巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
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有一个外源基因 /65 等。通用的整合载体多含有 ! "#$ 启动子 ， 和一个从 ! "#$ 基因上拷贝下来的 终 表达框、 多克隆位点（ %&’ ） ， 作 为 筛 选 标 记 的 ()*+ 基 因 和 在 细 菌 中 进 行 复 制 起 止序列（ 77） 始点和选择标记（ 如 )89:5 复 制 起 始 点 和 抗 氨 苄 青 霉 素 基 因 ） 以 使外源基因能以同源重组的方式整 及 ! "#$ *;的非编码区序列， 合到染色体的 ! "#$ 部位（ 表 5） 。
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6毕赤酵母介绍
毕赤酵母及级胰岛素——优思灵巴斯德毕赤酵母(P／ch／a pastor／s)表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。
酵母作为一种最简单的单细胞真核生物, 兼有原核生物和真核生物的某些优点。
毕赤酵母生活史与酿酒酵母十分相似。
这使得毕赤酵母的发酵工程部分可与酿酒酵母相同, 从而节省了重新购臵设备和进行新技术探索的巨额花费, 这是用其他方法进行大规模商品化的外源蛋白生产所不能比拟的优势。
现将毕赤酵母表达系统优点概括如下:①毕赤酵母更接近高等真核细胞, 不含内毒素和其他有害物质, 使用安全;②同酿酒酵母一样, 繁殖速度快, 对培养条件要求低, 培养基价廉, 能进行高密度培养, 且能耐受较高的液体静压, 便于工业化生产;②该系统的载体能与核基因组进行整合, 因此构建的菌株较稳定, 一般不会在传代过程中出现丢失现象;③在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内, 又可在分泌信号作用下将蛋白分泌至胞外;⑤具有强有力的易控制的乙醇氧化酶基因(AOX1)或磷酸甘油酸脱氢酶( GAP) 基因启动子作为外源基因启动子, 可对外源蛋白的表达进行严格调控;⑥作为真核表达系统, 可对表达的外源蛋白进行翻译后的加工和修饰, 即二硫键的形成、脂肪的酰化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N糖基化、O糖基化, 从而使目的蛋白具有所应有的生物学活性;⑦外源蛋白表达量高, 同时自身分泌的背景蛋白少, 表达产物易于纯化;⑧和酿酒酵母相比, 毕赤酵母中加到翻译蛋白上的糖链长度平均每条侧链为8～14个甘露糖残基, 比酿酒酵母每条侧链平均50～150个甘露糖残基短得多。
毕赤酵母极少出现过渡糖基化, 可避免外源蛋白生产过强的免疫原性或因糖链过长干扰外源蛋白正确折叠而影响其功能, 而且糖链中不含具有致敏作用的α21, 32甘露糖, 使其使用更加安全。
巴斯德毕赤酵母表达系统研究系统进展
➢翻译后修饰
毕赤酵母糖蛋白因与哺乳动物糖蛋白糖链结构的差 异而具有潜在的抗原性，使其在医药工业上的应用受到 一定的制约。它们在哺乳动物体内可被免疫系统清除而 失去效能，而且有引起超敏反应的危险性。
解决糖基化策略：
①尝试胞内表达，避免目的蛋白的糖基化；
②对非活性中心的糖基化位点进行突变改造，清除糖基 化；
稀有密码子制约翻译速率
此时需要进行全基因的合成，使编码序列 符合毕赤酵母密码子的偏爱性和具有更高的
➢基因剂量
相对剂量效应
一般情况下，随着整合拷贝数的增加，表达量也会增加， 例如，1-8整合拷贝数范围内，HBsAg表达量成比例升高。 但也有例外，如小牛溶菌酶的表达随着拷贝数从1-3的上 升反而减少，这可能与mRNA翻译、蛋白折叠效率有关。
重组子在酵母细胞中的命运
导入毕赤酵母的重组质粒能通过同源重组整合到 染色体上，不同的整合方式可产生不同表型的转化子：
（1）同源双交换：表达载体线性化后，两端分别为5’AOX1和 3’AOX1序列，与基因组的同源序列发生双交换后，导致毕赤 酵母基因组内AOX1编码区被表达单元所替换，胞内醇氧化酶 只能来自AOX2基因，酶活性大大降低。因此转化子表现为甲 醇利用缓慢，表型为Muts。
若整合发生在his4位点处，可能出现表达单 元丢失现象，这可能是由于基因组中突变的his4与表 达单元中的his4基因之间发生了基因转换（gene conversion）所致，所以一般选择AOX1位点整合。
his4
用于转化子筛选的基因标记
用于毕赤酵母转化子筛选的基因标记主要有营养 缺陷型互补基因和显性基因：
二、巴斯德毕赤酵母简介
Pichia pastoris
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能 够在低 廉的甲醇培养基中生长，甲醇能高效 诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达， 因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属 强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵 母表达系统的三大优势。由于巴斯德毕赤酵 母没有合适的自主复制型载体，所以外源基 因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA 上，因此能够稳定遗传。目前已有500多种 外源蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功 表达。
毕赤酵母常用培养基与载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理及其控制策略1.巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的降解机理在外源蛋白的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此，不论是胞内表达亦或是分泌表达，大多数外源蛋白均面临着被降解的问题，这也是影响表达量的一个重要因素，同时，还增加了纯化目的蛋白的难度。
