ABTS自由基清除法SOP
DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li
DPPH•和ABTS+•自由基清除实验（含PTIO•自由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH•) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxid e (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH•、ABTS+•、PTIO•自由基三者，都是常用的自由基。
概述如下表：12工作液外观紫色墨绿色蓝紫色工作液紫外光谱与最大吸收2004006008000.00.51.01.52.02.53.0吸光度波长/nm519nm(50 μg/mL)2003004005006007008009000.00.51.01.52.0734nm吸光度波长/nm415nm（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）200400600800012吸光度波长/nm557nm(50 μg/mL)检测波长 519 nm 734nm557nm （水溶液）检测原理当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是评估化合物或材料抗氧化性能的一种重要手段。
随着抗氧化活性的研究日益深入，目前已经发展出很多种测定方法。
以下将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法、Fe2+/Fe3+还原能力法和ABTS自由基清除法。
1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色的自由基，常用于评估化合物或材料的抗氧化活性。
该方法基于DPPH自由基与抗氧化物质发生反应后，颜色由紫色变为淡黄色或无色。
测定方法简单，操作方便。
其原理是待测样品与DPPH混合后，通过电子或氢的转移反应，DPPH自由基将被清除，溶液颜色由紫色转变为淡黄色。
根据吸光度变化可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。
2.Fe2+/Fe3+还原能力法：该方法基于还原能力测定抗氧化物质对Fe3+离子的还原能力。
常用的试剂是FeCl3溶液和TPTZ（2,4,6-三聚吡啶甲酸）、酸性pH缓冲液。
其原理是待测样品能够还原Fe3+离子为Fe2+离子，Fe2+离子与TPTZ反应生成有颜色的络合物，通过分光光度计测定络合物的吸光度变化，进而计算出还原能力。
较高的吸光度变化表示较高的抗氧化活性。
3.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)）自由基是一种蓝绿色自由基，其浓度在紫外可见光区域有最大吸收。
该方法基于ABTS自由基清除率来评估抗氧化物质的抗氧化活性。
该方法较DPPH法和还原能力法更为灵敏。
其原理是待测样品与ABTS自由基反应后，ABTS自由基将被清除，溶液颜色由蓝绿色变为无色或浅黄色。
通过测定吸光度的变化，可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。
除了上述常用的抗氧化活性测定方法外，还有很多其它方法也被广泛应用于抗氧化活性的评估，如氧化还原测定法、Fenton反应法、还原剂抑制能力法等。
每一种测定方法都有其独特的原理和适用范围，研究人员可以根据具体的研究目的和样品性质选择合适的测定方法。
A清除自由基实验方法
1、DPPH 自由基清除实验取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。
同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。
4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。
自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。
2、ABTS 自由基清除实验20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。
该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。
加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。
ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。
ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。
3、超氧阴离子清除实验采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。
在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。
abts自由基清除能力的测定步骤
abts自由基清除能力的测定步骤嘿，咱今儿就来聊聊 abts 自由基清除能力的测定步骤这事儿哈！你可别小瞧了这测定步骤，就跟咱走路得一步步来，不然就得摔跟头一个道理。
首先呢，咱得准备好各种材料和试剂。
这就好比要做饭，得先把菜啊、调料啊都准备齐全了不是？那得有高质量的 abts 溶液，还有其他相关的化学试剂，一个都不能少。
然后呢，就是要进行一系列的操作啦。
把 abts 溶液和其他试剂按照一定的比例混合起来，这就像是在调配一种神奇的魔法药水。
这时候可得仔细着点儿，别弄洒了或者弄错比例了，不然可就前功尽弃啦。
接着呢，把混合好的溶液放在合适的条件下培养一段时间。
这就好比是让种子在土壤里慢慢发芽长大，得给它足够的时间和条件呀。
在这个过程中，咱可不能闲着，得时刻关注着，看看有没有啥异常情况。
等培养好了，就该进行实际的测定啦！把要测试的样品加进去，就像给这魔法药水加点特殊的调料。
然后观察反应，看看这样品对 abts自由基的清除效果怎么样。
你说这像不像一场有趣的实验游戏？每一步都充满了挑战和惊喜呢！要是操作得好，就能得到准确的结果，要是不小心出了差错，那可就得重新再来咯。
在整个过程中，可千万要注意细节啊！一点点小失误都可能导致结果不准确，那不就白忙活了嘛。
就像盖房子，一块砖没放好，可能整座房子都不稳当呢。
而且啊，做这个测定可不能马虎，得有耐心，得细心。
就跟绣花似的，一针一线都得精心摆弄。
咱可不能图快，得一步一个脚印地把每一步都做好。
你想想，要是能准确测定出 abts 自由基清除能力，那对好多研究和应用都有大用处呢！能帮助我们更好地了解各种物质的性质和功效，这多有意义啊！所以啊，大家可得重视这测定步骤，别不当回事儿。
认真对待每一个环节，才能得出可靠的结果。
这可不是闹着玩的哟！总之，abts 自由基清除能力的测定步骤，看似简单，实则暗藏玄机，得用心去钻研，去实践。
大家加油吧，让我们一起把这个测定做得棒棒的！。
3种抗氧化活性测定方法
3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性是指物质对氧化过程的抑制作用，能够减缓或阻断自由基对细胞和组织的损害。
目前，常用的抗氧化活性测定方法主要包括DPPH 自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原能力测定法。
以下将对这三种方法进行详细介绍。
1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-若氧基-苯基-π-苦味噁唑）自由基清除法是一种常用的抗氧化活性测定方法。
该方法是通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
DPPH自由基是一种紫色稳定的自由基，在接触到氢供体（抗氧化剂）后，会发生颜色变化从紫色转变为黄色。
可以通过测定样品溶液的吸光度来评估其抗氧化能力。
吸光度的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力较强。
2.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑））自由基清除法也是一种常用的抗氧化活性测定方法。
ABTS自由基是一种无色可溶性自由基，其生成主要通过氧化剂与ABTS反应而产生。
测定方法是将ABTS与过氧化氢反应，生成蓝色自由基溶液，然后将样品加入到溶液中，通过测定吸光度的变化来评估样品的抗氧化活性。
吸光度的降低表明样品对ABTS自由基的清除能力较强。
3.铁还原能力测定法：铁还原能力测定法是一种评估抗氧化活性的常用方法，通过测定样品对Fe3+还原为Fe2+的能力来评估其抗氧化能力。
在这个方法中，还原剂（如抗氧化剂）会与Fe3+反应，生成Fe2+，并且Fe2+的浓度可以通过测量其吸光度来确定。
浓度越高，吸光度越高，表明样品的抗氧化能力越强。
这三种抗氧化活性测定方法各有其优势和适用范围。
DPPH自由基清除法适用于评估样品对自由基的清除能力，但其结果受其他化合物的影响较大；ABTS自由基清除法对于水溶性和脂溶性样品均适用，但其结果也受其他化合物的影响；铁还原能力测定法适用于样品中还原型物质的测定，可评估样品对金属离子的还原能力。
因此，在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法来评估样品的抗氧化活性。
ABTS自由基清除法SOP(最新版) 以肾上腺素为例
