聚合酶链反应技术(PCR)
PCR反应需要的条件
PCR反应需要的条件PCR（聚合酶链反应）是一种基因分析技术，可以在短时间内扩增DNA片段。
PCR 反应需要以下条件来成功进行：1. 反应液的准备•DNA模板：PCR反应需要一个DNA模板，其包含了要扩增的目标片段。
•引物：引物是设计用于扩增DNA片段的短DNA序列。
PCR反应通常需要两个引物，它们定位于目标DNA片段的两端。
•DNA聚合酶：PCR反应需要一种DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。
DNA聚合酶能够识别引物，并在其基础上合成新的DNA链。
•反应缓冲液：反应缓冲液提供了适合PCR反应的环境条件，包括适宜的pH值和离子浓度。
2. 温度控制PCR反应需要通过不同的温度来实现扩增的不同步骤：•Denaturation（变性）：将PCR反应混合液加热至94-98℃，使DNA双链解离成两条单链。
•Annealing（退火）：将反应温度降至45-70℃，使引物与目标DNA序列互相结合。
•Extension（延伸）：将反应温度升至72℃，DNA聚合酶在此温度下能够合成新的DNA链。
这个温度循环通常会重复多次，以实现DNA的指数级扩增。
3. 去污剂PCR反应需要一个无污染的环境。
在实验过程中，使用去污剂来处理实验用具、工作台和实验室空气，以减少DNA污染的可能性。
4. 优化条件PCR反应的成功与否还取决于一系列参数的优化，包括： - 引物的浓度：引物的浓度会影响到PCR的特异性和产物产量。
- 温度梯度试验：通过在一定范围内尝试不同的温度，可以确定最适合PCR反应的温度。
- 反应时间：PCR反应的时间需要根据所扩增的DNA片段的长度和目标浓度来确定。
综上所述，PCR反应需要适当的反应液、准确的温度控制、无污染的实验环境，以及对实验条件的优化。
只有在这些条件的合理控制下，才能成功地进行PCR反应，并扩增所需的DNA片段。
pcr知识点总结归纳
pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。
PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。
PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。
PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。
PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。
PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。
下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。
一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。
PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。
2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。
3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。
通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。
二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。
1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。
2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。
3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。
4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。
聚合酶链式反应(PCR)技术
实验十聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是美国Cetus公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis于1985年发明的一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。
该技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。
使用PCR扩增技术，可以将极微量的靶DNA片段特异地扩增上百万倍，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。
PCR技术具有敏感度高、特异性强、快速简便等优点，在医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。
一、实验目的了解PCR技术的原理，学习建立PCR反应体系的原则以及掌握PCR操作的方法。
二、实验原理PCR技术模拟DNA的天然复制过程，在体外对DNA的特异序列进行扩增，从而获得大量的同一序列。
与扩增的特异性密切相关的因素是与待扩增的特异序列两端互补的两个寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。
在含有模板、引物、聚合酶以及其他成分的反应体系中进行以下反应：变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
退火：使溶液温度降至50℃-60℃，模板DNA与引物按碱基互补配对原则结合。
延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，催化反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）按5′→3′方向和成互补DNA。