近年来，蛋白酶的研究是P.pastoris表达系统一个重点和热点。
越来越多的蛋白酶的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究。
P.pastoris能根据细胞生长环境（碳源的改变以及细胞或细胞器的胁迫）来调整自身酶系，以合成与降解不同的蛋白和细胞器，液泡是蛋白质降解最主要的场所，另一降解场所是细胞基质蛋白酶体中。
但是，对于外源蛋白来说，其降解常在表达和分离纯化的第一步，主要是由培养基中胞外蛋白酶，细胞外膜结合蛋白酶（cell-bound proteases）和细胞自噬或裂解释放的胞内蛋白酶降解的。
胞内蛋白酶主要涉及降解蛋白质前体产生活性蛋白；切除转运出膜后的蛋白质信号肽；使调控蛋白失活；降解变异或不需要的蛋白质；提供营养，前体和能量。
胞外蛋白酶分泌较少，主要降解部分蛋白质提供氨基酸和多肽等营养。
根据蛋白酶的分泌和作用地点，P.pastoris的胞内蛋白酶可以分为三种类别，即液泡蛋白酶（vacuolar proteases），细胞基质蛋白酶体（the cytosolic proteosome）以及分泌途径的蛋白酶（proteases located along the secretory pathway）。
表1.2毕赤酵母液泡蛋白酶和分泌途径蛋白酶Table 1.2 Proteases of Pichia pastoris vacuole and secretory pathwayEnzyme Type Gene Zymogen formVacuole PrA Aspartic PEP4 YesPrB Serine PRB1 YesCpY Serine PRC1 YesCpS Metallo-( Zn2+) CPS1 UnknownApI Metallo-( Zn2+) LAP4 YesApCo Metallo-(Co2+) DAP2 NoDPAP-B Serine SEC11 UnknownSecretory pathway signal peptidase Kex2 protease Serine KEX2 Yes Kex1 carboxypeptidase Serine KEX1 NoDPAP-A Serine STE13 Unknown,predict noYeast as partyl protease ш Aspartic Y AP3 Unknown,predict yes酵母液泡位于基质中，一方面是维持胞内pH和盐离子平衡，储藏盐离子的功能；另一方面，由于液泡中含有大量的非特异性的水解酶，较宽底物范围的内生和异源蛋白酶，液泡是降解蛋白甚至细胞器的一个重要场所，大约80％的蛋白在液泡中降解。
毕赤酵母的培养基1
毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。
MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。
MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。
不同微生物的基本培养基是不相同的。
2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。
4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。
毕赤酵母的培养基1
毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。
MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。
MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。
不同微生物的基本培养基是不相同的。
2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。
4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。
毕赤酵母常用表达载体
毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。
分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。
胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。
工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。
毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。
其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。
多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
巴斯德毕赤酵母
1）基因插入 AOX1 或 aox1::AGR4 位点
2）基因插入 His4 位点
3）多拷贝插入表达载体 如 pPIC9K，pPIC3.5K
3.实验方法及结果
1) 酵母表达载体 pPICZαB-ggh 的构建
带有 KpnⅠ和 NotⅠ两种酶切 位点的 GGH 引物
pPIC9K-ggh
ggh 基因 连 pMD19-T Simple Vector
1基因插入aox12基因插入his4酵母表达载体ppiczbggh的构建ppic9kggh带有kpn和ggh引物ggh基因pmd19tsimplevectorcolijm109验证抽提质粒kpnppiczbppiczbgghcolijm109转化筛选阳性克隆pcr双酶切鉴定2000bp左右的dna片段2重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞510ppiczbgghpme线性化56kb片段回收20保存备用电转化biorad涂布培养30免疫斑点法筛选高表达菌株将菌落转移到醋酸纤维素薄膜上bmmy平板上置同样大小的022的硝酸纤维素薄膜将醋酸纤维素薄膜菌落面向上置于硝酸纤维素薄膜上30培养80h上层醋酸纤维素薄膜转移至md平板上保存下层硝酸纤维素薄膜取出5脱脂奶封闭次