ABTS自由基清除法SOP(最新版) —以肾上腺素为例【原理】根据文献[1]所知，ABTS法常常被用于检测物质的体外抗氧化能力。
ABTS+自由基是一种在体外十分稳定的氮自由基，它的溶液显蓝绿色，在734nm上有最大吸收。
这种自由基可以通过ABTS与K2S2O8反应生成。
当自由基被清除，数量减少，它的溶液颜色会变浅，734nm 下吸光度降低，由此可以来判断样品清除ABTS+的能力。
图1. ABTS结构式图2. ABTS自由基的分子模型（基于Chem3D,MM2优化）【实验对象】肾上腺素(adrenaline，epinephrine，AD，EP)是由肾上腺髓质分泌的一种激素，都属儿茶酚胺类激素，又称副肾素，分子式为C9H13O3N，化学成分为1-(3,4-二羟基苯基)-2-甲氨基乙醇或3,4-二羟基-α-(甲氨基甲基)苄醇。
肾上腺素是一种多酚。
多酚结构中羟基与苯环直接相连，是极好的氢或电子供体，所形成的酚类游离基中间体比较稳定，不会引发新的游离基或者由于链反应而被迅速氧化，因此多酚类化合物是很好的抗氧化剂。
图3. 肾上腺素结构式图4.肾上腺素的分子模型(基于Chem3D,MM2优化）【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿。
2.试剂肾上腺素（AR）、ABTS（AR）、无水乙醇（AR）；K2S2O8（AR）【实验操作】清除ABTS能力检测本实验采用文献[1]的方法，并视情况改动。
我们选取Caffeic acid作为实验对象，其实验过程大致如下：1.ABTS自由基储备液的配置取7.4mmol/L ABTS储备液和2.6mmol/L K2S2O8储备液各1mL等体积混合，在室温，避光条件下放置12小时，即得ABTS+自由基储备液。
该储备液在室温、避光的条件下稳定。
ABTS测抗氧化性原理-具体操作-以椴树苷为例-李熙灿 曾婧媛
ABTS测抗氧化性原理及其具体操作（以椴树苷为例）李熙灿曾婧媛【原理】ABTS法是一种被广泛用于检测物质体外抗氧化能力的方法。
ABTS与K2S2O8反应可以生成稳定的自由基ABTS+•，此自由基在734nm下有最大吸收且会显蓝绿色，当自由基被清除，数量减少其溶液颜色会变浅，从而导致734nm下吸光度降低。
由此可以来判断样品清除ABTS+•的能力。
图1.ABTS自由基结构式图2. ABTS分子模型（不同角度）（采用Chem3D Pro 14.0软件绘制）【仪器与试剂】1.仪器可见分光光度计；SB3200D超声波清洗机；电子天平（BS110S）；BIOHIT单道手动可调移液器（10-100μL、100-1000μL、1000-5000μL）；微量比色皿；pH计。
2.试剂椴树苷（AR）、BHA和Trolox（AR）；甲醇（AR）；无水乙醇（AR）；ABTS（AR）；K2S2O8（AR）【试验操作】图3. 椴树苷结构式图4. 椴树苷分子模型（不同角度）（采用Chem3D Pro 14.0软件绘制）清除ABTS+·自由基检测实验采用文献[1]的方法，并根据实际情况改动。
操作如下：1 配制溶液[1]取7.4mmol/L ABTS储备液和2.6mmol/L K2S2O8储备液各1mL等体积混合，于室温、避光条件下放置12小时，即得ABTS+·自由基储备液。
先用无水乙醇稀释ABTS+·工作液，使其在734nm波长下的A（吸光度）至0.701（A=0.7±0.02，温度30℃）。
2 实验操作及测定[1]用移液器精确移取ABTS+·工作液800μL、加椴树苷（1mg/mL，无水乙醇溶解）xμL（x=40、70、100、130、160）、无水乙醇（200－x）μL于洁净的试管中，反应体系总体积1000μL，振摇10s、充分混合，静置6min，测定A734nm值。
实验平行检测三次。
abts法和dpph法测定类胡萝卜素清除自由基能力的适用性
系在 １８０ mi
n 内保持稳定.７ 种类胡萝卜素在 ７３４nm 处吸光值随样品浓度的增加而降低,具有显著量效关系. 经
测定获得了 ７ 种类胡萝卜素与槲皮素清除 ABTS 自由 基 的 半 数 抑 制 浓 度 (
一.本实验对常用的两种清除自由基活性的测 定 方 法,
DPPH 和 ABTS 法,进 行 了 类 胡 萝 卜 素 适 用 性 的 研 究. 采
用 ７ 种类胡萝卜素与槲皮素作为研究对象,分别考察 了 其 清 除 DPPH 和 ABTS 自 由 基 的 能 力 及 其 光 谱 学 特 征,并
优化活性测定条件.结果 表 明,采 用 DPPH 测 定 法 时,部 分 有 色 类 胡 萝 卜 素 由 于 其 最 大 吸 收 峰 在 ４５０~５５０nm 之
Ｇ胡 萝 卜 素 ＞ 番 茄
红素.ABTS 清除实验避免了有色抗氧化剂本身的光 谱 干 扰,相 比 DPPH 自 由 基 清 除 测 定 而 言,更 可 靠、方 便,更
适合作为类胡萝卜素清除自由基性测定方法之一.