上述3步为一个循环，经历高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
每经过一个循环，样本中的DNA量增加一倍；新一轮循环以新形成的链和原模板链作为模板，经过25-30个循环后DNA可扩增倍106-109。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、4种dNTP 混合物、MgCl2、引物、耐热Taq DNA聚合酶。
三、实验试剂及仪器1. 10×PCR buffer2. 引物3. DNA模板4. MgCl25. 4种dNTP混合物6. Taq DNA聚合酶7. PCR仪、凝胶成像系统、电泳系统四、实验方法1.2.反应体系混匀，离心；3.PCR扩增94℃变性1分钟36℃退火1分钟72℃延伸1分钟35-40 cycles4.72℃延伸反应5分钟。
聚合酶链反应技术在临床诊断中的应用
聚合酶链反应技术在临床诊断中的应用简介聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）是一种用于复制DNA序列的技术，可以在短时间内扩增少量的DNA样品，被广泛应用于临床诊断、基因工程等领域。
PCR技术的原理基于DNA的复制能力，采用DNA聚合酶酶解、引物扩增、芯片分析等技术，可以快速诊断出各种疾病。
本篇文章将介绍PCR技术在临床诊断中的应用，以及其优缺点。
PCR技术在临床诊断中的应用PCR技术可以用于快速检测许多疾病的标记物，如肿瘤标记物、传染病标记物等。
在临床上，PCR技术被广泛应用于快速准确诊断疾病、分子诊断和治疗流程中。
1. 传染病检测PCR技术在传染病检测中可以提高检测速度、灵敏度和特异性。
通过PCR技术检测病菌DNA或RNA，可以在病人感染后的短时间内，准确检测出病原体，如肺结核、流感、病毒性肝炎等传染病。
与传统的检测方法相比，PCR技术的检测结果更加可靠，能够避免虚假阳性或阴性的影响，提高了诊断准确性。
2.遗传病检测PCR技术在遗传病检测中可以通过扩增特定基因区段的方法，检测患者是否携带有致病基因突变，包括：遗传性失听症、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种遗传病。
PCR技术使得医生可以在患者出现症状前就进行诊断，为早期预防和治疗提供了更加可靠的科学依据。
3. 肿瘤检测PCR技术在肿瘤检测中可以检测出特定肿瘤相关基因和基因突变，如白血病、乳腺癌、早期子宫内膜癌和黑色素瘤等。
与传统的检测方式相比，PCR技术可以在较短时间内完成诊断，并对肿瘤的类型和治疗方案进行评估，有利于肿瘤治疗的个体化。
PCR技术的优缺点1. 优点（1）快速：PCR技术只需要数小时就可以得到具有高灵敏性和特异性的评估结果。
（2）灵敏：PCR技术可以扩增极小量的DNA，并能够检测数量几乎无限制的目标基因组。
（3）特异性：PCR技术利用引物定向扩增目标DNA，可以避免与非目标的DNA序列结合而误诊的风险。
pcr技术的原理与应用和评价
PCR技术的原理与应用和评价1. PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR技术主要涉及以下步骤：1.变性：加热DNA模板，使其双链DNA解链，分离成两条单链DNA。
2.退火：降低温度，使引物结合到目标DNA序列的两端。
3.延伸：加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），引物与模板DNA互补碱基配对，生成新的DNA链。
4.循环反应：重复以上步骤，使DNA的数量呈指数级增加。
PCR技术的关键在于引物的选择和反应的条件控制，引物应为目标DNA序列的互补序列，反应条件如温度、时间和酶的浓度要根据具体情况进行优化。
2. PCR技术的应用PCR技术具有广泛的应用领域，主要包括以下几个方面：2.1. 基因检测PCR技术可以用于检测和诊断遗传病、感染病以及肿瘤等疾病。
通过PCR扩增患者的DNA片段，并使用特定标记物进行检测，可以检测出目标基因的突变或存在。
2.2. DNA克隆PCR技术可以用于快速、准确地扩增特定DNA序列，提供大量的DNA片段用于克隆。
通过PCR扩增目标基因的DNA片段，可以得到足够多的DNA用于进一步的实验分析。
2.3. 基因测序PCR技术可以用于DNA的测序。
通过在PCR反应中加入低浓度的二进制缺陷错误生成的dNTPs，可以在扩增过程中引入随机的终止碱基，从而在PCR产物中生成不同长度的DNA片段。
通过对这些片段进行分析，可以确定DNA序列。
2.4. 基因工程PCR技术在基因工程中起着重要作用。
通过PCR扩增目标基因的DNA片段，并将其与其他基因片段进行连接，可以构建具有特定功能的DNA序列，用于基因表达和研究。
3. PCR技术的评价PCR技术具有许多优点，但也存在一些局限性，下面是对PCR技术的评价：3.1. 优点•高灵敏度：PCR技术可以在极低的起始DNA浓度下进行扩增，具有极高的灵敏度。
•高特异性：引物的选择保证了PCR只扩增目标DNA序列，具有高特异性。
请简述PCR的原理及应用
PCR的原理及应用1. PCR的原理PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA 片段的基因技术。
其基本原理是通过逐渐增加DNA片段的数量，使之达到可以检测的水平。
PCR的核心步骤包括三个温度循环：变性（denaturation）、退火（annealing）和延伸（extension）。
•变性：将DNA双链分离成单链，通常在95℃下进行，这个步骤会导致DNA链断裂。
•退火：在较低的温度下（通常在50-65℃之间），引入特定的引物（primers），使其与DNA片段的末端互补连接。
引物是短的DNA序列，能够识别特定的DNA片段。
•延伸：借助DNA聚合酶（DNA polymerase）的作用，在适合其工作的温度下（通常在72℃），DNA聚合酶沿着DNA模板链在引物的引导下合成新的DNA链。
这样，每个循环都会生成两倍于初始DNA片段数的DNA片段。
PCR通常需要进行多个循环，每个循环的结果都是上一个循环的DNA片段数量的两倍。
由于指数级的扩增，几个循环之后，初始数量非常少的DNA片段就可以被扩增到足够多的数量，以便进行后续分析。
