生物素亲和素系统共53页文档
第19章 生物素-亲合素系统
生物素-亲合素系统及其 在免疫检测技术中的应用
医学技术学院免疫教研室
熟悉：生物素-亲和素系统特点及应
用。
了解：其他。
生物素——亲合素系统 （ biotin-avidin system,BAS）
生物素与亲合素是一对具有高度亲合力 的分子，其结合迅速、专一、稳定。 既能偶联抗原、抗体等生物活性物质， 又能被酶、荧光素、胶体金等示踪物标 记，具有桥联抗原抗体系统和示踪物指 示系统的作用。
4.在生物素分子中可连接生物大分子(Ag/Ab) 的部位是(
D
)
A.戊酸侧链
B.咪唑铜环 C.噻吩环
E.苯环
D.侧链末端羧基
5.1mg亲和素的活性单位是( C )
A.3-5U D.15-18U B.5-8U E.20-30U C.13-15U
6.1mg链霉亲和素的活性单位是( D ) A.5U B.8U C.15U D.18U E.20U
7.生物素-亲和素系统中ABC的含义是( E )
A.生物素-抗体 B.生物素-亲和素抗体复合物
C.生物素-酶复合物
D.亲和素-酶复合物
E.亲和素-生物素化酶复合物 8.不属于BAS特点的是（ D ） A.特异型好 B.敏感性高 C.稳定性好 D.两者结合易受酸碱条件的影响 E.实用性强
端羧基经化学修
了解
饰后制成带各种
活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生物)
了解
生 物 素 活 化
活化生物素 易与抗原、 抗体偶联形 成生物素化 标记物
标记蛋白质氨基的活化生物素
标记蛋白质醛基的活化生物素
标记蛋白质巯基的活化生物素
标记核酸的活化生物素
第二节
生物素亲和素
生物素-亲合素系统(BAS)的特点
适用性广泛：BAS的多级放大作用，以及既可
偶联生物大分子，又可连接标记材料，使BAS不 仅用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测 及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各 类反应体系中反应物的分离、纯化。
其他：可制成通用试剂（如生物素化二抗等）；
反应试剂可高度稀释，特别是与一抗偶联使用可 大幅减少一抗用量，降低实验成本；实验所需时 间不长。
O
Avdin
Schiff碱ຫໍສະໝຸດ O ONSAvidi n
H2O
O O
N
OH
OH
SAvidin
第五部分 生物素-亲合素系统
生物素-亲合素系统
生物素与亲合素之间结合的亲合力高、特异性强 生物素与亲合素各自均可以与各型大小分子结合， 以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优 越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫 分析技术领域中，尤其为标记免疫检测自动化分 析做出了极大的贡献
生物素-亲合素系统(BAS)的特点
灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/
抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素结合部位，可同 时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上，因此 ，BAS具有多级放大作用，反应的灵敏度高。
稳定性高和特异性强：AV/SA与生物素结合的
亲和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者的结合呈高度专 一性和不可逆性，且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶、有机溶剂 以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合。因此，BAS稳定性 高，特异性强。
生物素化的抗体
+A
+A
BAS的基本类型及原理-BA 法
BA法（标记亲和素-生物素法）
生物素亲和素
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP
亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
生物素亲和素系统
亲和素 链霉亲和素 生物素 生物素衍生物及配体连接 生物素亲和素系统的应用 链霉亲和素磁珠制备 链霉亲和素包被板制备 生物素连接抗原/抗体实验 生物素—链霉亲和素系统在项目的试验
郑州安图生物 2008年
亲和素(Avidin)
一、来源： 亲和素主要存在于鸡蛋清中，可通过离子交换和分子筛方法提 纯，从1L蛋清中可提取纯亲和素15-25mg。亲和素可以在PH 5-7的高盐 缓冲液中结晶出来，但没有报道在等电点附近的缓冲液中可以结晶析出。
三、活性：SA 和AV 的活性都是结合生物素的量来表示，1mg蛋白结合生物 素的微克数就是该蛋白的活性单位。从分子量计算，AV的最高活性是 15u，完整SA是14u，核心SA 的分子量较低，最高活性可达l8u，但由于 1分子蛋白都结合4分子生物素，故它们的应用效果相同。
