HIV假病毒的制备及感染性检测
假病毒技术用于抗HIV_1药物筛选及抗药性分析
2010, 30( 3)
谢桂煌 等: 假病 毒技术用于抗 H IV 1药物筛选及抗药性分析
97
制在宿主细胞 中 表达 报告 基 因。 在报 告细 胞型 系 统 中, 报告基因被引入到靶细胞系中。如 TZM b l细胞 系 便是一种能够表达 Lu c基因的报告细胞系, 它能在 H IV T at蛋白的诱导下表达荧光素酶, 并可以通过这种途径 来反映假病毒在宿主细胞中的复制情况。
中国生物工程杂志 China B io techno logy, 2010, 30( 3) : 95 99
综述
假病毒技术用于抗 H IV 1药物筛选及抗药性分析*
谢桂煌 1 赵声兰 2 陈朝银 1**
( 1 昆明理工大学 /清华大学生物资源开发工程研究所 昆明 650224 2 云南中医学院 昆明 650200 )
3 H IV 1假病毒感染细胞系统的应用
3. 1 应用于筛选抗 H IV 1药物 由于 H IV 1假病毒在感染细胞和细胞内复制循环
过程中的很多环节 与野生型病 毒相同, 因此 被越来 越 多地应用于抗 H IV 1 药物的筛选及药物抗病毒效果的 评价。与此同时, 利用假 病毒系统 进行药物 评价的 准 确 性 和 可 行 性 也 同 样 受 到 广 大 学 者 的 关 注。 H eynd rickx等 [ 5]为了证明利用 H IV ENV /H IV env型假病 毒分析系统进行药物抗 H IV 效果评价所获得的结果具 有生物相关性, 构建了 3种抗 H IV 药物评价系统。这 3 种系 统 分 别 是 ( 1 ) 复 制 病 毒 在 外 周 血 单 核 细 胞 ( PBM C s) 中 培 养。 ( 2 ) 对 应 假 病 毒 在 表 达 CD4 和 CCR5 /CXCR 4共受体的 Ghost细胞中 培养。 ( 3 ) 对 应 假病毒在外周血单核细胞 ( PBM Cs) 中培养。在这三个 系统中来比较作用于不同靶位的 6种抗 H IV 参考药物 ( T 20, TAK779, AMD3100、BM S806、AZT 和 E fav iren z) 对 5 种处于不同进 化枝的病毒 分离株的 抗病毒活 性。 使用 JM PV ers ion 5. 0 软件对实验数据进行线性回归分 析后发现, 两种使用 单轮感染循 环的假病毒 系统之 间 具有重要的线性相关关系 ( P < 0. 000 1, R = 0. 866 1 )。 同时与复制病毒系 统相比, 这两 种系统增强 了抗病 毒 实验的敏感性 (分别为 P = 0. 013 和 0. 015) 。最重要的 是, 在两种假病毒系统中, 不管是 假病毒在 Ghost细 胞 中培养 ( P < 0. 000 1, R = 0. 782), 还是假病毒在 PBM C s 中培养 ( P < 0. 000 1, R = 0. 742 )所得到的结果都与 理 论上 预 料 的 结 果 一 致。 同 时 通 过 分 析 进 入 抑 制 剂 BM S806的 5 种衍生物对具 有不同 H IV 亚型包膜假 病 毒的抗病毒活 性, 进 一步 证明 假病 毒系 统的 有效 性。 香港 HKU 巴斯德研究所的 Garcia等 [ 8] 设 计了 V SVG / H IV env和 H IV ENV /H IV env两种 假病毒 模型来 构建 抗 病毒药物筛选系统, 使用已知抗 H IV 药物作为对照, 筛 选作用于 H IV 进入细胞后复制循环靶位的抗 H IV 1 药 物。同时, 通过采用对样 品化合物 进行正交 组合的 方 法来优化实验方案, 建立了一种 高通量的药 物筛选 平 台, 从 48 000种化合物中成功的筛选出 6种在细胞 水 平具有抗 H IV 活性的阳性药物。并且使用一种野生型
HIV-1假病毒包装及感染条件优化
关 键词 ： 人 类免 疫 缺 陷 病 毒 ； 假 病 毒 ； 包装方法 ； 二 乙氨 乙基 葡聚 糖
Ｄ ｏＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ６ ７ ２ － ９ ４ ５ ５ ． ２ ０ １ ７ ． １ ５ ． ０ ０ ３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ２ — ９ ４ ５ ５ （ ２ Ｏ １ ７ ） １ ５ － ２ １ ７ ２ － ０ ３
（ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｆｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｕ ｓ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｓ ， Ｂｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｄｉ ｔ ａ ｎ Ｈｏ ｓ ｐｉ ｔ ａ ｌ Ａｆ ｆｉ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｏ ｆ Ｃ ａ ｐｉ ｔ ａ ｌ Ｍｅ ｄｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ／ Ｂｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｋｅ ｙ
Ｏ ｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏｆ ｐａ ｃ ｋａ ｇ ｅ ａ ｎｄ ｉ ｎｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｔ ｈｅ ＨＩ Ｖ－ １ ｐ ｓ ｅ ｕｄ ｏｔ ｙｐ ｅ ｄ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ
ＣＨ ＥＮ Ｄａ ｎ ｙ ｉ ｎ ｇ， ＬＩ Ｒｕ ｉ ， ｚＨ ＡＮＧ Ｙｕ ｅ ， Ｓ ｏＮＧ Ｃｈ ｕ ａ ｎ， ＨＡＮ Ｊ ｕ ｎ ｙ ａ ｎ， ＺＨ ＡＮＧ Ｙ ｕ ａ ｎ ｙ ｕ ａ ｎ
HIV-1假病毒包装及感染条件优化
HIV-1假病毒包装及感染条件优化陈丹瑛;李蕊;张玥;宋川;韩俊燕;张媛媛【摘要】Objective To optimize the package and infection conditions of human immunodeficiency virus type 1(HIV-1) pseudovirus,in order to obtain a high-repeatability,high-stability and high-infection titer packaging method of HIV-1 pseudovirus and increase the efficiency ofinfection.Methods In view of the transfection efficiency factors,through different transfection ways,pSG3△env plasmid and pcDNA3.1-SF162rev/env plasmid were transfected into 293T cells packaging virus,and the HIV-1 pseudotyped virus were collected after 24 h,48 h and 72h,respectively,then reporter gene after infecting TZM-bl cells for 48 h were detected.Results The HIV-1 pseudovirus was packaged at highest efficiency and titer under optimized conditions,in which the ratio of transfection backbone plasmid and envelope eukaryotic expression plasmid was at4∶1,plasmid mixture and transfection reagent was at 3∶1,and the time of harvest of HIV pseudovirus was at 48 h after transfection.During the infection of HIV-1 pseudovirus,diethylaminoethyl dextran(DEAE-Dextran) at the concentration of 15 μg/mL could increase the efficiency of infection,causing relatively lower toxicity to 293T cell line.Conclusion The package and infection efficiency of HIV-1 pseudovirus are increased and the stability of experiment is improved with optimized key conditions.The results have established foundation for the stability of various applications,such as HIV-1 pseudovirus-based new types of anti-AIDS drugscreening and AIDS vaccine evaluation.