酵母双杂交的一些问题
酵母双杂交
X DBD-X 融合蛋白 DBD Y
Y
AD-Y AD 融合蛋白
AD
报告基因产物 激活转录 构建 表达
UAS 上游激活序列
报告基因 即：DBD-X为诱饵蛋白，AD-Y为猎物蛋白
一般步骤
1.改造酵母
使用特定的营养缺陷型菌株 例：Trp与Leu缺陷型，即酵母菌自身不能合成Trp和Leu，需 要从培养基中吸收Trp和Leu。
酵母双杂交系统的优点
•根据目标蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白， 不需分离靶蛋白 •蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相 互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合 也可被检测出来，真实反应体内蛋白质间相互作用情况
•可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断 目的蛋白的结的足够丰富的多样性 提供尽可能多地与AD连接位点 插入片段不能过大，否则因为非特异结合所导致的假阳性增多 选用更适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的是综 合提高双杂交技术的一个重要方面。
改进
•4.利用酵母交配（yeast mating）可以很方便地将两种不 同的质粒转入同一酵母菌株。据此已发展出一套快速鉴 定假阳性的方法。 •5.体内进行的双杂交检测往往需要体外的其他方法来验 证。
常见问题
•2.如果诱饵蛋白DBD-X能直接激活报告基因的表达，该如 何处理？ •该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过 基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活， 但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。
常见问题
•3.转化效率太低怎么办？ •可以采用以下方法解决： 1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯 化。 2) DNA-BD很可能是有毒的。 3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。 4) 共转化或者单独转化
酵母双杂技术的原理和应用
酵母双杂技术的原理和应用一、酵母双杂技术的原理酵母双杂技术是一种重要的基因工程技术，其原理主要包括以下几个方面：1.酵母双杂技术的基本原理：酵母双杂技术基于酵母细胞中的两种杂交酵母菌株，一种包含目标酵母蛋白的报告基因，另一种包含潜在的酵母互补DNA库。
通过把这两个酵母菌株共同培养在含有特定酵母蛋白诱导剂的培养基中，使得目标酵母蛋白和潜在互补DNA库中的DNA相互作用，从而筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列。
2.双杂交酵母菌株的构建：首先需要构建含有目标酵母蛋白的报告基因表达酵母菌株，该菌株会在酵母细胞中表达目标蛋白。
同时，还需要构建潜在酵母互补DNA库，该库中含有大量酵母基因组DNA片段的克隆。
3.酵母菌株的培养和筛选：将目标蛋白报告基因酵母菌株和酵母互补DNA库菌株共同培养在含有诱导剂的培养基中，诱导目标蛋白和潜在互补DNA库中的DNA发生相互作用。
然后利用适当的筛选方法，如抗生素抗性筛选或含有荧光素底物的筛选，筛选出与目标蛋白相互作用的克隆。
二、酵母双杂技术的应用酵母双杂技术广泛应用于生物医药、生物学研究等领域，具有多个重要的应用方面：1.蛋白相互作用的研究：通过酵母双杂技术，可以快速筛选出与目标蛋白相互作用的DNA序列，从而深入研究蛋白相互作用的机制和功能。
这对于揭示生物体内复杂蛋白相互作用网络、研究疾病相关蛋白相互作用具有重要意义。
2.新药靶点的发现：通过酵母双杂技术，可以筛选出与药物分子相互作用的蛋白，从而为新药靶点的发现提供候选蛋白。
这对于药物研发和临床治疗具有重要意义。
3.基因功能研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与目标基因相互作用的蛋白，从而推断目标基因的功能。
这有助于揭示基因的调控机制和功能。
4.疾病相关基因的筛选：通过酵母双杂技术，可以筛选出与疾病相关的基因，从而对疾病的发生机制和治疗提供有价值的信息。
5.基因治疗的研究：通过酵母双杂技术，可以筛选出与治疗目标相关的蛋白或基因，从而为基因治疗的研究提供候选靶点或治疗策略。
酵母双杂交技术
酵母双杂交系统1．原理酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。
研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。
但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS 的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。
2．试验流程酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建成诱饵质粒。
2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。