PCR中的关键因素包括引物的设计和选择、DNA聚合酶的选择以及PCR反应体系的条件设置等。
正确的引物设计和选择可以确保PCR扩增特定的DNA片段，而DNA聚合酶的选择和PCR反应体系的条件设置会影响PCR的效率和特异性。
2. PCR的应用PCR技术已经广泛应用于许多领域，其应用范围不断扩大。
以下是PCR技术的一些常见应用：2.1. 遗传病的诊断和筛查PCR技术可以用于遗传病的诊断和筛查。
通过设计引物，可以扩增特定基因的DNA片段，并进行后续的序列分析和突变检测，以确定是否存在遗传病相关的突变。
2.2. 基因工程和转基因研究PCR在基因工程和转基因研究中起到了关键作用。
它可以用于克隆目的基因，构建基因表达载体，并将目的基因导入到目标细胞中。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增特异性DNA片段的技术。
经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
一、PCR基本原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR扩增靶DNA的过程类似于体内DNA的半保留复制，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
利用人工合成的一对寡核苷酸引物，分别与待扩增DNA片段的两侧翼序列互补，在DNA聚合酶催化下，以靶DNA序列为模板，四种dNTP为原料，经过高温变性、低温退火和中温延伸“三步曲”的循环，使靶DNA片段经过30个循环周期后达到百万倍的扩增。
PCR技术
30
（3）GC的含量 GC的含量
一对引物的GC含量和Tm值应该协调， 引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。 G+C一般占40-60%。 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T） 可估计 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计 引物的Tm值 引物的Tm值。
31
（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端 ）两引物间避免有互 序列，尤其避免3’端 的互补 的互补重叠。 一般来讲，引物自身连续互 一般来讲，引物自身连续互补碱基不能 超过3个，一对引物间也不易多于四个连续 个，一对引物间也不易多于四个连续 碱基的互补 碱基的互补性。
21
三、PCR的反应 三、PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的 作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中 温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的 基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使 基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙 锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA带。
4
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA 特定DNA片段 DNA片段
1983年
Mullis的构思 Mullis的构思
5
94℃变性
5050-65℃退火
XX℃延伸
6
DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，缺点： ①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每 次循环都要重新加入。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生 模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异 性较差，合成的DNA片段不均一。 由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变 性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完 成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序 添了不少困难。
聚合酶链反应的原理和过程
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的原理和过程1. 引言聚合酶链反应（PCR）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR的原理基于DNA的复制过程，通过重复进行一系列的温度变化和酶催化反应，使得DNA模板序列得以扩增。
PCR技术的发展极大地促进了基因组学、遗传学、医学诊断和犯罪学等领域的研究。
2. PCR的基本原理PCR技术借助于DNA聚合酶这个酶来实现DNA片段的扩增。
其基本原理可以概括为三个步骤：变性、退火和延伸。
2.1 变性首先，在高温条件下（通常为94-98摄氏度），将待扩增样品中的双链DNA解链成两条单链模板。
这一步被称为变性（Denaturation），其目的是打破氢键连接，使双链DNA分离成两条单链。
2.2 退火接下来，在较低温度（通常为50-65摄氏度），通过引入一组特异性的引物（即寡核苷酸引物，通常为20-30个碱基），使其与目标DNA序列的两端互补结合。
这一步被称为退火（Annealing），其目的是将引物定位在待扩增的DNA序列上。
2.3 延伸最后，在适宜温度下（通常为72摄氏度），加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），使其沿着引物向3’端延伸，合成新的DNA链。
这一步被称为延伸（Extension）或扩增，其目的是合成与模板DNA相对应的新链。
