HIV假病毒的制备及感染性检测

假病毒包装和检测方法，假病毒感染CEM细胞

来源: 日期：2011-4-11(共有0 条评论) 我要评论

我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。

(一)材料

1．质粒

pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。

pSV7d-Env：质粒把HIV-1的外壳蛋白基因(如HXB2、JR．FL、ADA、BAL的env基因)插入质粒载体pSV7d。

两个质粒为Amp抗性，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。

2．细胞系和培养基

HOS细胞或U87细胞的培养基为DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。悬浮细胞的培养基为RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。一般情况下，需要加入puromycin(1ug／m1)来维持共受体分子的长期表达。

3．Ca3(P04)2转染试剂

2×HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。加去离子水至100ml，调pH至7．05～7．15，灭菌后4~C保存；2．0mol／L CaC12：29．40g CaCl2.H2O，加去离子水至100ml，灭菌；去离子水，灭菌。

4．感染试剂和荧光素酶检测试剂

Polybrene(Sigma)8mg／ml溶于PBS，-20℃保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。

(二)方法

1．假病毒粒子的包装

1)转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个／10ml DMEM ／10％FBS

2)用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env两个质粒共转染293细胞。转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两个质粒，加入70ul的2．0mol ／L CaCl2，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中；

3)转染24h后换培养基；

4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀；

5)分装成lml小管，一80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。

2．假病毒感染HOS细胞或U87细胞

1)感染前一天，传HOS．CD4细胞或U87．CD4细胞(表达共受体分子)至24孔板，

5×10^3个／孔／1ml DMEM／10％FBS(不加嘌呤霉素)。

2)把培养基换成含假病毒(10ng p24)的0．5ml的DMEM／10％FBS，可加入终浓度为8ug／ml的Polybrene来增强病毒感染力，也可不加。同时，加入不同浓度梯度的药物。

3)5~18h后更换含不同浓度梯度药物的新鲜培养基。

4)转染后3天，收集细胞：弃培养基后，用lml PBS洗涤细胞，重悬细胞后，100g离心5min细胞弃上清，用200ul的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育2min。

5)12 000g离心2min取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的EC50值。

3．假病毒感染CEM细胞

1)感染前一天，传CEM细胞，培养基为RPMI-1640／10%FBS；

2)调CEM细胞数为3×10^5／ml，加细胞300u1/孔至24孔板，同时加入假病毒(10ng p24)和不同浓度梯度的药物；

3)3～5h后加入含不同浓度梯度的药物的0．5ml培养基；

4)转染后3天，收集细胞：用1．5ml的离心管收细胞后，100g离心5rain细胞弃上清，用200ul的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育2min；

5)12 000g离心2min取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。计算药物抑制假病毒复制的ECso值。

①假病毒也能感染一些原代细胞，如PBMC，但检测时间为5～10天。

②为获得较高的荧光素酶读值，高效的转染是关键。如果包装的假病毒滴度比较低(p24抗原的浓度小于50~100ng／ml时)，假病毒感染293细胞后，荧光素酶读值会非常低。此外，假病毒的宿主细胞293细胞的状态非常重要，因为293细胞是非常灵敏的。如果感染假病毒前，293细胞贴壁性不好或293细胞形态不饱满，感染效率也是很低的，荧光素酶读值也会很低，可以考虑用293T细胞来代替293细胞。

③荧光素酶的底物产生的荧光是非常强的，但产生的荧光也很短暂，半衰期为5min左右，Packard公司提供的荧光素酶试剂盒产生的荧光半衰期要长一些，为lh左右，如果检测时间需要比较长的话，可用Packard公司产品。

④假病毒从一80℃融化后，应立即使用；即便马上再次冻融，活性也只有原来的一半左右。

⑤一般来说，包含AMLV或VSV病毒衣壳蛋白的假病毒的感染力要比包含HIV衣壳蛋白的假病毒活性高1～2倍，用AMLV病毒衣壳蛋白的假病毒感染细胞时，假病毒的推荐用量是5ng左右。

⑥在用假病毒检测化合物活性时，注意化合物的自发荧光对检测效果的影响。

⑦因感染和复制过程不同，假病毒不能完全替代活病毒，经假病毒筛选后的活性物质应使用活病毒确证其活性。