2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。
利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。
3．特点优点蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。
酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手段和方法。
缺点尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。
1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。
双杂交系统要求两种杂交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。
因为融合蛋白相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的。
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
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酵母双杂实验操作手册和注意事项
酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。
很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。
这两个结构域各具功能，互不影响。
但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。
不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。
基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。
如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。
通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。
(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。
(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。
常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。
而菌株则具有相应的缺陷型。
双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。
这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。
根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。
后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。
二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。
酵母双杂一缺二缺三缺板原理
酵母双杂一缺二缺三缺板原理1. 酵母的基本知识说到酵母，大家可能脑海里第一反应就是泡面或是烘焙，那种面包香味扑鼻而来，是不是很诱人？其实，酵母可不是一个简单的小家伙，它是个微小的生物，专门负责发酵的工作。
发酵就像是酵母的魔法秀，能把糖变成酒精和二氧化碳，气泡冒出来，面团变得松软，味道也香得不得了。
说白了，酵母就像是厨房里的小魔法师，没它，咱们的面包和啤酒都要失色不少。
1.1 酵母的类型酵母种类可多了，最常见的就是酿酒酵母，咱们叫它“萨克酵母”。
它在酿酒和面包制作中是明星级的角色，绝对不容小觑。
还有一种叫“啤酒酵母”，专门为啤酒服务，给啤酒增加那种独特的风味。
虽然它们小，但可不简单，生存能力强得很，能够在各种环境下活得滋润。
1.2 酵母的作用那酵母到底怎么工作呢？你看啊，它在发酵的过程中，糖被它转化成二氧化碳和酒精，就像我们喝酒前的那种兴奋感，都是酵母的功劳。
其实，发酵也能产生一些有益的营养成分，对我们的肠胃好得很，简直是健康饮食的小帮手。
2. 双杂交实验好啦，咱们进入正题，今天要说的就是酵母双杂交实验。
别被这个名字吓到，其实说白了就是利用两种不同的酵母，进行基因的互换。
简单点说，就像是把两个不同的风味结合在一起，结果可能会让你惊艳。
2.1 双杂交的意义这双杂交实验可有意思了！它帮助科学家了解基因之间的相互作用。
就好比一个团队，里面有不同的成员，大家各自发挥自己的特长，才能把工作做得更好。
通过双杂交实验，科学家能找到哪些基因是互相影响的，哪些是“缺位”的，没参与其中。
这样一来，咱们就能对基因的功能有更深入的认识，能说是如虎添翼。
2.2 实验步骤双杂交的步骤其实也挺简单的。
首先，科学家得选择两种酵母，别忘了，还要在基因层面做些小手脚。
接着，把它们培养在一起，看看有没有什么新鲜的变化。
如果碰巧“碰撞”出新组合，那就太棒了，就像在厨师和食材的结合中，爆发出意想不到的美味。
3. 缺失实验再来说说缺失实验，这个听上去有点复杂，但其实不然。
验证蛋白互作的方法
验证蛋白互作的方法生物学研究中，蛋白质互作是一个重要的研究领域，因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。
蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用，以及这些作用对于生物体内功能的影响。
为了获得这些信息，科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。
本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。
一、酵母双杂交（Y2H）法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。
由于其名称中含有“双杂交”，因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起，然后观察它们是否相互作用。
首先，将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。
然后，在酵母细胞中，将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连，形成一个杂交蛋白。
如果这两个蛋白质发生相互作用，它们将结合并形成GAL4转录激活子，从而激活报告基因进行表达。
最终，研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。
虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术，但有一些潜在问题需要研究人员注意。
首先，该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用，无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。
其次，酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大，这可能导致结果的误判。
二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。
它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达，并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。
具体来说，将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。
然后，通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合，可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。
最后，通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。
如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用，那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。
这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况，还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。
不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的，因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。
酵母双杂
pGBKT7-XX酵母转化菌分别接种于5mL SD/-Trp的液体培养基中， 30℃，
220rpm，培养2～3天，测其OD60定
利al
351ml
两种质粒。所以，这种情况下，最好先将诱饵质粒转入
注意：此处的加入顺序非常重要，PEG必须得首先加入， 它可以将酵母细胞与高浓度的LiAc分开，使酵母免
酵母中（用本方法或快速转染的方法），然后再Leu、SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-
1、制备酵母感受态，实验步骤同上；
7、以6000～8000rpm离心30s，用微量移液枪尽量除去转
2、将1 mL单链载体DNA样品煮沸5 min，迅速 化混合液；
置于冰水中冷却； 3、取制备好的酵母感受态，14000rpm，离心 30s，用微量取样器尽量除去残留的LiAc； 4、往盛有酵母感受态的离心管中按表7加入酵 母转化所需物质：
6、1000g，离心10分钟，弃上清，用10 mL含有卡 那霉素（终浓度为50μg/mL ）的0.5×YPDA重悬 菌体；（酵母悬浮液的体积大约为11.5mL）
7、取100 μL酵母悬浮液进行稀释，步骤同2.4.1， 然后吸取100 μL 10-1，10-2，10-3，10-4号管的 稀释液分别涂布于SD/-Trp/-Leu平板上，30℃， 培养3～5天，最后根据SD/-Trp/-Leu平板上的菌
1、取-80℃冻存的诱饵载体的酵母转化菌，在SD/Trp固体平板上划线培养，30℃，培养3～5天；
2、 挑取SD/-Trp固体平板上菌落直径大于2mm的 转化酵母单菌落，接种到已灭菌的50 mL SD/Trp液体培养基中（250ML瓶子装），30℃， 260rpm，培养至OD600=0.8（大约16～20小 时）；
酵母双杂交的一些问题
研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。