通过重复进行上述三个步骤，PCR技术可以在相对短的时间内从少量起始DNA扩增出大量特定片段的DNA。
3. PCR反应体系PCR反应体系由以下几个关键组分组成：3.1 DNA模板PCR反应需要待扩增的DNA片段作为模板。
模板可以是从细胞提取得到的基因组DNA、cDNA、质粒等。
3.2 引物PCR反应需要两条引物，分别位于待扩增序列的两端。
引物是由碱基组成的短链RNA或DNA分子，具有与待扩增序列互补的碱基序列。
引物的设计十分重要，需要确保其与待扩增序列的特异性结合，避免与其他非目标DNA结合。
pcr三个步骤
pcr三个步骤聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，它可以在短时间内扩增DNA片段。
PCR主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。
本文将详细介绍PCR的三个步骤及其在实验室中的应用。
一、变性PCR的第一个步骤是变性。
在这个步骤中，需要将待扩增的DNA模板加热至95摄氏度。
高温的作用是使双链DNA解链成两条单链DNA。
由于高温导致氢键断裂，DNA的双链结构会转变为单链结构。
这一过程通常需要较高的温度和一定的时间，以确保DNA完全解链。
二、退火退火是PCR的第二个步骤。
在这个步骤中，温度会降低至使引物与目标DNA序列进行结合的最佳温度。
引物是一种短的DNA片段，它会与目标DNA序列的两端互补配对。
通过引物的结合，可以指导DNA聚合酶在目标DNA序列起始位置上进行复制。
退火的温度通常会根据引物的碱基序列来确定。
引物的退火温度应该比目标DNA序列中较高的GC含量的碱基对的融点高一些。
这样才能保证引物在目标DNA序列上的特异性结合，避免非特异性引物结合带来的误差。
三、延伸PCR的第三个步骤是延伸。
在这个步骤中，温度会升高至聚合酶的最适工作温度（一般为72摄氏度）。
在此温度下，DNA聚合酶会在引物的指导下，以模板DNA为模板合成新的DNA链。
DNA聚合酶能够在引物的末端开始合成，并向反方向复制整个DNA链，从而扩增目标DNA序列。
延伸的过程中需要将适当的dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸）提供给PCR反应体系，以供DNA聚合酶进行DNA合成。
该步骤的时间会根据待扩增的DNA片段的长度来设定，确保足够的时间完成DNA的合成。
PCR三个步骤的重复进行，可以在短时间内扩增一份DNA模板，并在最终产物中得到数以万计的复制。
PCR技术的应用PCR技术在分子生物学领域有着广泛的应用。
下面列举几个PCR技术的常见应用。
1. 基因检测：PCR技术可以用于基因检测，包括遗传病的检测、疾病易感性的评估等。
通过对特定基因序列的扩增，可以分析基因突变、单核苷酸多态性等关联因素。
聚合酶链式反应技术
聚合酶链式反应技术引言：聚合酶链式反应（PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis 等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。
PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。
由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量目的基因。
PCR技术具有灵敏度高、特异性性强、操作简便等特点。
虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须预先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最重大的发明之一。
Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。
目前，PCR技术已广泛应用于分子生物学的各个领域，在分子克隆、法医学鉴定、DNA序列分析、致病基因的检测及考古学等方面都发挥着重要作用。
操作过程：聚合酶链式反应用于扩增一小段已知的DNA片断，可能是单个基因，或者仅仅是某个基因的一部分。
与活体生物不同的是，PCR 只能复制很短的DNA片断，通常不超过10kbp。
DNA是双链分子，因此用互补DNA双链的构造单位（核苷酸）来度量其大小，单位为碱基对（base pair, bp）。
某些特定的方法可以扩增40kbp左右的片断，但是这种大小与真核细胞的染色体DNA相比仍然是很少的。
例如，人的体细胞DNA含有大约30亿个碱基对。
目前应用的聚合酶链式反应需要几个基本组成：1、DNA模板（template），含有需要扩增的DNA片断。
2、2个引物（primer），决定了需要扩增的起始和终止位置。
（见下面引物一节）3、DNA聚合酶（polymerase），复制需要扩增的区域。
4、脱氧核苷三磷酸（dNTP），用于构造新的互补链。
5、缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
聚合酶链式反应在热循环设备中进行。
PCR仪可以将反应管加热或冷却到每步反应所需的精确的温度。
为防止反应体系中液体产生蒸气，通常在反应管上加盖加热的盖子（比加热板温度来的高），或者在反应体系表面加入一层石蜡油。
聚合酶链式反应技术的基本原理
聚合酶链式反应技术的基本原理在现代生物技术领域，聚合酶链式反应技术（PCR技术）被广泛应用于DNA分析、基因克隆、遗传疾病诊断等领域，成为分子生物学研究中不可或缺的工具。
PCR技术的基本原理是通过体外合成DNA的方法，在恶劣条件下模拟细胞内DNA复制的过程，从而对目标DNA进行扩增。
PCR技术包括三个基本步骤：变性、退火、延伸。
首先，将混合物加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋变性，形成两条单链。
接着通过将温度降至50-65摄氏度，引导引物（两条DNA链的引导序列）与单链DNA结合，实现引物的互补结合。
最后在72摄氏度下，DNA聚合酶沿着引物以双链DNA为模板逐渐延伸合成新的DNA链。
这一循环的过程使得目标DNA得以指数级扩增。
