非无菌产品微生物限度检查中控制菌检查原理

非无菌药品微生物限度检查中控制菌检查及原理

一、大肠埃希菌

1.菌体特性

大肠埃希菌属于肠杆菌科埃希菌属，菌体细胞

两端钝圆，为革兰染色阴性无芽孢杆菌，细胞大小为

1.1～1.5×2～6.0 µm。

周身鞭毛、运动或不运动。能形成荚膜和微荚膜。

最适生长温度37℃，可在15～46℃生长。最适pH

为7.4～7.6。在营养肉汤培养基中，37℃培养24

小时后，形成菌膜，管底粘液状沉淀，培养物有粪臭

味。

在伊红美兰琼脂（EMB）平板上，典型的菌落

呈紫黑色，有金属光泽，菌落扁平，低度凸起，光

滑湿润。也有呈粉红色、无金属光泽、中心紫色的

菌落。

在麦康凯琼脂（MaCC）平板上，菌落扁平、圆形、光滑湿润。呈桃红色、微红色或菌落中

心桃红色。

2. 生化实验原理

（1）MUG试验

97％的大肠埃希菌含有β—葡萄糖醛苷酶，可分解4

—甲基伞形酮β－D－葡萄糖苷酸，生成的4—甲基伞形

酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。

（2）靛基质试验（I实验)

有些细菌具有色氨酸酶，在蛋白胨水培养基中生长时，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛

基质（吲哚）。靛基质无色，不能直接观察，加入靛基质试

液（对二甲氨基苯甲醛试液），产成红色的玫瑰靛基质。

色氨酸酶活性的最适pH为7.4～7.8。pH降低，靛基质产生减少，可能出现假阴性或弱阳性反应，故培养基pH应为7.4～7.6 。因产生靛基质的细菌都能发酵糖类而产酸，增加培养基的酸度，不宜用含葡萄糖的培养基进行此试验。

（3）甲基红试验（M）

肠杆菌科细菌均可发酵葡萄糖产生酸性代谢产物，使培养基pH值下降，最初可使甲基红指示液［变色域pH4.5－5.4（红→黄）］变色而呈现阳性反应。但继续培养后，产气杆菌能将两分子的丙酮酸脱羧生成一分子的中性乙酰甲基甲醇而使培养基pH值上升至5.4以上，使甲基红指示液变为桔黄色（甲基红试验阴性）。而大肠埃希菌则继续产生大量的酸，如甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸等，保持高氢离子浓度，故甲基红试验为阳性反应。

2CH3COCOOH→2CO2+CH3CO·CHOHCH3

丙酮酸乙酰甲基甲醇

（4）乙酰甲基甲醇生成试验(V－P)

此项实验主要用于鉴别大肠埃希菌和产气杆菌这两种细菌在分解葡萄糖后的进一步反应。大肠埃希菌于产生丙酮酸后，丙酮酸进一步分解形成甲酸、乙酸、乳酸等。产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性环境下被空气中的氧气氧化成二乙酰（丁二

酮），丁二酮与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基作用，生成红色化合物。试验中加入的α—萘酚试液起到催化剂的作用，使反应的颜色增强。

（5）枸櫞酸盐利用试验（C）

枸椽酸盐培养基中仅含有无机盐和唯一的有机物—枸椽酸。一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源。因此，根据能否利用枸椽酸盐，能鉴别某些菌种。

产气杆菌可以分解枸椽酸盐而

取得碳源，能在含有枸椽酸盐的培养

基上生长形成菌落, 并分解枸椽酸

盐生成碳酸钠，使原来在pH7.0以

下的培养基转为碱性，用溴麝香草酚

兰作指示剂，接菌后的枸櫞酸盐培养

基经过培养，培养基颜色由最初的绿

色变为深兰色。大肠埃希菌不能分解枸椽酸，所以得不到碳源不能生长，接菌后的枸櫞酸盐培养基经过培养，培养基中的溴麝香草酚兰指示剂也不会变色，培养基保持原来的绿色。

二、大肠菌群

大肠菌群为水质粪便污染的指示菌。是指37℃

生长时能发酵乳糖，24小时内产酸产气的革兰阴性

无芽孢杆菌。大肠菌群不是分类学上的名称，符合

此定义的细菌包括埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌

属和枸櫞酸菌属等菌属的细菌。涵盖了正常人畜肠道内全部需氧或兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌。

乳糖发酵实验原理：各种细菌含有发酵不同糖的酶，能分解不同的糖而产酸、产气，有的仅产酸，而不产气。大肠菌群分解胆盐乳糖发酵培养基中的乳糖产酸，使培养基中的溴甲酚紫指示液由紫色变为黄色；产气可使液体培养基中的倒置小管内出现气泡。

三、沙门菌

1.沙门菌特性

沙门菌为肠杆菌科沙门菌属细菌，是人畜共患的肠道病原菌，常引起伤寒、肠炎、肠热症和食物中毒。可通过人、畜、禽的粪便或带菌者接触，直接或间接地污染药品原、辅料及生产的各个环节，以动物来源的药物，如脏器、粪便、全虫体等污染机率更高。因此，药品微生物限度标准规定，以动物来源的药物、生物脏器制品（不包括蜂蜜、王浆、动物角、阿胶）等的口服给药制剂不得检出沙门菌。

沙门菌为革兰阴性无芽孢短杆菌，菌体大小在0.4～0.9µm×1～3µm，两端钝圆,具周身鞭毛，能运动，一般无荚膜，少数有包膜。沙门菌属营养条件要求不高，在营养琼脂平板上为无色半透明、表面光滑、湿润、隆起的菌落；直径在2～3mm。生长温度10～42℃,最适温度37℃, pH范围4.5～9, 最适pH为6.8～7.8。需氧或兼性需氧。有时有粗糙型菌落，干燥、无光泽、边缘不整齐、中心和边缘不一致。

胆盐硫乳琼脂（DHL）、沙门、志贺菌属琼脂（SS）、麦康凯琼脂（Macc）及曙红亚甲兰琼脂（EMB）培养基中，都含有乳糖。埃希菌属能发酵乳糖产酸产气，沙门菌则不能。另外，埃希菌属不能分解含硫氨基酸生成硫化氢，而沙门菌属90%以上的菌H2S为阳性反应。产生的H2S遇培养基中的铁盐生成FeS沉淀物（黑色沉淀物）。因此，沙门菌在含有糖指示剂的EMB 和Macc培养基平板上，菌落为无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润。在DHL和SS琼脂平板上，因培养基中含有糖和H2S指示系统，菌落中心带黑色或几乎全黑色。

2. 三糖铁琼脂培养基上的特征及其生化反应原理

三糖铁琼脂培养基高层斜面：沙门菌在TSI斜面的反应为：(1)斜面呈碱性（红色），底层呈酸性（黄色），H2S阳性（底层黑色）或阴性（无黑色）。(2)斜面及底层均为黄色，底层黑色。

实验原理：三糖铁琼脂培养基含二套指示系统，可检查糖类发酵情况和硫化氢产生。培养基中含乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10:10:1)；硫酸亚铁和还原剂硫代硫酸钠；酸碱指示剂为0.2%酚磺酞指示液[pH6.8～8.4（黄→红）]。培养基灭菌后的pH值约为7.3。

若待检菌能够发酵乳糖或蔗糖，则产酸量较多，使整个培养基（斜面及底层）均呈黄色：如