AV的活性基团是肽链中的4个色氨酸残基，SA 的活性基团也是肽链中的色 氨酸残基，当用对色氨酸特异的Koshlands试剂处理后，SA就丧失了和生 物素结合的能力。最近实验又显示，酪氨酸残基对蛋白的活性也有作用， AV的每条肽链中只有一个酪氨酸残基(Tyr)，硝基苯磺酰氟(Nbs-F)只要平 均修饰它的0.5个Tyr，就可使其完全失去活性。SA的每条肽链中含6个Tyr 残基， Nbs-F也修饰其中的一半即3个可便SA失去结合生物素活性。 四：等电点： PH= 6.0
温度、盐的影响：游离亲和素在85℃就会失活，但是生物素-亲和素复合物可 在短时间内耐受132 ℃的高温。生物素-亲和素复合物对热的耐受能力依赖于 盐的存在，在没有盐存在时， 100 ℃10分钟约有88%的生物素-亲和素复合物 解离，但在有盐存在的条件下，需120 ℃15分钟复合物才能完全解离。
PH、变性剂影响：生物素-亲和素复合物在PH 2-13或8M盐酸胍（中性）条件 下不会受到影响，并可以用硫酸锌沉淀，但是沉淀出的复合物用70%蚁酸处 理1小时会使亲和素不可逆失活。
生物素亲和素
生物素亲和素生物素亲和素是一类非常有用的分子，它们能够与特定的蛋白质结合，用于生物体内的过程和分子交互。
在最近的几十年，生物素亲和素的工作原理和作用的研究已经取得了显著的成就。
这篇文章将介绍生物素亲和素的来源、结构特征、结合模式和生物学功能，并对其在分子互作中的作用做出评价。
一、生物素亲和素的来源生物素亲和素是生物体中一类常见的分子，主要存在于植物，动物和微生物中。
在植物中，它们主要发现于汁液和植物细胞外层，是植物抗病能力的重要组成部分。
在动物体中，它们主要存在于表皮和血液，参与多种免疫反应。
而在酵母中，生物素亲和素主要由细菌提供，从而帮助酵母附着到其他表面上。
二、生物素亲和素的结构特征生物素亲和素是一类结构简单的分子，它们由一个非常小的亲和素结构和一个相应的生物素结构组成。
亲和素部分由一个结构稳定的细胞膜吸附物，其由亚硫酸盐和脂肪酸构成，从而与相应的蛋白质结合。
生物素部分主要由糖苷和酰胺构成，其中包含一个氨基酸序列，这个氨基酸序列是它们的特异性结合的关键。
三、生物素亲和素的结合模式生物素亲和素可以与许多类型的蛋白质结合，其结合模式可以分为有特异性和非特异性两种。
与特异性结合的生物素亲和素可以与蛋白质的特定部位亲和结合，一旦结合，它们就不会被其他物质所分解。
非特异性结合的生物素亲和素则可以与蛋白质的任何部位亲和结合，它们可以被其他化学物质分解。
四、生物素亲和素的生物学功能生物素亲和素对生物体有重要的作用，它们可以参与多种生物学过程。
比如，它们可以帮助细胞活动、促进免疫反应和代谢，甚至可以抑制病原体的生长和繁殖。
生物素亲和素还能够改变细胞表面的表现，从而也可以影响其他细胞的发育过程。
五、评价生物素亲和素已经成为生物学中的一项重要的研究对象，它们可以解释许多生物体内的分子互作，并可以作为潜在的生物药物靶点。
未来，研究者们可以继续研究这类分子，以期更好地了解它们在机体功能调节中的作用，并利用它们来改善人类的健康。
生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用
生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用目录CONTENTS第一节第二节第三节生物素的特性亲合素和链霉亲合素的特性生物素与亲合素结合反应的特点第四节BAS在免疫检测技术中的应用概述概述➢生物素-亲合素系统（biotin-avidin system，BAS）是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。
➢生物素与亲合素间高度亲合力，结合迅速、专一、稳定。
➢既能偶联抗原、抗体、核酸等大分子生物活性物质，又能被酶、荧光素、胶体金、化学发光物及放射性核素等各种示踪物标记。
➢1个亲合素与4个生物素化分子结合及1个大分子物质能与多个生物素结合特点，使BAS 产生多级放大效应，极大地提高了免疫检测和分析的敏感性。
➢目前，BAS已广泛应用于整个生物学领域，是微量抗原与抗体定性、定量检测及定位观察研究的常用技术，也是生物医学研究工作中最具使用价值和发展前途的技术之一。
生物素的特性•生物素（biotin ，B ）为含硫水溶性维生素，又称维生素H 或辅酶R ；•动植物组织中广泛分布，卵黄（α型）和肝（β型）含量高，亦可人工合成。
•分子式：C10H16O3N2S ；MW ：244.31 Da 。
•既能与抗原、抗体大分子生物活性物质结合，又能与各种示踪物（如酶、荧光素等）结合。
一、生物素理化性质Ⅰ环为咪唑酮环，与亲合素结合部位；Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构。
生物素侧链末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物—活化生物素。
二、活化生物素活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物。