PCR技术的成功需要高效的DNA聚合酶、特异性的引物设计以及适当的温度控制。
在实验室操作中，研究人员需要根据不同的DNA片段长度、GC含量等因素设计引物，确保引物与目标DNA特异性结合，避免产生假阳性结果。
此外，温度梯度PCR技术的出现使得在一次PCR反应中同时扩增多个DNA片段成为可能，提高了PCR技术的多样性和灵活性。
PCR技术的应用广泛，不仅可以在科研领域用于DNA序列分析、基因克隆、突变检测等，还被广泛应用于医学诊断、法医学鉴定、遗传学研究等领域。
例如，在疾病诊断中，PCR技术可以快速、准确地检测出病原体的DNA片段，帮助医生做出诊断和治疗决策。
总的来说，PCR技术作为一种高效、敏感、特异的DNA扩增技术，在生物学和医学领域发挥着重要的作用。
随着技术的不断改进和发展，PCR技术将继续在基础研究和应用领域发挥重要作用，推动生命科学领域的进步和发展。
1。
PCR介绍,生物学的聚合酶链式反应
生物学的聚合酶链式反应定义：一种在体外扩增DNA片段的重要技术。
当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，痕量模板DNA可扩增至几百万倍。
聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10^7～10^8倍，大大提高了DNA的得率。
已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。
复旦大学1988年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC-51A/B型DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。
PCR发明不到10年，却已获得广泛应用。
每年都有上千篇文章发表。
1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。
PCR
PCR自测题一、名词解释1、PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、简述PCR反应的基本步骤。
PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
简述聚合酶链反应的原理和过程
简述聚合酶链反应的原理和过程一、前言聚合酶链反应（PCR）是一种高效的DNA复制技术，它可以在短时间内扩增目标DNA序列。
PCR技术的广泛应用使得分子生物学研究和临床诊断更加便捷和快速。
本文将详细介绍PCR的原理和过程。
二、PCR原理PCR技术的核心是通过DNA聚合酶酶活性，在体外模拟DNA复制过程，将目标DNA序列扩增到足够数量。
PCR反应需要三种不同类型的DNA片段：两个引物（primers）和一个模板DNA。
引物是一段20-30个核苷酸长度的寡核苷酸，分别与目标序列的两端互补配对，形成引物-模板复合体。
此外，还需要聚合酶、dNTPs（脱氧核苷三磷酸）和缓冲液。
PCR反应可分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性在反应开始时，将反应混合液加热至94-98℃，使双链DNA变性为单链，并断裂成两条单链模板。
此时引物可以与单链模板上互补碱基配对形成稳定的引物-模板复合体。
2. 退火反应温度降至50-60℃，引物与模板形成的复合体开始退火，使引物与模板分离。
此时引物可以与目标DNA序列的两端互补配对，形成稳定的引物-目标DNA序列复合体。
这个步骤又称为引物结合。
3. 延伸反应温度升高至72℃，聚合酶开始在引物-目标DNA复合体上延伸新链。
聚合酶沿着模板DNA链向3'方向逐个加入dNTPs，并在每个新核苷酸加入后将其与前一个核苷酸连接成磷酸二酯键。
这个步骤又称为扩增。
PCR反应通常需要进行20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
在每一轮中，扩增产生的新链会作为下一轮反应的模板DNA，进一步扩增目标序列。
三、PCR过程PCR反应是一个非常精密的过程，需要控制多种因素以确保反应成功。
下面将详细介绍PCR过程中需要注意的几个关键点。
1. 引物设计正确的引物设计是PCR反应成功的关键。
引物需要与目标DNA序列的两端互补配对，这样才能在退火步骤中结合到目标DNA上。
引物的长度通常为20-30个核苷酸，长度过短容易导致非特异性扩增，长度过长则会降低扩增效率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
PCR反应分三步：变性、退火及延伸。
• PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。 • ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备； • ②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合； • ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互 补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。
植物遗传育种
构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统 进化
畜 牧
畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、 牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺 陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼
植物保护
杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学 交互反应，用常规方法难以区分，采 用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区 分
其他
①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学