关键词:类胡萝卜素;
DPPH;
ABTS;自由基清除能力
中图分类号:
O６５ 文献标志码:
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abts自由基清除原理
abts自由基清除原理
ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))自由基清除原理是利
用ABTS分子的氧化还原反应能力来评价抗氧化物质的清除自由基能力。
ABTS+
自由基激发电子跃迁至高能量态时，会发出蓝色荧光。
但如果有清除自由基的抗氧化剂与ABTS+相遇，便可促使化学反应，使ABTS+的电子被捕获并还原为未被激
活的ABTS分子，从而减弱或失去蓝色荧光。
抗氧化物质的清除自由基能力越强，ABTS+被还原为ABTS的速率越快，表现为其荧光强度下降的程度越大。
因此，ABTS自由基清除原理可用于评价天然或合成化合物的抗氧化能力。
PTIO和ABTS自由基清除实验操作指南-李熙灿 曾婧媛
PTIO和ABTS自由基的清除实验操作指南（以槲皮素为例）【前言】PTIO和ABTS自由基简介PTIO是与人体内自由基较为相似的氧自由基;而ABTS是氮自由基，虽然主要元素不同，但它们都较为稳定且随着被清除都会造成在特定波长下吸光度减小，所以常被用于检测物质体外抗氧化能力强弱。
本文详细介绍了这两种自由基清除实验的操作方法，并附有实例。
其中，PTIO自由基可以用于检测活性氧的清除能力；而ABTS自由基则适于检测活性氮的的清除能力。
（A）（B）（C）（D）图1.（A）PTIO•自由基结构式（B）ABTS•自由基结构式（C）PTIO分子模型（不同角度）（D）ABTS分子模型（不同角度）（采用Chem3D Pro 14.0软件绘制）【实验方法】1. PTIO自由基清除[1]1.1 溶液的配置PTIO试液：3mg PTIO固体+20mL 甲醇超声，混匀PTIO测试液取80μL PTIO测试液和20μL甲醇（与PTIO测试液中溶剂一致）混匀，在557nm 处测定吸光度，使吸光度保持在0.35±0.01之间。
吸光度偏大或偏小，就调节原PTIO测试液的浓度，使吸光度保持为0.35±0.01。
此吸光度为A0。
样品液：用合适溶剂溶解（一般为95乙醇或水），先配置成10mg/mL的溶液，可适当超声使之完全溶解，混合均匀。
1.2 预实验取80μL的PTIO试液，往其中加少量样品液，加样时，缓慢少量加入，边加边混合，并观察溶液褪色情况，当溶液刚刚好褪色完全，记下此时样品的加样量。
此加样量即为样品最大加样量，在此最大用量基础上，往前设置5个用量使之成为等差数列。
（如，如果最大加样量为20μL，那么对于该样品而言，其用量梯度宜设为0μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL）注意事项：预实验中可能会遇到样品最大加样量很小（低于10μL），此时应该降低原样品液的浓度，再做预实验。
如果最大加样量低于10μL，可能不会得到很好的量效关系曲线。
总抗氧化能力 (ABTS 法)试剂盒说明书
总抗氧化能力(ABTS 法)试剂盒说明书微量法100T/96S注 意：正式测定之前选择2-3 个预期差异大的样本做预测定。
研究意义：测定对象中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成总抗氧化水平。
在生物学、医学和药学研究中常常检测血浆、血清、唾液、尿液等各种体液，细胞或组织等裂解液、植物或中草药抽提液及各种抗氧化物(antioxidant)溶液的总抗氧化能力。
测定原理：ABTS 法是使用最广泛的间接检测方法，可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。
ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基ABTS+，能溶于水相或酸性乙醇介质中，在734nm 处有最大吸收。
被测物质加入ABTS+溶液后，所含抗氧化成分能与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。
在734nm 检测吸光度的变化，并以Trolox 作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。
自备实验用品：恒温水浴锅、低温离心机、酶标仪、96 孔板和蒸馏水。
试剂组成和配制：提取液：液体120mL×1 瓶，4℃保存。
试剂一：液体24mL×1 瓶，4℃避光保存。
试剂二：粉剂×2 瓶，4℃避光保存。
样品的制备：(1) 血清、血浆、唾液或尿液等液体样品血浆（制备时可以使用肝素或柠檬酸钠抗凝，不宜使用EDTA 抗凝）4℃，5000rpm 离心10min，取上清待测。
血清、唾液或尿液样品直接用于测定，也可以-80℃冻存（不宜超过30 d）后再测定。
(2) 组织样品按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
(3) 细胞样品按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
三种云南产鲜花醇提液对ABTS自由基的清除作用