%目的对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)假病毒包装及感染条件进行优化,获得高重复性、高稳定性和高滴度的假病毒包装方法和较高的感染效率.方法采用pSG3△env质粒与pcDNA3.1-SF162rev/env质粒共转染 293T细胞包装病毒,对HIV假病毒骨架质粒与env真核表达质粒转染比例、转染试剂与质粒比例、假病毒收获时间对HIV假病毒包装滴度的影响进行实验,同时对感染过程中假病毒接种剂量与二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran) 使用浓度进行了优化.结果在包装过程中当HIV假病毒骨架质粒与env 真核表达质粒转染比例为4∶1、转染试剂与质粒比例为3∶1,转染后培养48 h HIV-1假病毒的滴度最高;在假病毒感染过程中,15 μg/mL的DEAE-Dextran可有效增加假病毒的感染效率且不会对细胞造成较大毒性.结论通过对包装和感染过程中关键条件的优化,可以有效提高HIV-1假病毒的包装和感染效率,增加实验技术稳定性,为新型抗艾滋病药物筛选和艾滋病疫苗评价等研究奠定了基础.【期刊名称】《检验医学与临床》【年(卷),期】2017(014)015【总页数】3页(P2172-2174)【关键词】人类免疫缺陷病毒;假病毒;包装方法;二乙氨乙基葡聚糖【作者】陈丹瑛;李蕊;张玥;宋川;韩俊燕;张媛媛【作者单位】首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所/新发突发传染病研究北京市重点实验室 100015;首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所/新发突发传染病研究北京市重点实验室 100015;首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所/新发突发传染病研究北京市重点实验室 100015;首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所/新发突发传染病研究北京市重点实验室 100015;首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所/新发突发传染病研究北京市重点实验室100015;首都医科大学附属北京地坛医院传染病研究所/新发突发传染病研究北京市重点实验室 100015【正文语种】中文尽管高效抗逆转录病毒治疗(HAART)在很大程度上延长了从感染人类免疫缺陷病毒(HIV)进展为艾滋病的时间，但是长期用药导致的耐药株的出现和药物相关的不良反应都为艾滋病的治愈带来障碍。
HIV假病毒的制备及感染性检测
假病毒包装和检测方法，假病毒感染CEM细胞来源: 日期：2011-4-11(共有0 条评论) 我要评论我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。
(一)材料1．质粒pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。
pSV7d-Env：质粒把HIV-1的外壳蛋白基因(如HXB2、JR．FL、ADA、BAL的env基因)插入质粒载体pSV7d。
两个质粒为Amp抗性，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。
2．细胞系和培养基HOS细胞或U87细胞的培养基为DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。
悬浮细胞的培养基为RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。
一般情况下，需要加入puromycin(1ug／m1)来维持共受体分子的长期表达。
3．Ca3(P04)2转染试剂2×HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。
加去离子水至100ml，调pH至7．05～7．15，灭菌后4~C保存；2．0mol／L CaC12：29．40g CaCl2.H2O，加去离子水至100ml，灭菌；去离子水，灭菌。