我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
酵母双杂交原理及步骤
酵母双杂交原理及步骤以酵母双杂交原理及步骤为标题，本文将探讨酵母双杂交的原理和步骤。
酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质相互作用、信号转导和基因调控等生物学过程。
酵母双杂交是一种基于酵母菌的遗传系统的实验方法，通过检测两个蛋白质是否相互作用，从而揭示它们之间的相互作用关系。
这种方法的核心原理是将两个感兴趣的蛋白质分别与DNA结合域和激活域相连，当这两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域会靠近，从而激活报告基因的表达。
酵母双杂交实验的步骤如下：1. 构建融合基因：首先需要选取两个感兴趣的蛋白质，并将它们的编码序列分别克隆到酵母双杂交载体的DNA结合域和激活域上。
DNA结合域和激活域是两个功能区域，当两个蛋白质相互作用时，这两个功能区域会靠近并激活报告基因的表达。
2. 转化酵母菌：将构建好的酵母双杂交载体导入酵母菌中。
酵母菌是双杂交实验中常用的宿主，因为它具有简单的遗传系统和易于生长的特点。
3. 筛选阳性克隆：将转化后的酵母菌分别接种在缺失报告基因所需的营养物的培养基上。
只有当两个蛋白质相互作用时，DNA结合域和激活域才能靠近并激活报告基因的表达，从而使酵母菌能够在缺失营养物的培养基上生长。
4. 验证相互作用：通过进一步的实验证实阳性克隆的相互作用。
常用的方法包括酵母菌营养物补充实验、酵母菌生长曲线分析和蛋白质互聚实验等。
酵母双杂交技术的优点在于它能够直接在真核细胞中研究蛋白质相互作用，同时具有灵敏度高、结果可靠、重复性好等特点。
然而，也需要注意到酵母双杂交实验存在一定的局限性，如假阳性和假阴性结果的可能性，以及蛋白质结构和功能的局限性等。
酵母双杂交是一种常用的分子生物学技术，通过构建融合基因、转化酵母菌、筛选阳性克隆和验证相互作用等步骤，可以研究蛋白质相互作用等生物学过程。
在实际应用中，需要综合考虑实验设计、阳性和阴性对照、验证方法等因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
酵母双杂交实验原理
酵母双杂交实验是一种用于研究蛋白质之间相互作用的实验方法，它基于真核生物调控转录起始过程的机制。
酵母双杂交实验主要通过检测两个蛋白质在酵母细胞中的相互作用，从而揭示它们在生物体内的功能和相互作用。
酵母双杂交实验原理如下：
1. 构建重组质粒：首先，将目标蛋白质的表达载体与酵母双杂交系统中的启动子、激活子等调控元件进行重组，得到重组质粒。
2. 转化酵母细胞：将重组质粒转化到酵母细胞中，使目标蛋白质在酵母细胞中表达。
3. 筛选融合蛋白：利用选择性培养基，筛选出成功表达目标蛋白质的酵母细胞。
4. 鉴定蛋白质互作：将筛选出的酵母细胞进行混合、共培养，观察转录激活效应。
如果两个蛋白质之间存在相互作用，它们会结合在一起，形成完整的转录激活因子，从而激活报告基因的转录。
通过检测报告基因的表达水平，可以判断蛋白质之间是否发生相互作用以及作用强度。
5. 结果分析：根据实验结果，分析蛋白质之间的相互作用，进一步研究它们在生物体内的功能和调控机制。
目前常用的酵母双杂交系统有LexA系统和Gal4系统两种。
LexA系统基于原核蛋白LexA的DNA结合域和转录激活域，而Gal4系统则利用了酵母转录激活因子GAL4的DNA结合域和转录激活域。
这两种系统在实验操作和应用范围上略有不同，但均具有较高的灵敏度和特异性。
酵母双杂交技术
酵母双杂交技术引言酵母双杂交技术是一种常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该技术能够检测和分析细胞内发生的蛋白质-蛋白质相互作用，帮助科学家了解细胞信号传导、代谢途径和疾病发生机制。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理、应用和优缺点。
原理酵母双杂交技术利用酵母细胞（通常是酿酒酵母）作为表达蛋白质的平台，通过操纵DNA序列，使得感兴趣的两个蛋白质分别与酵母细胞内的两个杂交域相连。
当两个蛋白质相互作用时，通过激活或抑制报告基因的表达来检测相互作用的发生。
具体来说，酵母双杂交技术包括以下几个步骤：1.构建融合基因表达质粒：将感兴趣的两个蛋白质的编码序列插入特定的表达质粒中，其中一个蛋白质与活化域相连，另一个蛋白质与靶向域相连。
2.转化酵母细胞：将构建好的表达质粒导入酵母细胞中，使其能够表达融合蛋白质。
3.遴选正交剪切位点：利用酵母细胞染色质中的正交剪切位点，确保融合蛋白质能够发挥其相互作用。
4.检测相互作用：通过报告基因（如荧光蛋白）的表达情况来检测融合蛋白质之间的相互作用程度。
一般来说，如果两个融合蛋白质相互作用，则报告基因被激活，表达结果可通过荧光显微镜观察或酵母细胞生长的特征来检测。
应用1.蛋白质相互作用网络研究：酵母双杂交技术可以帮助科学家构建蛋白质相互作用网络，了解细胞内不同蛋白质之间的相互关系和调控机制。
2.疾病相关蛋白质研究：酵母双杂交技术可以用于筛选和鉴定一些与疾病相关的蛋白质，帮助研究人员深入了解疾病的发生机制，并开发新的治疗方法。
3.药物靶点筛选：酵母双杂交技术可以用于筛选药物靶点，帮助研究人员发现新的药物靶点，从而加速药物研发过程。
优缺点酵母双杂交技术具有以下优点：•高通量：酵母双杂交技术可以同时检测大量蛋白质之间的相互作用，有助于加速研究的进程。