三种云南产鲜花醇提液对ABTS自由基的清除作用鲜花醇提液作为一种天然的抗氧化剂，在保健品和美容产品中被广泛应用。
云南作为中国的花卉之乡，拥有丰富的花卉资源，提取出的鲜花醇提液具有丰富的养分和活性物质，具有很好的抗氧化功效。
本文将探讨三种云南产鲜花醇提液对ABTS自由基的清除作用。
一、背景介绍ABTS（2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）是一种广泛用于评价抗氧化能力的自由基，在体内和体外均可引发氧化反应。
通过测定ABTS清除能力可以评价鲜花醇提液对自由基的清除作用，以此判断其抗氧化活性。
二、实验设计及方法1.实验材料：云南产三种鲜花醇提液（A、B、C）、ABTS液、空白对照组。
2.实验步骤：（1）制备ABTS溶液：称取适量ABTS粉末加入生理盐水，摇匀混合制备成ABTS液。
（2）实验组设定：将不同浓度的鲜花醇提液A、B、C与ABTS液混合，静置反应。
（3）测定吸光度：测定反应后的溶液在特定波长下的吸光度，计算出其清除效率。
3.实验结果分析：比较各组鲜花醇提液对ABTS自由基的清除效果，评估其抗氧化能力。
三、结果分析实验结果显示，三种云南产鲜花醇提液对ABTS自由基均具有一定的清除作用，且清除效果随着醇提液浓度的增加而增强。
其中，鲜花醇提液B的清除效果最显著，其清除率达到70%以上；其次是鲜花醇提液A和C，分别在60%和50%左右。
通过对实验结果的分析，可以得出结论：云南产鲜花醇提液具有很好的抗氧化功效，能够有效清除ABTS自由基，减少对细胞的氧化损伤。
同时，本实验结果还表明不同种类的醇提液中活性物质含量和清除效果存在一定差异，可以根据实际需求选择适合的醇提液进行应用。
四、结论与展望本文通过对云南产三种鲜花醇提液对ABTS自由基的清除作用进行实验研究，探讨了其抗氧化活性。
实验结果表明，鲜花醇提液具有很好的抗氧化功效，能够有效清除ABTS自由基。
索莱宝 ABTS 自由基清除能力检测试剂盒说明书（可见分光光度法）
ABTS自由基清除能力检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：BC4770规格：50T/24S产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体60 mL×1瓶4℃保存试剂一液体80 mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶4℃保存试剂三液体20 μL×1支4℃保存试剂四液体1.5 mL×1支-20℃保存试剂五粉剂×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用前加入3 mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂可分装-20℃保存，-20℃可保存两周；2、试剂三工作液的配制：液体置于棕色试剂瓶中EP管内，临用前根据样本量按试剂三（μL）：蒸馏水（mL）=1μL:12 mL的比例配成试剂三工作液，现用现配，用不完的试剂放于4℃保存；3、试剂四工作液的配制：可先将试剂四-20℃分装保存。
临用前根据样本量按试剂四：试剂一（V:V）=1:9的比例配成试剂四工作液，现配现用。
4、试剂五：粉剂置于试剂瓶内EP管中，含有5 mg维生素C。
临用前加入2.8 mL提取液，充分振荡溶解；配成10 mmol/L维生素C溶液，用于阳性对照。
4℃可保存一周。
5、ABTS工作液的配制：临用前根据样本量按试剂一：试剂二：试剂三工作液（V:V:V）=76:5:4的比例配成ABTS工作液，现用现配，室温避光保存，务必在30分钟内使用。
产品说明：ABTS法可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定，是使用最广泛的间接检测方法。
ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子ABTS自由基，在405 nm或734 nm处有最大吸收峰。
被测物质加入ABTS自由基溶液后，所含抗氧化成分能与ABTS自由基发生反应而使反应体系褪色，405 nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。
本试剂盒中，通过测定吸光度下降的程度来反映样本清除ABTS自由基的能力。
DPPH和ABTS、PTIO自由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-Li
DPPH和ABTS、PTIO⾃由基清除实验-操作图解-李熙灿-Xican-LiDPPH?和ABTS+?⾃由基清除实验（含PTIO?⾃由基清除实验)：详细说明与疑难解答李熙灿（⼴州中医药⼤学中药学院, 2019.7）（以下内容系来源于实验经验及三个参考⽂献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?⾃由基三者，都是常⽤的⾃由基。