4．感染试剂和荧光素酶检测试剂Polybrene(Sigma)8mg／ml溶于PBS，-20℃保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。
(二)方法1．假病毒粒子的包装1)转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个／10ml DMEM ／10％FBS2)用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env两个质粒共转染293细胞。
转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两个质粒，加入70ul的2．0mol ／L CaCl2，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中；3)转染24h后换培养基；4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀；5)分装成lml小管，一80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。
假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范-编制说明
《假病毒作为RNA参考物质的制备和质量控制规范》征求意见稿编制说明一、工作简况（一）任务来源根据国家标准委下达的《关于下达2013年第二批国家标准制修订计划的通知》（国标委综合[2013]90号）要求，由中国检验检疫科学研究院、连云港出入境检验检疫局和北京出入境检验检疫局联合承担了该标准的编制工作。
主管部门为农业部，归口单位为全国水产标准化技术委员会。
本标准根据GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》中的要求进行编写的，本标准编号：20131313-T-424，完成时间为2016年。
（二）修订的必要性在水生动物RNA病毒的分子生物学检测标准中，一般选择灭活病毒中抽提的RNA作为阳性对照。
此方法具有一定的生物安全风险，且RNA极易降解，无法长久保存。
假病毒技术利用包含MS2 噬菌体基因的质粒作为病毒核酸的载体，在大肠杆菌中能将插入的病毒基因转录成RNA，同时表达出MS2噬菌体蛋白包裹病毒RNA，组装成假病毒。
该假病毒不仅含有所需要的RNA片断，而且与MS2 噬菌体类似，能够耐受核酸酶的降解，具有较好的稳定性，且不具复制能力和传染能力，可代替灭活病毒作为参考物质用于RNA 病毒的分子生物学检测。
目前我国还没有相应的国家标准规范假病毒RNA参考物质的制备和质量控制方法。
针对这一情况，本项目计划建立一套技术标准，包括假病毒的制备方法、质量评价方法和保存条件。
通过该标准可以为RNA病毒分子生物学检测提供稳定安全的RNA参考物质。
该标准的建立将有助于提高我国病原分子生物学检测结果的可靠性。
(三)主要工作过程1、准备阶段：本标准完成过程中所使用的质粒为中国检科院动检所自己制备的表达型质粒载体，用于假病毒外膜蛋白的表达。
大肠杆菌感受态来自商业采购，由动检所保存。
同时召集有相关水生动物病毒病诊断经验的科研人员组成工作小组，进行假病毒参考物质制备方法的改进、验证和征求意见稿的起草工作。
2、实验阶段：2014年全年，由中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所牵头，连云港出入境检验检疫局和北京出入境检验检疫局联合实施该标准的实验工作。
假型病毒制备与应用进展
假型病毒制备与应用进展张振杰;崔丽娜;张元鹏;赵协;王亮;常维山【摘要】@@ 假型病毒(Pseudotyped virus)是利用现代生物技术人工合成的一种病毒,它与真病毒相比不仅囊膜上具有其他病毒的糖蛋白,而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被删除,所以这种病毒只能进行"一个细胞周期"的侵染,在慢病毒表达高度发展基础上[1],确保了假型病毒的生物安全性.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)006【总页数】4页(P495-498)【作者】张振杰;崔丽娜;张元鹏;赵协;王亮;常维山【作者单位】山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】S852.61假型病毒(Pseudotyped virus)是利用现代生物技术人工合成的一种病毒，它与真病毒相比不仅囊膜上具有其他病毒的糖蛋白，而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被删除，所以这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染，在慢病毒表达高度发展基础上[1]，确保了假型病毒的生物安全性。
