聚合酶链反应技术(PCR)

• Mullis 1993• 度诺贝尔化学奖。 年 • PCR技术是一种利用DNA变性和复性原 理在体外进行特定的DNA片段高效扩增 的技术，可检出微量靶序列（1个 copy）。在模板DNA、引物和dNTP存 在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合 成反应。 • 仅需用极少量模板，在一对引物介导下， 在数小时内可扩增至100-200万copy.
在PCR的退火期，探针与引物所包含序列 内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到 达探针处，Taq酶发挥5‘→3’外切核酸酶活 性，继而发生置换，切断探针后，发射基 团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增 加。模板每复制一次，就有一个探针被切 断，伴有一个荧光信号的释放。
由于被释放的荧光基团数目和PCR产物 数量是一对一的关系，且光密度同释放的 荧光基团的数目也成正比关系，因此该技 术可对模板准确定量。由于扩增产物短时 效率较高，故扩增长度一般为50—150bp。
实时PCR技术原理
探针设计一般应符合以下条件：
(1) GC碱基含量在40%-60%。 （2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 （3）避免5'端为G， 因为G对荧光可能有抑制作用， 尽量使C个数多于G。 （4）长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特 异性。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃ 另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游引 物尽量接近但不要重叠。
杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学 交互反应，用常规方法难以区分，采 用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区 分
其他
①考古学 ②植物分类学 ③群体生态学
实时定量PCR
Real-time Quantity PCR
• 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起 来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技 术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分 析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板 的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠 性更强、能实现多重反应、自动化程度高、 无污染性、具实时性和准确性等特点 。
PCR 应用 遗传性疾病
地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症
传染性疾病
肝炎 性病 肿瘤
法医学
个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。• 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对 于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一 根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医 学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴 定中PCR技术被普遍采用。
植物遗传育种
构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统 进化
畜 牧
畜禽病诊断:猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、 牛白血病毒、牛病毒性腹泻、免疫缺 陷病毒等检测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼
植物保护
• 标准的PCR反应体系：
•
10×Buffer 10ul dNTP mixture per 200umol/L primers per 10～100pmol templete DNA 0.1～2ug DNA polymerase 2.5ul Mg2+ 1.5mmol/L dH2O 100ul
• PCR反应五要素：参加PCR反应的物质 主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+
聚合酶链反应技术（PCR）
2009.8
• PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点；能 在一个试管内将所要研究的目的基因或某 一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 可完成。PCR技术是生物医学领域中的一 项革命性创举和里程碑。
作用原理
• 实时荧光定量PCR常用的检测模式： • （1）TaqMan探针 • （2）SYBR GreenⅠ
TaqMan探针方法的作用原理:
原理：利用Taq 酶的5‘→3’外切核酸酶活性 并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记 探针。 TaqMan探针5‘端标以荧光发射基团，3’ 端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中 不能被延伸。当探针保持完整时，3‘端猝灭 基团抑制5’发射基团的荧光发射。
(2) SYBR Green I荧光染料的原理
SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结 合的染料，当它与DNA双链结合时，发出 荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信 号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信 号强度代表了双链DNA分子的数量。它的 缺点是在于能与非特异性双链DNA（如引 物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能 通过熔解曲线分析得到解决。
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PCR(Polymerase Chain Reaction)
Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.
PCR反应分三步：变性、退火及延伸。
• PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。 • ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备； • ②模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温 度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合； • ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互 补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。
• 引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度
靶DNA的扩增
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。