蛋白质氨基醛基巯基核酸的活化生物素标记的活化生物素CNH NH CH CH 2CH CH OS (CH 2)4COOH NH 2C O CH 2CH 2C O NH OH C O O NC O OC CH 2CH 2EDC 生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS ）ⅠⅡ1. 标记蛋白质氨基的活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸的氨基形成肽键。
(完整word版)初级检验技师临床免疫学和免疫检验(2017年讲义)第十一章生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
（四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。
通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。
2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。
（三）标记注意事项1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。
临床免疫学检验-课件-第19章 生物素-亲合素系统及其在免疫检测技术中的应用
标记蛋白质氨基与醛基的活化生物素
醛基
2个6-氨基已糖分子
氨基 长臂
2. 标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物用于 标记偏酸性糖蛋白 。
肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸氨基连接 后与无水肼反应而成BCHZ还可标记氨基。
3. 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB) ：能特异地与 蛋白质巯基结合的活化生物素。 4. 标记核酸的活化生物素 (1)光敏生物素(photobiotin)： 侧链上连接的芳香基叠氮物基团，经光照后变为芳 香基硝基苯，与腺嘌呤N-7位氨基结合，形成生物素化 的核酸探针，用于DNA或RNA的标记。
(2)生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）：作为 TTP的结构类似物，可ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用缺口移位法通过DNaseⅠ 和DNA聚合酶Ⅰ的作用而掺入到双链DNA中。
(3) BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4位 氨基结合，形成生物素标记的核酸探针，但对碱基 配对有影响。（不常用）
生物素标记蛋白质特点
亲合素(AV)
链霉亲合素(SA)
结构 分子量
pI 结合位 生物素
Ka 活性U
四亚基糖蛋白
68 kD 10.5 色氨酸
4 1015 13～15
四肽链蛋白 无糖基
65 kD 6 色氨酸
4 1015 15～18
SA的pI低，表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异 性结合远低于AV，目前以SA标记的酶结合物更为常用。
1.活化生物素通过侧链与蛋白分子连接； 2.一个蛋白分子可被多个生物素标记-多价； 3.可标记生物活性大分子，如抗原、抗体。 BNHS多标记抗体，BHZ则多标记偏酸性抗原，标记后 抗原、抗体活性不变； 4.可对示踪物标记，碱性磷酸酶标记后活性将 降低。
生物素亲和素系统放大作用的机制
生物素亲和素系统放大作用的机制生物素亲和素系统是一种常用的蛋白质标记技术，它可以将生物素标记的蛋白质与亲和素结合，从而实现对蛋白质的纯化、检测和定位等功能。
生物素亲和素系统的放大作用是指通过增加亲和素的结合能力和生物素标记的数量，提高生物素亲和素系统的灵敏度和特异性，从而实现更加精确的蛋白质分析和研究。
生物素亲和素系统的放大作用主要包括以下几个方面：1. 亲和素的结合能力亲和素是一种具有高度亲和力的小分子，它可以与生物素结合形成稳定的复合物。
在生物素亲和素系统中，亲和素通常被固定在固相材料上，如琼脂糖、磁珠等，从而实现对生物素标记的蛋白质的选择性捕获。
亲和素的结合能力越强，就能够更加有效地捕获生物素标记的蛋白质，从而提高生物素亲和素系统的灵敏度和特异性。
2. 生物素标记的数量生物素标记是生物素亲和素系统的核心部分，它可以将生物素标记的蛋白质与亲和素结合，从而实现对蛋白质的选择性捕获和检测。
生物素标记的数量越多，就能够更加有效地增强生物素亲和素系统的灵敏度和特异性。
在实际应用中，可以通过增加生物素标记的浓度或者使用多个生物素标记来增加生物素亲和素系统的放大作用。
3. 亲和素的密度亲和素的密度是指亲和素在固相材料上的分布密度，它可以影响生物素亲和素系统的灵敏度和特异性。
在实际应用中，可以通过调节亲和素的密度来实现生物素亲和素系统的放大作用。
一般来说，亲和素的密度越高，就能够更加有效地捕获生物素标记的蛋白质，从而提高生物素亲和素系统的灵敏度和特异性。
4. 检测方法的选择生物素亲和素系统的放大作用还可以通过选择合适的检测方法来实现。
常用的检测方法包括Western blot、ELISA、荧光检测等。
在实际应用中，可以根据需要选择合适的检测方法，从而实现生物素亲和素系统的放大作用。