•对新蛋白质相互作用的发现：酵母双杂交技术可以帮助发现未知的蛋白质相互作用，有助于揭示新的细胞信号传导途径和代谢途径。
•相对简洁易行：酵母双杂交技术不需要复杂的实验设备，相对容易实施。
酵母双杂交实验操作及心得体会
酵母双杂交实验操作及心得体会摘要:酵母双杂交系统对于研究蛋白与蛋白之间的相互作用虽然具有筛选量大、效率高及应用广泛等优点，但有它自身的缺陷。
酵母培养的周期与大肠杆菌相比较长，酵母转化的过程较繁复，耗时较长，而且存在假阳性较多的问题，阳性克隆工作量太大，验证工作繁重。
在此项目中酵母双杂交实验最关键的步骤是酵母培养时间的掌控。
1.构建CaM诱饵质粒①PCR 扩增CaM基因的开放阅读框，正向和反向引物分别加接酶切位点。
②扩增得到的CaM插入t载体( T–CaM) 。
③T–CaM和pGBKT7 质粒分别双酶切。
④胶回收目的DNA。
⑤将CaM连入pGBKT7，构建成表达载体pGBKT-CaM，转化大肠杆菌DH5α。
⑥因pGBKT7含Kan+抗性基因，在Kan+抗性平板上筛选阳性克隆。
⑦测序验证CaM与gal4 DNA 结合功能区融合，插入序列读框正确、无碱基突变。
2.pGBKT7 – CaM转化酵母菌Y2HGold将pGBKT7- CaM采用PEG/LiAc法转化酵母菌Y2HGold，涂布于SD – Trp固体培养基上，30° C 3-5天，菌落长出。
进行CaM自激活鉴定及毒性测定。
3.龙须菜高温胁迫表达cDNA文库①设定温度梯度(26-35°C)和时间梯度(12-72 h)，对龙须菜进行高温胁迫。
②提取龙须菜总RNA(RNA提取按照Qiagen试剂盒说明书进行，RNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)。
③应用SMART技术构建龙须菜高温胁迫表达cDNA文库，3’和5’引物分别加接酶切位点。
4.文库筛选载体构建将龙须菜高温胁迫表达文库cDNA双酶切，连入同样双酶切的AD 克隆质粒pGADT7中，用PEG/LiAc 转化法将cDNA 文库质粒转化到酵母菌Y187中，SD – Leu平板上30 ℃培养3～5 天，菌落长出。
5.酵母交配转化及阳性克隆的筛选将酵母菌Y187/ pGADT7-cDNA与酵母菌Y2HGold/pGBKT7- CaM进行酵母交配转化(Yeast Mating)，SD–Trp/-Leu/Aba/X-α-gal平板上30 ℃培养3～5 天，筛选蓝色菌落，再将阳性克隆在SD–Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-α-gal平板上进行验证。
酵母双杂杂交回复验证实验
酵母双杂杂交回复验证实验酵母双杂杂交回复验证实验是一种常见的原核生物遗传学实验方法，其基本原理是利用酵母双杂杂交系统，构建目标基因裂解的表达质粒载体与卷曲素蛋白的表达质粒载体在酵母细胞内发生交互作用，进行基因互补性检验。
以下是对该实验方法的详细阐述和回答。
实验步骤：1.构建目标基因裂解的表达质粒载体，将其转化入酵母细胞中。
2.构建卷曲素蛋白的表达质粒载体，将其转化入酵母细胞中。
3.采用双杂杂交技术，让表达目标基因的质粒载体与表达卷曲素的质粒载体在酵母细胞内发生交互作用。
4.通过酵母双杂交回复实验验证是否存在基因互补性。
实验原理：酵母双杂交回复验证实验的基本原理是通过卷曲素蛋白和其它结合蛋白招募转录因子或激酶蛋白到DNA上，从而启动或抑制相关基因的转录作用。
利用该原理，将目标基因裂解的表达质粒载体与卷曲素蛋白的表达质粒载体在酵母细胞内进行相互结合，得到那些表达了目标基因的酵母细胞，即表明目标基因与卷曲素蛋白具有互补性。
实验优点：1. 酵母遗传学实验是生物学研究中的重要工具，帮助人们更加深入的了解生命现象，而酵母双杂交回复验证实验是酵母遗传学中的重要方法。
2. 该实验方法操作简便、效率高，能够快速地检测和鉴定基因互补性，有效缩短实验时间和成本。
3. 该实验方法具有灵敏度高、准确度高等优点，可以进行大规模筛选和鉴定。
实验局限：1. 该方法仅限于基因互补性的验证，而在完整生物体内的基因互作关系复杂，无法完全模拟酵母细胞中的模型。
2. 由于酵母在许多生物学过程中并非与人类完全相似，因此酵母双杂交回复验证实验在人类遗传学研究中往往具有偏差或误差。
总结：综上所述，酵母双杂杂交回复验证实验是一种简便、快速并且高效的方法，结合新的分子生物学和生化技术手段，可以在许多科学领域如遗传学、生物工程和药物研发领域中使用。
此外，该实验还可以用于预测增强元件、信号转导模块、转录因子家族、已知人类遗传病等重要的生物学问题，具有广泛的应用前景。
酵母双杂交
The End
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①高效:酵母转化方法简单，转化效率高达其具有较高的敏感度，可检测蛋白质之
间结合常数低至1 mmol/L 。
③真实:检测在活细胞内进行，作用条件与作用力无需模拟,在一定程度上
代表细胞内的真实情况。
②非普遍适用性：蛋白质必须定位于核内,
才能激活报告基因的表达， 因此，不能被转运到细胞核内的蛋白质不适用这种方法。
③假阴性：某些表达的融合蛋白通常在酵母菌株中产生毒性，从而抑制
报告基因的表达和酵母的生长，或者蛋白间的相互作用较弱，报告基因不表 达或表达程度甚低以至于检测不出来，使得酵母双杂呈现“假阴性”的结果。
④简捷:只需要构建诱饵表达载体，可以省略蛋白质抽提纯化或抗体制备的
繁琐步骤。
⑤广泛:可采用不同组织器官细适用于部分细胞质、细胞核及膜结合阳性，