实时定量PCR
Real-time Quantity PCR
• 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起 来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技 术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板 的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠 性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 无污染性、具实时性和准确性等特点 。
聚合酶链反应技术（PCR）
2009.8
• PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点；能 在一个试管内将所要研究的目的基因或某 一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 可完成。PCR技术是生物医学领域中的一 项革命性创举和里程碑。
• Mullis 1993• 度诺贝尔化学奖。 年 • PCR技术是一种利用DNA变性和复性原 理在体外进行特定的DNA片段高效扩增 的技术，可检出微量靶序列（1个 copy）。在模板DNA、引物和dNTP存 在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合 成反应。 • 仅需用极少量模板，在一对引物介导下， 在数小时内可扩增至100-200万copy.
由于被释放的荧光基团数目和PCR产物 数量是一对一的关系，且光密度同释放的 荧光基团的数目也成正比关系，因此该技 术可对模板准确定量。由于扩增产物短时 效率较高，故扩增长度一般为50—150bp。
实时PCR技术原理
探针设计一般应符合以下条件：
(1) GC碱基含量在40%-60%。 （2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 （3）避免5'端为G， 因为G对荧光可能有抑制作用， 尽量使C个数多于G。 （4）长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特 异性。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃ 另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游引 物尽量接近但不要重叠。
作用原理
• 实时荧光定量PCR常用的检测模式： • （1）TaqMan探针 • （2）SYBR GreenⅠ
TaqMan探针方法的作用原理:
原理：利用Taq 酶的5‘→3’外切核酸酶活性 并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记 探针。 TaqMan探针5‘端标以荧光发射基团，3’ 端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中 不能被延伸。当探针保持完整时，3‘端猝灭 基团抑制5’发射基团的荧光发射。
PCR 应用 遗传性疾病
地中海贫血的基因诊断 学
个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。• 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对 于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一 根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医 学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴 定中PCR技术被普遍采用。
在PCR的退火期，探针与引物所包含序列 内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到 达探针处，Taq酶发挥5‘→3’外切核酸酶活 性，继而发生置换，切断探针后，发射基 团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增 加。模板每复制一次，就有一个探针被切 断，伴有一个荧光信号的释放。
• 标准的PCR反应体系：
•
10×Buffer 10ul dNTP mixture per 200umol/L primers per 10～100pmol templete DNA 0.1～2ug DNA polymerase 2.5ul Mg2+ 1.5mmol/L dH2O 100ul
• PCR反应五要素：参加PCR反应的物质 主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
• 引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
靶DNA的扩增
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
(2) SYBR Green I荧光染料的原理
SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结 合的染料，当它与DNA双链结合时，发出 荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信 号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信 号强度代表了双链DNA分子的数量。它的 缺点是在于能与非特异性双链DNA（如引 物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能 通过熔解曲线分析得到解决。
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。