生物素亲和素系统的放大作用是通过增加亲和素的结合能力和生物素标记的数量，调节亲和素的密度以及选择合适的检测方法来实现的。
生物素亲和素系统的放大作用可以提高生物素亲和素系统的灵敏度和特异性，从而实现更加精确的蛋白质分析和研究。
亲和素和生物素系统
标记亲和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB）
• 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可 结合多个HRP
• 将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体 分子可连接多个生物素分子
• 细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体 结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素 上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标记。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲 和纯化技术和酶标技术，LSAB 法敏感性更 高、背景更清晰。
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生活
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医疗
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• 亲和素有4 个亚单位，它具有4 个同生物素 亲和力极高的结合位点，因其能使生物素 失活，故又称抗生物素。
链霉亲和素
• 链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉 菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量 60000，且不含糖链。
• 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物 素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是 一种更完美的生物素结合蛋白。因为它很 少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点， 避免了组织中的非特异性染色。
• ABC 复合物不能饱和，即亲和素上的4 个结合位 点最多允许3 个位点与生物素化酶结合，留1~2 个位点与生物素化二抗结合。
• 抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC 复 合物结合，最终形成巨大复合体，因该复合体网 络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
生物素-亲合素系统及其应用
过氧化物酶 （PO）
生物素-PO
亲和素
亲和素-生物素-PO
（2）ABC法反应原理
一抗 生物素化的二抗
生
固定化抗原
ABC法中过氧化物酶常用辣 根过氧化物酶，通过它与底 物的显色程度来判断抗体或 抗原含量并对其进行标记。 此法广泛应用于免疫组织化 学及酶联免疫吸附等技术中
显色的反ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ混合物
过 氧 化 物 酶 底 物
一、概述
生物素－亲合素系统（Biotin-Avidin—System，BAS） 是70年代末发展起来的一种以生物素和亲合素的特异结 合反应为原理的新型生物反应放大系统。随着各种生物 素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于分子生物学各 领域之中。 1979年Guesdon利用生物素和亲合素间具有高度亲合力 的特点，建立了标记亲合素和生物素法与桥联亲合素— 生物素技术。 1981年Hsu首次报告了改进的亲合素—生物素—过氧化 酶复合物法（ABC法）。
近年大量研究证实，生物素—亲合素系统几乎可与目前 研究成功的各种标记物结合，如酶、荧光素、同位素、 凝集素、铁蛋白、核酸等。 生物素—亲合素已成为目前广泛用于微量抗原、抗体定 性、定量检测及定位观察研究的新技术。
二、原理
与亲合素结合
生物素
生物素又称维生素H，可与多 种标记物如酶、荧光素、同位 素、凝集素、铁蛋白、核酸等 结合。这些生物活性物质在生 物素化后，其活性不会受到显 著影响。如抗体分子经生物素 化后，其结合抗原的活性不受 影响。同样多种酶结生物素化， 其催化力也保持不变或稍有降 低。
生物素化DNA探针的应用
亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反 应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。 且由于多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受 到显著影响，故而二者在结合反应时具有的多级放大作 用。