本研究证明了两次电转携带有同种目的基因的不同分泌型表 达质粒，通过高浓度的抗生素结合免疫法筛选， 不仅可以提高目的基因的拷贝数，并且在一定范 围内提高了外源蛋白的表达量。这种双质粒共 表达体系不仅可以提高单一蛋白在宿主中的表 达量，还可以实现两种不同的蛋白在同一宿主 中的共表达。
4.讨论
3）本实验通过建立双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母中的表达，然后通过高浓度的抗生素抗性结合 免疫斑点法进行高通量的筛选，获得的高产菌 GS115/F 3 融合蛋白的表达量将近提高了一半，和出发菌株 GS115/F 2 相比表达的蛋白质结构一致。影响外源蛋白在毕赤酵母 中的表达因素还很多，它不仅受外源基因特性的影响，也 受到宿主菌、Mut表型、酶切和糖基化及培养条件 的影响，所以应从影响毕赤酵母蛋白表达的多种 因素着手提高融合蛋白 GGH 的表达量，实现 规模化制备。
毕赤酵母菌
——毕赤酵母
（Pichia.pastoris）
by：文慧霖、裴颖
· 毕赤酵母的介绍 · 毕赤酵母的形态特征 · 毕赤酵母的生产过程 · 毕赤酵母的优缺点 · 毕赤酵母的开发利用
毕赤酵母菌
——全称巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养 型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一 碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样， 在无性生长期主要以单倍体形式存在， 当环境营养限制时，常诱导2个生理类 型不同的接合型单倍体 细胞交配，融 合成双倍体。
毕赤酵母结构图
毕赤酵母显微图
优缺点
Pichia.pastoris酵母菌体内无 天然质粒，所以表达载体需与宿 主染色体发生同源重组，将外源 基因表达框架整合于染色体中以 实现外源基因的表达。包括启动 子、外源基因克隆位点、终止序 列、筛选标记等。表达载体都是 穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩 增，然后被导入宿主酵母细胞。 为使产物分泌胞外，表达载体还 需带有信号肽序列。
生产过程
（1）细胞增殖繁衍；
（2）分批流加的过渡阶段（甘油或葡萄糖）； （3）诱导表达阶段（甲醇）；
各阶段碳源都为限制 性基质,其补加速率的 动力学模型是高效表 达的基础。
甲型优点
(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调
控机理最严格的启动子之一；
(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的 90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化； (3)在简单合成培养基中可实现高密度培养； (4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝 的形式稳定整合； (5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多 数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。Fra bibliotek甲型不足
(1)发酵周期长；
(2)甲醇易燃易爆有毒，存在一 定的危险性； (3)筛选高产菌株需用的药物价 格比较昂贵； (4)培养基和培养条件不成熟。
巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统综述
毕赤酵母发酵工艺对产量的影响
甲醇营养型毕赤酵母表达外源蛋白发酵一般有二个阶 段，即酵母细胞营养生长阶段和外源蛋白表达阶段。 酵母细胞生长阶段主要目的为达到一定的菌体量，另 一方面通过流加限制甘油来抑制甲醇代谢途径，并使 细胞从甘油相顺利向甲醇相过渡。 蛋白表达阶段由于毕赤酵母具有以甲酵作为唯一碳源 和能源的特性，且外源基因就插入在能够利用甲醇的 AOX基因中，当甘油用完时立刻补入甲醇诱导AOX基 因产生醇氧化酶来利用甲醇，同时启动表达外源基因 的AOX的启动子(PAOX)表达外源基因蛋白
表达效率高，外源蛋白分泌高，产物易于纯化
毕赤酵母的缺点
发酵周期长，甲醇易燃易爆有毒，存在 一定的危险性。
产物蛋白质可能出现不均一、信号肽加 工不完全、内部降解、多聚体形成等， 造成表达蛋白质在结构上的不一致。时 常遇到表达产物的过度糖基化情况
重组毕赤酵母的表型
毕赤酵母工程菌株有Y11430，MG1003，GS115 （AOX1）， KM71，SMD1168 根据利用甲醇的能力 , 可将巴斯德毕赤酵母分成三型 Mut+ ：毕赤酵母具有完整的AOX1 和 AOX2 基因 , 能够在甲醇 中以野生型速率生长 , 为甲醇快利用型如GS115 , 绝大多数毕赤 酵母为 Mut+表型。 Muts ： 此型毕赤酵母 , 如 KM71的 AOX1 基因部分敲除 ,被酿 酒酵母ARG4 基因所取代 , 菌细胞可依赖 AOX2基因编码的少 量醇氧化酶完成甲醇代谢 , 因此在甲醇培养基中生长缓慢 , 胞内 表达尽量选择muts。 即 Mut-型 , 此型毕赤酵母 AOX1 及 AOX2 基因均被敲除 ,菌细 胞不能进行甲醇代谢 , 无法在甲醇中生长 ,为甲醇不利用型。
巴斯德毕赤酵母生物过程
巴斯德毕赤酵母生物过程
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种广泛用于重组蛋白生产的生物表达系统。