即通过双杂交观察到的蛋白质的相互作用在真 实情况下不一定发生。 Ⅰ型，AD-Y 单独表达的融合蛋白即可激活转录； Ⅱ型，AD-Y 表达的融合蛋白和空BD 载体即可激活转录； Ⅲ型，AD-Y 表达的融合蛋白与任意的BD 载体表达的融合蛋白即可激活转录。 （双筛选系统等可以基本消除假阳性。）
3
应用实例
广泛地应用于蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA 以及蛋白与其他小 分子间相互作用的研究, 如今也开始运用该系统进行高通量筛选相互作用蛋白及 其他相关分子。 其应用进展主要而研究蛋白间相互 作用的传递途径。目前已经利用该系统对HBV 、HCV 以及HIV 等多种病毒蛋白基 因的相互作用蛋白进行了研究。 (2)非常灵敏地检测或验证蛋白—蛋白的相互作用。 (3)可利用酵母双杂交筛选药物的作用位点, 寻找基因治疗中的多肽类药物。 (4)研究蛋白—蛋白间发生相互作用所必需的重要活性位点。在确定两蛋白存在相 互作用后, 要对所研究的蛋白做一系列缺失突变处理, 通过缺失掉不同片段来对 蛋白中起关键作用的功能域进行精确的定位。
育种--酵母双杂交
酵母转录因子（ 酵母转录因子（Gal 4） ）
与BD-fusion ---诱饵（bait） 诱饵（ ） 诱饵 与AD-fusion ---猎物或靶蛋白（prey or target protein） 猎物或靶蛋白（ ）
报告基因（ 报告基因（reporter gene） ）
---Lac Z（编码β-半乳糖苷酶） 半乳糖苷酶） （编码β 半乳糖苷酶
Fields和Song将两个融合蛋白分别构建在穿梭 和 将两个融合蛋白分别构建在穿梭 质粒上，一个是将Gal4的DNA-BD与酵母蛋白 质粒上，一个是将 的 与酵母蛋白 SNF1融合；另一个是将Gal4的AD和酵母蛋白 融合；另一个是将 的 和酵母蛋白 融合 SNF4融合。 融合。 融合 其中， 是一种丝氨酸/苏氨酸的蛋白激 其中，SNF1是一种丝氨酸 苏氨酸的蛋白激 是一种丝氨酸 是它的一个结合蛋白， 酶，SNF4是它的一个结合蛋白，这两种蛋白是 是它的一个结合蛋白 已知可以相互作用的。 已知可以相互作用的。
（二）酵母双杂交系统的原理
X
DNA-BD
GAL4 UAS
Promoter
lacZ(or HIS) reporter gene
AD
Y
GAL4 UAS Promoter lacZ(or HIS) reporter gene
AD
X
DNA-BD
Y
Promoter
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
transcription
lacZ(or HIS) reporter gene
1989年美国纽约州立大学的 年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述 年美国纽约州立大学的 和 首先描述 了酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)。 了酵母双杂交系统 。 该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过 程的认识。 程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： 参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域： DNA结合结构域 结合结构域(BD) 结合结构域 (DNA binding domain)
酵母双杂原理
酵母双杂原理酵母双杂原理是指利用两种不同的酵母株，分别进行杂交，产生新的杂交酵母株的方法。
这种方法被广泛应用于酿造、面包制作、酒精生产等领域。
酵母是一种单细胞真菌，广泛存在于自然界中。
酵母可以利用葡萄糖等碳水化合物进行发酵，产生二氧化碳和乙醇等物质。
这种发酵作用被广泛应用于酿造、面包制作、酒精生产等领域。
酵母双杂原理的出现，是为了解决酿酒、面包制作等领域中出现的问题。
传统的酿造方法中，只使用一种酵母株进行发酵，容易出现酵母菌株的变异，导致酿造的质量下降。
而酵母双杂原理可以产生新的杂交酵母株，这些酵母株具有更好的性能和更强的适应性，可以提高酿造、面包制作的效率和品质。
酵母双杂原理的具体操作方法是：先分别选取两种不同的酵母株，进行培养和筛选。
然后将这两种酵母株进行杂交，产生新的杂交酵母株。
最后对杂交酵母株进行筛选和培养，获得具有更好性能的酵母株。
酵母双杂原理的应用非常广泛。
在酿酒领域中，利用这种方法可以产生更好的酵母株，提高酒的品质和产量。
在面包制作领域中，利用这种方法可以产生更好的酵母株，提高面包的质量和口感。
在酒精生产领域中，利用这种方法可以产生更好的酵母株，提高酒精的产量和纯度。
除了以上领域，酵母双杂原理还可以应用于其他领域，如生物医学、生物能源等领域。
在这些领域中，酵母双杂原理可以产生更好的酵母株，提高生产效率和产量，为人类的生产和生活带来更多的福利。
酵母双杂原理是一种非常重要的酵母育种方法，可以产生更好的酵母株，提高生产效率和产量。
随着科技的不断进步，相信酵母双杂原理将会在更多的领域中发挥作用，为人类创造更多的福利。
酵母双杂交技术的原理及其应用
酵母双杂交技术的原理及其应用1. 引言酵母双杂交技术是一种经典而常用的分子生物学技术，用于研究蛋白质间相互作用以及蛋白质与DNA或RNA的相互作用。
本文将介绍酵母双杂交技术的原理及其应用。
2. 原理酵母双杂交技术基于酵母细胞内的转录因子相互作用原理，利用酵母细胞内的转录活性来检测蛋白质间的相互作用。