一般在研究传染性强和不易体外培养的病毒囊膜蛋白的功能和性质时，制备假型病毒是一种行之有效的方法。
假型病毒可以模拟真病毒的侵染，它的应用一定程度上避免了高致病性病毒的传播和扩散，在病毒学研究方面显示出许多优势。
另外，具有复制功能和非竞争性的假型病毒载体能够在体外高效地转移靶基因于哺乳动物细胞，并且假型病毒宿主范围广、转染效率高、滴度高[2]、不易被血清补体灭活。
因此假型病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的相互作用，鉴定病毒受体，更重要的是可以用于筛选抗病毒药物、测定患者体内中和抗体的效价、评价疫苗临床免疫的效果和作为基因治疗工具。
HIV-1假病毒的研究进展
避 免 了这方 面 的 可变 因素 。可 以说 ， 稳 定 的质 粒 以
我国 主要流 行 的 Ｃ Ｆ ７ ０ 一 Ｃ Ｂ 、 ＲＦ １ Ｅ 亚 Ｒ ０ ／ ８Ｂ 、 ’ Ｃ ０ 一Ａ 型假病 毒 的工作 ¨ 而 且初 步建 立了基 于假 病 毒 系 ， 统 的中和抗 体 的检测 方 法 ， 也有 报道 应 用假 病 毒 技术 研究 ＨＩ ｖ一１ 制抑 制 剂 ｌ 用 假病 毒检 测 体 复 ２ 。 系应 用于 抗 ＨＩ 药 物 的 检 涮 。但 是 ， 国 ＨＩ 假 ｖ 我 ｖ
【 ｅ ｏｄ ］ Ｖ； ｓｕ ｏｉ ｓｓＥ ｖ Ｋ ｙｗ ｒｓ ＨＩ Ｐ ｅｄ ｖｒ ｅ ； ｎ ｕ
假 病 毒是 一种 病毒 的核酸 由另一种 病毒 编 码 的 包 膜 蛋 白所包 被 ， 而形 成 的具有 外源性 病 毒囊 膜 ， 从
而 基 因组 保 持 着 逆 转 录 病 毒本 身 基 因 组 特 征 的病 毒 。通 常 是将 携带 有某 一种病 毒囊 膜 蛋 白基 因的 载 体 和携 带 另一 种病 毒核 衣壳 骨架基 因 的载体 共 转染
假病毒的包装和检测方法
②为获得较高的荧光素酶读值，高效的转染是关键。如果包装的假病毒滴度比较低(p24抗原的浓度小于50~100ng／ml时)，假病毒感染293细胞后，荧光素酶读值会非常低。此外，假病毒的宿主细胞293细胞的状态非常重要，因为293细胞是非常灵敏的。如果感染假病毒前，293细胞贴壁性不好或293细胞形态不饱满，感染效率也是很低的，荧光素酶读值也会很低，可以考虑用293T细胞来代替293细胞。
③荧光素酶的底物产生的荧光是非常强的，但产生的荧光也很短暂，半衰期为5min左右，Packard公司提供的荧光素酶试剂盒产生的荧光半衰期要长一些，为lh左右，如果检测时间需要比较长的话，可用Packard公司产品。
④假病毒从一80℃融化后，应立即使用；即便马上再次冻融，活性也只有原来的一半左右。
3)转染24h后换培养基；
4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀；
5)分装成lml小管，一80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。
2．假病毒感染HOS细胞或U87细胞
1)感染前一天，传HOS．CD4细胞或U87．CD4细胞(表达共受体分子)至24孔板，5×10^3个／孔／1ml DMEM／10％FBS(不加嘌呤霉素)。
用实例来说明HIV假病毒的包装和检测方法
发布日期：2011-4-21
我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。
(一)材料
1．质粒
pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。
HIV假病毒体系在病毒特性研究和检测中的应用_王佑春
,
,
基 因 另 一个 质粒表达 除
。
,
。
以外 的
其它 所 有 基 因
阳性 的
骨 架质 粒
, ,
,
只 有 骨 架 质 粒 被转 录 成 病毒 基 因 组
一
并包 装 人 假病
一
,
毒 中 因 此产 生 的假 病毒 只 具 有 单轮感 染 的 能力 而 不 具有 产 生子 代 病毒 的 复 制能力
细 胞是 经过 改造 的 细 胞 改 造 后 的细 胞 稳 定表 达
。
,
、
,
一
细 胞 为 靶 细 胞 的假 病 毒 单 周 期 感 染 实 验
。 、
应 用最 广 泛 该 方法 包 括病 毒生产 和 病 毒感 染 检测 两 个 部分 假病 毒生 产 是 通 过 两 质 粒 共 转 染真 核表 达 细 胞
如
一
,
畔
