α-淀粉酶的研究及应用[文献综述]

毕业论文文献综述

生物工程

α-淀粉酶的研究及应用

淀粉酶是一种水解酶，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷键的酶。根据作用的方式可分为α-淀粉酶（EC3.2.1.1.）与β-淀粉酶（EC3.2.1.2.）。因α-淀粉酶作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1,4糖苷键，生成糊精和还原糖，而β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-葡聚糖链生成分子量比较大的极限糊精，且α-淀粉酶分布更广泛，已是一种十分重要的酶制剂，α-淀粉酶大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、和医药行业等，它占了整个酶制剂市场份额的25%左右[1]。目前工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。但随着社会需求的增大，工业生产对α-淀粉酶的需求量也越来越大，急需寻找满足生产需要的具新型特征的酶制剂。因此本文主要讨论以α-淀粉酶为代表的淀粉酶的研究及应用。

1 α-淀粉酶的研究

1.1 α-淀粉酶分离纯化方法的研究

高纯度α-淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，可用于研究酶反应机理和测定生化反应平衡常数等。分离纯化α-淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度的α-淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。盐析沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析和电泳等，是蛋白质分离纯化的主要方法。用吸附树脂法、40%乙醇从α-淀粉酶发酵液中分离高活性α-淀粉酶，用离子交换法和透析法对初酶液进行脱盐处理，最后用DEAE－纤维素纯化α－淀粉酶，所得酶活力为60153U/g，酶活性回收率为66.04%[2]。另通过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析等方式，从白曲霉菌A. kawachii的米曲粗抽出液中，分离纯化到两个耐酸性α-淀粉酶比活性极高的组分。用疏水吸附法和DEAE-cellulose(二乙氨基乙基-纤维素)柱层析法分离纯化α-淀粉酶，所得酶活力为110 000 U/g。用硫酸铵沉淀和垂直板制备凝胶电泳对地衣芽孢杆菌A. 4041耐高温α-淀粉酶进行分离纯化，得到3种电泳均一的组分。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热耐酸性α-淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸性α-淀粉酶，纯化倍数为11. 7，活力回收率为29. 8%[3]。但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统PEG/磷酸盐分离

纯化α-淀粉酶，增加PEG浓度有助于酶富集上相。同样用PEG/磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温α-淀粉酶，分配系数及回收率分别为4. 8和87%[4]。PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和硫酸铵对酶活力具有保护作用，利用PVP/硫酸铵液-固萃取体系分离提取耐高温α-淀粉酶，酶活力回收率高，体系成相时间短，操作时不需双水相体系所用的分液漏斗和离心操作，用倾液法即可实现相分离，因此，与双水相体系相比，液-固萃取体系具有更大的优越性[5]。

1.2 α-淀粉酶活力测定方法的研究

测定α-淀粉酶活力的方法已不少于200种，其共同之处是，被测样品与某种多糖底物溶液保温反应后测之，很难标准化。碘-淀粉比色法测定α-淀粉酶活力的优点是，操作简便，试剂便宜，比色精确、敏感。因此，成为受推荐的淀粉酶活力测定方法。盛勤芳[6]提出要提高糖化型淀粉酶活力测定的准确性须注意酶反应时间的选择和酶的控制。严控制测定时间十分重要，为了保证10min内（初速度时间范围内）50℃，底物（淀粉液）必须预保温5-10min。为了能得到准确的测定结果，在实验设计中，对空白与样品滴定值之差（B-A）一般控制在1.0-2.6ml；若（B-A）小于1.0ml，表明酶浓度过小；若（B-A）大于2.6ml，表明酶浓度偏高。（B-A）这个值可以通过调整酶的稀释倍数，使之控制在1.0-2.6ml范围内。

1.3耐高温α-淀粉酶的研究

大多数淀粉酶生产的研究是以25-37℃[7，8]的温度范围的中温菌开展的。但是为了节约生产成本，α-淀粉酶最好在高温糊化（100-110℃）和液化（80-90℃）过程中保持活性，因此有必要寻找耐更高温度的耐高温α-淀粉酶。