其基本步骤如下：1.构建载体：将目标蛋白质的编码序列克隆到酵母双杂交载体中，该载体通常包含一个激活域和一个DNA结合域。
2.构建酵母菌株：将构建好的双杂交载体转化到酵母菌株中，产生转录因子的表达。
3.杂交实验：将两个不同的酵母菌株分别转化目标蛋白质的编码序列，使得两个蛋白质分别与激活域和DNA结合域相连。
4.检测蛋白质相互作用：利用报告基因检测酵母菌株中的转录活性，若目标蛋白质间存在相互作用，则报告基因被激活，并产生可观察的表型。
3. 应用3.1 蛋白质相互作用研究酵母双杂交技术广泛应用于研究蛋白质间的相互作用关系。
通过构建不同的载体和菌株，可以很方便地筛选和鉴定蛋白质相互作用的结构域和关键基序。
这有助于揭示蛋白质相互作用的机制和信号通路。
3.2 酶底物筛选酵母双杂交技术还可以用于酶底物的筛选。
通过将酶和可能的底物序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以快速筛选出与酶底物结合的蛋白质。
这对于研究酶的底物特异性和酶促反应机理具有重要意义。
3.3 药物靶点筛选利用酵母双杂交技术，可以通过构建包含药物分子和可能的靶点蛋白质的双杂交载体，进行药物靶点的筛选。
这种方法可以高效地从大量的分子库中筛选出与药物相互作用的潜在靶点，对于药物开发具有重要意义。
3.4 蛋白质与DNA/RNA相互作用研究除了研究蛋白质间相互作用外，酵母双杂交技术还可以用于研究蛋白质与DNA/RNA的相互作用。
通过将DNA/RNA序列与目标蛋白质的编码序列构建成双杂交载体，并转化到酵母菌株中，可以检测蛋白质与DNA/RNA的相互作用，并进一步研究该相互作用的功能和调控机制。
酵母双杂交原理和具体流程
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酵母双杂交是一种利用酵母遗传学方法来研究蛋白质相互作用的技术。
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研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以来都受到重视，是研究细胞信号传导等非常重要的方面。
我就我现在做过的方法给大家介绍一下，抛砖引玉了，大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法：1、酵母双杂交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持着自己的优势。
酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
但是酵母双杂交有自己的缺点：⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
“假阳性”对策：即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。
所以对于做出来有互作的结果还应该继续通过别的方法来验证。
“假阴性”的产生：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。
这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。
二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。
目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。
2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。
这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。
是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
优点在于：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点在于：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。
所以可以作为酵母双杂交的进一步的验证，达到互补的效果。
体内互作的研究1、荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移(FRET)：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子) 的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
FRET 程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10 nm 时即可发生FRET; 随着距离延长，FRET呈显著减弱。
由于只有在蛋白之间的距离达到10nm一下才会发生FRET，而10nm要小于蛋白互作要求的距离，所以FRET是衡量体内互作的强有力的证据。
2、双分子荧光互补(BiFC)是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术。