巴斯德毕赤酵母的生物过程涉及以下几个关键步骤：
1. 基因插入：通过同源重组将目标基因插入到巴斯德毕赤酵母的基因组中，通常插入到甲醇氧化酶（AOX1）基因的位置，利用其强启动子来实现高效表达。
2. 蛋白质表达：在甲醇的存在下，巴斯德毕赤酵母会被诱导产生大量的重组蛋白。
甲醇氧化酶是巴斯德毕赤酵母代谢甲醇的关键酶，其在细胞中的含量会随着甲醇的加入而显著增加，从而带动目标蛋白的表达。
3. 蛋白质折叠和修饰：巴斯德毕赤酵母具有真核生物的翻译后修饰能力，包括糖基化、二硫键形成等，这对于许多蛋白质的功能至关重要。
4. 蛋白质分泌：巴斯德毕赤酵母能够将重组蛋白分泌到培养基中，这有助于简化后续的纯化过程。
由于其内源分泌蛋白的产生有限，重组蛋白的纯化相对容易。
5. 过程优化：为了实现目标蛋白质的最大产量，需要对培养条件进行优化，包括甲醇和山梨糖醇的浓度、菌株的形式（Mut表型）、温度和孵育时间等因素的调整。
巴斯德毕赤酵母作为一种高效的表达系统，不仅操作简便，而且能够提供适当的蛋白质折叠和翻译后修饰，使其成为生产重组蛋白的理想选择。
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述
毕赤酵母高密度发酵菌株优选及分离纯化技术综述发布时间：2021-11-01T06:56:24.297Z 来源：《科学与技术》2021年第21期作者：徐倩[导读] 巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一徐倩（义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司，河南三门峡，472300）摘要：巴斯德毕赤酵母，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
巴斯德毕赤酵母是单细胞真核生物，生长快，易于分子遗传学操作；巴斯德毕赤酵母的醇氧化酶I(Alcohol 0xidaSel，A0Xl)基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；目的基因整合在染色体上具有高稳定性；可高水平分泌表达重组蛋白，纯化方便；发酵工艺成熟，易放大，且培养成本低，产品易分离。
本文根据生产实践经验，就巴斯德毕赤酵母菌株的研究进展、高密度发酵菌株的优选及分离纯化技术进行了总结和综述。
关键词：毕赤酵母、菌株、优选、分离纯化1.前言1.1背景和意义近年来发酵工程迅速崛起，从“乐百氏奶”等乳酸菌饮料，到比黄金还贵的干扰素等药品，都是微生物对人类的无私奉献。
微生物在发酵过程里充当着生产者的角色，这与它的特性密不可分的。
它们对周围环境的温度、压强、酸碱度、干湿条件都有极强的适应力。
发酵的规模越大，批次所需的种子也就越多。
要使小小的微生物在短时间内完成如此巨大的发酵任务，那就必须使菌种扩大培养。
而扩大培养的前提就是必须要有相对数量、相对稳定、代谢旺盛的种子。
菌种纯化是指从菌种的细胞或孢子群体中淘汰衰退的个体，分离出优良的个体，从而保持菌种的纯度和优良的特性。
以巴斯德毕赤酵母为例：近年来毕赤酵母表达系统极受研究者的青睐，已有300多种外源蛋白在该表达系统中获得表达，主要用于人类药物的生产，还包括来自植物、动物和细菌的各种酶，膜受体蛋白，含辅基的蛋白质以及可用于研究晶体结构的蛋白质等。
它还可以同时表达酶组分比例适当的一个酶系，使全细胞作为生物催化剂。
毕赤酵母的培养基1
毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。
MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。
MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。
不同微生物的基本培养基是不相同的。
2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。
121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。
加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。
4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。
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巴斯德毕赤酵母表达系统
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巴斯德毕赤酵母表达系统是近十年发展起来的真核表达体系，是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一，与现有的其它表达系统相比，巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分秘、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势，现已广泛用于外源蛋白的表达。
编辑摘要
巴斯德毕赤酵母表达系统 - 简介
十年代巴斯德毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（SCP），有很好的发酵基础，菌体密度可达100g/L干重。
其生长培养液的组分包括无机盐、微量元素、生物素、氮源和碳源，廉价而无毒。
它能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30%。
而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。
AOX的合成是在转录水平调控的。
其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。
此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导又重机制控制的。