生产耐高温α-淀粉酶的菌种有地衣芽孢杆菌、枯草杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝聚芽孢杆菌、酸热芽孢杆菌以及普通高温放线菌等。解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌是最常用在温度37-60℃[9]生产淀粉酶的芽孢杆菌。海洋红嗜热盐菌，作为一种海洋嗜热菌产生α-淀粉酶最高耐热温度为61℃[10]。用随机整合法在地衣芽孢杆菌中表达了耐高温α-淀粉酶基因，筛选出的阳性菌中α-淀粉酶基因表达水平比供体菌提高了20倍[11]。对超嗜热菌强烈火球菌的α-淀粉酶PFA基因序列进行密码子优化在巴斯德毕赤酵母中高效表达，得到α-淀粉酶活力最高为220 U/L[12]。

1.4耐酸性α-淀粉酶的研究

目前，国内外市场中常用的淀粉酶为中温、高温以及碱性α-淀粉酶，在酸性条件下，其酶活性降低很明显，甚至失去活性。随着我国淀粉质原料深加工工业的发展，工艺条件的不断改变，一些淀粉原料深加工工艺需要在较低的pH值条件下进行。所以，开发新型耐酸性α-淀粉酶迫在眉睫。

自1963年日本学者首次发现耐酸性α-淀粉酶以来，能产生耐酸性α-淀粉酶的微生物大多为芽

孢杆菌和曲霉。从酒曲中选育得到的嗜酸性的黑曲霉产酶菌株Tx-78，通过液体发酵，酒精沉淀以及二次离子交换层析得到最适pH为4. 0，最适反应温度为70℃，具有良好的耐酸性和热稳定性的耐酸性α-淀粉酶制剂[13]。蔡恒等[14]把α-淀粉酶的基因改造后，克隆到穿梭质粒pBE2中，构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT，含有pBSA T的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外，分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性。

2 淀粉酶的应用

2.1 在食品工业中的应用

各种酶制剂在食品工业中的应用已有上百年的历史，最近几十年α-淀粉酶广泛地应用于焙烤工业中α-淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大，纹理疏松；提高面团的发酵速度;改善面包心的组织结构，增加内部组织的柔软度；产生良好而稳定的面包外表色泽;提高入炉的急胀性；抗老化，改善面包心的弹性和口感；延长面包心储存过程中的保鲜期。

目前，焙烤工业使用的α-淀粉酶主要来自大麦麦芽、真菌和细菌。1955年，美国批准真菌α-淀粉酶作为面包添加剂。1963年，英国证实了它们的安全性[15]。现在，α-淀粉酶已经在全世界范围内使用。

2.2 在造纸工业中的应用

淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉，由于造纸施胶过程中要保持淀粉乳的粘度，压扎机也要根据所造纸的级别来调整施胶的粘度，而且天然淀粉的粘度较高需经处理降低其粘度后才能用于表明施胶，因此需要用α-淀粉酶间歇式或连续降解淀粉来调整淀粉乳的粘度。

2.3 在清洁剂生产中的应用

酶是现代高效清洁剂的成分之一。酶在清洁剂中最大的功能就是使清洁剂更温和无害。早期的自动洗碗机的清洁剂非常粗糙，容易在进食时对人体造成伤害，而且对陶瓷、木质餐具也会造成损害。而将酶制剂用于清洁剂以后，可以在较低的清洗温度下就到达很好的清洗效果。1975年，α-淀粉酶开始用于洗衣粉中。现在，几乎90%以上的液体清洁剂中都含有α-淀粉酶[16]。

2.4在医药行业中的应用

从最早的J. Takamine博士第一个使用米曲霉进行α-淀粉酶工业生产，这一淀粉酶被称之为塔卡淀粉酶作为一种助消化剂开始，淀粉酶在医药行业的应用主要是作为助消化剂[17]。黑曲霉α-淀粉酶因具有耐酸性，适用于制造助消化的药物，开发适合于胃酸性环境(pH2. 0左右)的耐酸性α-淀粉酶，用于制备消化助剂，将会使医疗效果更为有效[18]。另外分析血链球菌群中的细菌与α-唾液淀粉酶的结合能力，可有效鉴定不同血链球菌群中各菌株。研究唾液α-淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系，