该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达，如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolor BiFC)，不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成，还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前，该技术已用于转录因子，G蛋白βγ亚基的二聚体形式，不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上。
由于BiFC的直观，而且在最接近活细胞生理状态的条件下观察到其相互作用发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性，以及细胞信号分子对其相互作用的影响等，这些信息对研究蛋白质相互作用有一定意义。
所以，BiFC越来越受到研究人员的青睐。
酵母双杂交的相关知识时间：2009-12-29 16:45:17 来源：作者：点击：153次结构组成：酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。
利用此系统已分析和测定了多种重要结构域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v， p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen， PCNA) 的结合序列vi等。
此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。
特点与优点：酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。
⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。
⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、 p16与CDK4iv等之间的相互作用。
局限性和存在的问题酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法，有多方面的应用，但仍存在一些局限性。
⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。
由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。
另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
许多研究者对双杂交系统进行了改进和发展。
例如采用假阳性显示分析法和双筛选系统以减少"假阳性"的发生；发展哺乳动物双杂交系统更好地研究蛋白将的相互作用。
其中双筛选系统用二种不同的报告基因(常用lacZ和HIS3)有以下优势vii:⑴用不同的启动子表达位于酵母二个染色体上的报告基因，可明显减少假阳性。
⑵通过营养型筛选增强了筛选能力，尤其适用于对较大的库容量而被选蛋白较少情况下的筛选。
哺乳动物双杂交系统Ⅷ也是一种基因水平上以重建转录因子功能为基础的体内分析方法。
在此系统中，一种感兴趣的蛋白与Gal4--DNA结合结构域构成融合蛋白，另一种蛋白与单纯疱疹病毒VP16蛋白的激活结构域以融合蛋白表达。
表达这些融合蛋白的载体与一个报道载体（CAT）共同转染哺乳动物细胞系。
报道质粒含一个Gal4结合位点下游的cat基因。
假如两个融合蛋白相互作用则cat报道基因表达水平明显增高。
用此系统证实了P53蛋白与大T抗原的相互作用，得到了酵母双杂交系统相同的结果。
且较酵母双杂交系统更为快速，在转染48h内得到结果。
并且在哺乳动物细胞能更好模仿体内的蛋白-蛋白相互作用。
因而，哺乳动物双杂交系统可作为酵母双杂交系统的辅助手段。
酵母双杂交基本原理时间：2009-12-29 16:32:07 来源：作者：点击：170次酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。
典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构(transcription-activating domain)。
前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。
而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。
酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。
主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。
上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。
融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。
例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。
因此，在GAL4-ad 氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。
目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。
常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。
双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。