酵母菌感受态制作及转化

Y187 酵母感受态制作及转化

1）挑新鲜单菌落Y187 于8 ml YPDA 培养液，30℃，250 rpm 培养16-18h；2）至OD600＞1.5，1：10 转接，此时OD600≈0.3；

3）30℃，250 rpm，4-7 h，每2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6；

4）转入2 个50 ml 离心管，5100 rpm,5 min,弃上清；

5）加入1/2 V ddH2O,洗涤细胞，5100 rpm,5min,弃上清；

6）每管中分别加1 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；

7）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1×TE/LiAc，冰上混匀，10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1×TE/LiAc，每管100 ul 分装；

10）分别加入100 ng 左右DNA（plasmid）和0.1 mg 鲑鱼DNA（10 mg/ml,10 ul）,移液器抽吸混匀溶液；

11）分别加入600 ul LiAc/PEG，高速混匀（10 s-1 min 内）；

12）30℃摇床恢复30 min；

13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO,轻轻颠倒混匀；

14）42℃热激15 min；

15）冰上放置1-2 min；

16）14 000 rpm,15 s,去上清；

17）300 ul TE 重悬细胞；

18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板；

100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板；

100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72 h 可见转化菌落。