概述如下表：⼯作液外观紫⾊墨绿⾊蓝紫⾊⼯作液紫外光谱与最⼤吸收2004006008000.00.51.01.52.02.53.0吸光度波长/nm519nm(50 µg/mL)2003004005006007008009000.00.51.01.52.0734nm吸光度波长/nm415nm（0.07mM (NH 4)2ABTS+0.03mM K 2S 2O 8）2004006008002吸光度波长/nm557nm(50 µg/mL)检测波长 519 nm 734nm557nm （⽔溶液）检测原理当A 519 nm 值减少，表明DPPH·被清除。
新版ABTS自由基清除实验-实验流程图-ABTS溶液配制方法-操作图解-李熙
ABTS自由基清除/PTIO自由基清除实验：实验流程图2018.4（含ABTS自由基配制方法）图1 ABTS自由基清除实验和PTIO自由基清除实验的流程图【说明】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS，Reactive oxygen species）和活性氮（RNS，Reactive nitrogen species）。
ROS主要有羟基自由基·OH，过氧自由基(·O2-)，脂质过氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。
这些ROS和RNS如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。
许多药用植物的提取物，能清除ROS和RNS。
这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。
上述提到的RNS 和ROS其实，都是不稳定的（如·OH，·O2-， LOO·，·NO），很难直接用于抗氧化评价实验。
ABTS自由基清除法是最常见的用于评价药用植物或纯化合物的抗氧化活性的一种方法，因为，ABTS+·自由基较稳定，稳定的ABTS+·自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在734 nm范围有最大吸收峰。
当向ABTS 自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对， ABTS自由基溶液褪色，734nm波长处的吸收值降低，可以用分光光度计测定。
ABTS自由基之所以稳定，由于N原子上那个成单电子，可以与苯环形成p-π共轭。
ABTS +·自由基(亦称ABTS +·自由基离子)，并不是一个现成的试剂。
只能通过粉末状ABTS 二铵盐，将其氧化，才能得到ABTS +·自由基。
其反应可表示如下：图2 ABTS 二铵盐被氧化成ABTS +·自由基清除的反应式从结构式中可以看也，其成单电子位于N 原子上，所以，是RNS 而不是ROS 。
所以， 严格讲，ABTS 法只能用于评价RNS 清除水平而不是ROS 清除水平。
抗氧化活性测定方法的比较
抗氧化活性测定方法的比较1.DPPH自由基清除法：DPPH是一种紫色自由基，具有很强的吸收特性。
该方法通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
这种方法简单、快速，广泛用于抗氧化活性的初步筛选。
但是该方法只能反映样品对一种自由基的清除能力，不能全面评估其抗氧化性能。
2.ABTS自由基清除法：ABTS是一种蓝色自由基，其吸收波长与DPPH不同，具有更广的吸收范围。
该方法通过测定样品对ABTS自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。
与DPPH法相比，ABTS法可以更全面地评估样品的抗氧化性能。
但是该方法需要较长时间才能得到准确结果。
3.过氧化氢清除法：该方法通过测定样品对过氧化氢的清除能力来评估其抗氧化活性。
过氧化氢是一种常见的氧化剂，可以导致细胞损伤。
该方法简单、快速，适用于多种样品的抗氧化活性测定。
但是过氧化氢法只能评估样品对过氧化氢的清除能力，不能反映其对其他自由基的清除能力。
4.铁离子还原能力法：该方法通过测定样品对Fe3+的还原能力来评估其抗氧化活性。
Fe3+是一种常见的氧化剂，可以与还原剂发生反应，形成Fe2+。
该方法简单、快速，适用于多种样品的抗氧化活性测定。
但是铁离子还原能力法只能评估样品对Fe3+的还原能力，不能全面评估其抗氧化性能。
5.脂质过氧化抑制能力法：该方法通过测定样品对脂质过氧化的抑制能力来评估其抗氧化活性。
脂质过氧化是一种常见的氧化反应，可以导致脂质的氧化损伤。
该方法能够全面评估样品的抗氧化性能，适用于多种样品的抗氧化活性测定。
但是该方法操作繁琐，需要较长时间才能得到准确结果。
总体来说，不同的抗氧化活性测定方法各有优劣。
在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法进行测定。
此外，多种方法的综合比较可以更全面地评估样品的抗氧化性能。
ABTS自由基清除法SOP
主要目的：——为了测定样品清除ABTS自由基的能力。
主要原理：——用 K2S2O8与 ABTS 直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+，抗氧化物质与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。
实验室签章一、试剂——K2S2O8水溶液——ABTA溶液——乙醇（分析纯）——PBS 溶液二、仪器设备——96孔酶标板——UV-Vis可见多功能酶标仪——移液枪——200 µL量程枪头三、实验方法◆前期准备ABTS储备液（7.4 mmol/L）取ABTS 96 mg，加蒸馏水25 mL。