外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。
巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。
合成的蛋白质贮存于微体中，可免受蛋白酶的降解，且不对细胞产生毒害。
巴斯德毕赤酵母表达系统 - 毕赤酵母表达系统的特点
自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。
而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势：
1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；
2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。
毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。
绝大多数外源基因比在细
菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。
一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化；
3）发酵工艺成熟，易放大。
已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升；
4）培养成本低，产物易分离。
毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；
5）外源蛋白基因遗传稳定。
一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；
6）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
与其他表达系统比较
+ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多
产品性能：
优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化
缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题
巴斯德毕赤酵母表达系统 - 巴斯德毕赤酵母的载体
是整合型载体。
常见的表达载体有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。
典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。
此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及
3'AOX1区。
当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。
载体构建方法
与建立酿酒酵母基因工程表达系统类似，构建巴斯德毕赤酵母表达菌株的基本方法如下：
(1)经典遗传学操作方法（如突变体分离、互补分析、回交和单孢分析）；
(2)分子遗传学方法（如DNA转化、基因置换等。
）为了获得高稳定的外源蛋白表达菌株，巴斯德毕赤酵母表达载体连同外源基因通过同源重组整合至宿主染色体基因组座位上。
与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。
含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。
多拷贝表达菌株的获得方式有两种。
一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。
得到产量高的表达菌株。
另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。
在发酵罐培养的产物选择压力下此两种方式获得的多拷贝表达菌株被证明是稳定的。
经同一表达载体转化后分离得到的不同转化子，其产物的表达水平不同。
即使受体染色体上重组了相同数目的表达盒。
转化子的表达情况也不近相同。
因此，为了获得高产量的表达菌株，需要对大量的转化子进行筛选。
小量摇瓶培养无疑是筛选转化子简便而有效的方法。
但是由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。
主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。
但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。
巴斯德毕赤酵母表达菌株的培养条件
包括：适宜的培养液缓冲系统及适当的发酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通气量；添加适量的蛋白胨或酪蛋白水解物以避免产物被蛋白酶降解并为
外源蛋白的合成及分泌提供氨基酸和能量。
在甘油作碳源的培养液中，细胞迅速生长，菌体密度逐渐增大，但此时外源基因的表达被完全抑制。
而当甘油缺失或被完全消耗时，甲醇被添加到培养液中，诱导产生外源蛋白。
此阶段菌群生长迟缓，但产物表达旺盛。
巴斯德毕赤酵母表达系统 - 巴斯德毕赤酵母表达外
源蛋白表达
分胞内的表达和分泌到胞外两种方式。
毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
当然，利用外源蛋白本身的信号序列很方便，因为基因的全部编码序列可以插入到表达载体的单个或多个克隆位点。
但在许多例实验中，巴斯德毕赤酵母不能利用外源基因本身的信号序列引导分泌。
而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号——α交配因子引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌，如鼠表皮生长因子，产量达0.45g/L。