
PBMC的分离
PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。
2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。
3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。
注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层6、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温7、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。
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• 在高倍镜下计数200个细胞中的死亡细胞数， 计算其存活率：使用血细胞计数器：
细胞存活率 = ×100% 活细胞数+死细胞数 200 例如：活细胞总数为 120个，存活率为：60%； 若活细胞计数为180个，存活率：90%
活细胞数(N)
【临床意义】
分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一， 是进行流式细胞分析技术的重要的前期基本操作； 是进行各项免疫细胞功能检测的基础技术。 分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要， 不仅用于淋巴细胞总数和细胞的存活率测定，
梯度离心法——分离提取单个核细胞
稀释血浆 内含血小板 2000rpm/ 20-30min
单个核细胞
分离液
粒细胞
红细胞
用细长吸管慢慢插入白膜层，沿管壁周边轻轻吸取单核细胞层于另一试管内 加入PBS洗液3-4ml，离心洗涤2次，1500/r,10min. 弃去上清，留约50μl. 加含有10%灭活小牛血清-PBS液1.0ml，混匀充池，镜下计数。
临床上反复感染者和肿瘤病人，使人首先想到的是：患者是否有 细胞免疫缺陷，必须进行细胞免疫缺陷的检测，而这种检查的 第一步就是单个核细胞的分离，计数。然后进行功能检查。
一、单个核细胞分离法（主要为淋巴细胞）
（一）葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞
• 密度梯度离心法：水平离心机，逐渐加速，自然停转
1.分离液：葡聚糖-泛影葡胺混合液（比重1.075～1.092之间） 将分离液，加入抗凝血中离心，离心后不同比重的血细胞在分 离液中呈梯度分布。比密大在底部，小的在上部。 ◆红细胞和多核白细胞比重较大（1.092），分布于最底层， ◆单核细胞比重较小（1.075～1.090），分布于血浆与分离液的 交界处。界限清楚，层次分明。将该层细胞吸出，即为单个核 细胞（主要为淋巴细胞） ◆血浆和血小板位于最上层。血小板在血浆中下部 2. Hanks缓冲液：（ pH 7.2-7.4,无Ca、Mg离子） 3. 0.4%台盼蓝染液
美丽的海医校园
临床免疫学实验指导
海南医学院
实验六
单个核细胞分离及细胞免疫功能检测
【实验目的】 1.熟悉淋巴细胞分离方法 2.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义
T细胞介导的免疫应答特征：是T细胞辅助细胞（Th1）介导的 单个核细胞（L, M），以浸润为主的炎症反应与细胞毒性T细胞
（CTL或TC）发生特异性细胞毒效应.
4个大方格内 细胞总数 4 × 稀释倍数 ×104
单个核细胞总数/ml=
单个核细胞总数/ml = X/4×10×(稀释倍数) ×103 =X×104 关于稀释倍数：这里不是指血液稀释倍数。是指最后洗涤 离心弃去上清液后的单个核细胞沉淀中，加入缓冲液1.0ml后。
此缓冲液中的单个核细胞密度。
细胞存活率检测
也用于，各种标志物以及其他淋巴细胞功能测定等。
实验报告：
1. 报告单个核细胞计数总数结果 2. 报告单个核细胞存活率 3. 简述密度梯度离心法分离单个核细胞的原理 4. 分离单个淋巴细胞的临床意义 T细胞总数测定：Et花环实验。学生课余自学内容。
计数池区域 一个计数全池 大方格 白细胞中方格 红细胞中方格 红细胞小方格 边长（mm） 3 1 0.25 0.20 0.05 面积（mm2） 池深（mm） 9 1 0.0625 0.0400 0.0025 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 体积（mm3 ul） 0.90 0.10 0.00625 0.00400 0.00025
取10μl淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl， 混匀。取10μl加入血细胞计数板，静置片刻， 置显微镜高倍镜下观察。计数200个单个核细胞 分别记录活细胞数，死细胞数，带入计算公式， 报告活细胞存活率。
【结果判定】
活细胞不着色，折光性强。死细胞由于染料可渗入 细胞内，故死细胞被染成蓝色，体积较大，无光泽 正常情况下，活细胞存活率应在95%以上。 表明免疫活性细胞数量正常。然后做其他功能检测
静置片刻，置显微镜下计算淋巴细胞数。
具体计数方法如下：
▲
血细胞计数池的构造
1. 大方格
9个
2. 中方格分2种 WBC计数区分16个
RBC计数区分25个
3.小方格1种， 是指RBC计数区 的1个中方格又分 16个小方格，即：
计数池内有：1种
大方格；2种中方 格；1种小方格 池深 0.1mm
血细胞计数池的构造参数 4种方格的体积（容积）
肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释
方法
沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中 (不能破坏二者的液面）,2000r/min 离心20min 吸出淋巴细胞层加入另一试管中，加3～4ml Hank’s液， 混匀离心洗涤， 1500r/min 离心10min 弃去上清，再加3ml Hank’s液，混匀， 1500r/min 10min，重复洗涤2次 重复1次
细 胞 计 数 原 则 计 左 上 ， 不 计 右 下
血细胞计数板
血细胞计数板上四个角的 四个大方格
1个大方格中16个中方格 计数血细胞计数板上四个角的 四个大方格内单个核细胞总数。 （只计算上边和左边的压线细胞， 右边和下边压线细胞不计算）
单个核细胞总数计算： 是指最终制备的每ml细胞缓冲液内的 单个核细胞的密度（数量）
留取约50μl,加缓冲液至1.0ml，稀释20倍
末次离心后，弃去上清液。加含10%灭活小牛血清/HanK‘s液 加至1.0ml，混匀，灌入血细胞计数池，单个核细胞计数， 于低倍镜下计数4个角大格内细胞总数。
计数细胞方法
加样： 将淋巴细胞悬液混匀，吸取10μl加入到 40μl含10%灭活小牛 血清的Hank’s液中，混匀后再吸取10μl充入计数板上。 细胞悬液稀释5倍。此稀释也可省略，可根据细胞密度而定
E+淋巴细胞百分率测定：正常人参考值： 60%-80%
由于干扰因素较多，主观因素影响，临床意义不明显
结果不稳定，重复性不高等原因，很少做。
T细胞总数测定——Et花环沉降法（E+淋巴细胞百分率：60-80%）
人类T细 胞的主要 标志 的CD2、 CD3和 TCR均 能吸附 绵羊红 细胞于淋 巴周