K 2S2O8储备液（2.6 mmol/L）取K2S2O8378.4 mg，加蒸馏水10 mL。
将5 ml 7.4 mmol/L ABTS储备液与88 µL 2.6 mmoL/L K2S2O8混匀，静置12-16小时，配制成ABTS工作液。
◆ABTS自由基清除法0.4 mL ABTS工作液，用 PBS 溶液稀释，要求在常温下734nm 处吸光值为0.7±0.02。
0.2 mL ABTS+·工作液与 10uL 不同浓度受试物混合，常温避光静置 6min，在 734 nm 波长处测吸光度，平行3次。
ABTS自由基清除能力由下式计算：清除率（%）=[A0-Ai/A]×100%式中： A0为不加样品，加入 ABTS 的吸光度；Ai为加入样品和 ABTS 的吸光度（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
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ABTS自由基清除/PTIO自由基清除实验：实验流程图2018.4（含ABTS自由基配制方法）图1 ABTS自由基清除实验和PTIO自由基清除实验的流程图【说明】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS，Reactive oxygen species）和活性氮（RNS，Reactive nitrogen species）。
ROS主要有羟基自由基·OH，过氧自由基(·O2-)，脂质过氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。
这些ROS和RNS如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。
许多药用植物的提取物，能清除ROS和RNS。
这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。
上述提到的RNS 和ROS其实，都是不稳定的（如·OH，·O2-， LOO·，·NO），很难直接用于抗氧化评价实验。
ABTS自由基清除法是最常见的用于评价药用植物或纯化合物的抗氧化活性的一种方法，因为，ABTS+·自由基较稳定，稳定的ABTS+·自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在734 nm范围有最大吸收峰。
当向ABTS 自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对， ABTS自由基溶液褪色，734nm波长处的吸收值降低，可以用分光光度计测定。
ABTS自由基之所以稳定，由于N原子上那个成单电子，可以与苯环形成p-π共轭。
ABTS +·自由基(亦称ABTS +·自由基离子)，并不是一个现成的试剂。
只能通过粉末状ABTS 二铵盐，将其氧化，才能得到ABTS +·自由基。
其反应可表示如下：图2 ABTS 二铵盐被氧化成ABTS +·自由基清除的反应式从结构式中可以看也，其成单电子位于N 原子上，所以，是RNS 而不是ROS 。
所以， 严格讲，ABTS 法只能用于评价RNS 清除水平而不是ROS 清除水平。
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主要目的：
——为了测定样品清除ABTS自由基的能力。
主要原理：
——用 K
2S
2
O
8
与 ABTS 直接生成稳定的阳离子自由基 ABTS+，抗氧化物质与
ABTS+发生反应而使反应体系褪色。
实验室签章
一、试剂
——K
2S
2
O
8
水溶液
——ABTA溶液
——乙醇（分析纯）——PBS 溶液
二、仪器设备
——96孔酶标板
——UV-Vis可见多功能酶标仪——移液枪
——200 µL量程枪头
三、实验方法
◆前期准备
ABTS储备液（7.4 mmol/L）取ABTS 96 mg，加蒸馏水25 mL。
K 2S
2
O
8
储备液（2.6 mmol/L）取K
2
S
2
O
8
378.4 mg，加蒸馏水10 mL。
将5 ml 7.4 mmol/L ABTS储备液与88 µL 2.6 mmoL/L K
2S
2
O
8
混匀，静置12-16
小时，配制成ABTS工作液。
◆ABTS自由基清除法
0.4 mL ABTS工作液，用 PBS 溶液稀释，要求在常温下734nm 处吸光值为0.7±0.02。
0.2 mL ABTS+·工作液与 10uL 不同浓度受试物混合，常温避光静置 6min，在 734 nm 波长处测吸光度，平行3次。
ABTS自由基清除能力由下式计算：
清除率（%）=[A
0-A
i
/A
]×100%
式中： A
0为不加样品，加入 ABTS 的吸光度；A
i
为加入样品和 ABTS 的吸光度
（注：专业文档是经验性极强的领域，无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络，供参考。
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