、
竹 等 实 现 的 其 中一 个 质 粒 表 达 全 长 的
,
和
,
该 细 胞 经进 一 步 改 造
基 因感 染 细 胞后 表 达
,
在 细胞基 因 组 中 整 合 入 报 告 基 因 萤火虫 荧光 素 酶基 因 并 且 报 告 基 因 的 表达 是受 的
。
长末 端 重 复序 列 控制
,
假病 毒株 可 以通 过 细 胞表 面 的受 体和 辅 助 受体 感染
,
,
一
共转染
株 具 有 单 轮 感染 性 的 假病 毒株
株 假 病毒 对
,
种抗 病毒 药物 的 表 型 敏感 性实 验
。
共
。
个 其 中有
,
,
HIV-1假病毒的研究进展
HIV-1假病毒的研究进展王艳海【摘要】假病毒是一种病毒的核酸由另一种病毒编码的包膜蛋白所包被,从而形成的具有外源性病毒囊膜,而基因组保持着逆转录病毒本身基因组特征的病毒.假病毒因其丧失了病毒的自我复制能力及其安全系数高等优点,已经被广泛应用于包括人类免疫缺陷病毒(HIV)在内的多项研究中.HIV假病毒通过识别膜蛋白基因的功能有助于研究病毒侵入过程、病毒调节基因功能以及评估中和抗体效价.【期刊名称】《内蒙古医学杂志》【年(卷),期】2012(044)007【总页数】5页(P817-821)【关键词】人类免疫缺陷病毒;假病毒;膜蛋白【作者】王艳海【作者单位】鄂尔多斯市中心医院检验科,内蒙古东胜017000【正文语种】中文【中图分类】R512假病毒是一种病毒的核酸由另一种病毒编码的包膜蛋白所包被,从而形成的具有外源性病毒囊膜,而基因组保持着逆转录病毒本身基因组特征的病毒。
通常是将携带有某一种病毒囊膜蛋白基因的载体和携带另一种病毒核衣壳骨架基因的载体共转染包装细胞,如293T,在包装细胞的细胞膜上表达出病毒囊膜蛋白,另一种病毒的核酸在包装细胞内通过转录和翻译后组装成新的病毒颗粒,当病毒颗粒进行出芽生殖时,包装细胞膜上的囊膜蛋白就包装到新病毒粒子表面,形成有侵染性的假病毒。
与自然源性病毒相比,假病毒整合了其他病毒的囊膜蛋白,而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被修饰掉,所以这种病毒丧失了病毒的自我复制能力,只能进行一个细胞周期的侵染[1];与具有感染性的活病毒相比,利用假病毒进行试验研究安全性较高,整个实验无需专门生物安全实验室[2];另外,假病毒具有广泛的宿主范围、更高的转染效率、比其原病毒更容易浓缩成高滴度[3]、不易被血清补体灭活、非细胞周期依赖性、高效转染静止细胞等优点,假病毒模式已经被广泛应用于包括人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency Virus,HIV)在内的多种研究中[4,5]。
假病毒标准物质在传染性病毒核酸检测质量控制中的应用
林婧等：假病毒标准物质在传染性病毒核酸检测质量控制中的应用1假病毒标准物质在传染性病毒核酸检测质量控制中的应用林婧胡啟龙王尚君朱文夏雪燕茹（南京市计量监督检测院；国家生物技术药物产业计量测试中心，江苏南京210049）摘要:全球传染性病毒的大爆发促进了病毒核酸检测方法的发展和应用。
核酸检测结果的量值溯源和质量控制离不开标准物质。
理想的标准物质应当可以与临床样本并行使用，实现从核酸提取到最终核酸定性/定量的每个步骤的标准化和质量控制。
目前，用作核酸检测质量控制的标准物质多为质粒或体外转录RNA,但其不能控制核酸提取的质量，可能导致假阴性结果。
假病毒和真实病毒的物理结构相似，同时具有生物安全性,可以作为一种更加理想的标准物质，参与从核酸提取到扩增整个过程的质量控制。
关键词:传染性病毒;核酸检测;假病毒标准物质;新型冠状病毒中图分类号:TB9文献标识码:A 国家标准学科分类代码：410.55DOI:40.10998/ki.1009-6941.2021.2.001Utility of Pseudovirus-based Reference Materials for Quality Controlof Infectious Vies Nucleie Acid TestingLIN Jink HU Qilonk WANG Shangjun ZHU Wen XIA Xue YAN RuAbstrocC:Infections Virus ontbreak worldwiln hns prompten thn diagnostin assays basen on nuclein acil amplificn-tion tecnnolooica(NAT).The cnlifration ank peUounancn assessmeni of estaklisaeC assayt ank tbosa unkau evaluation uenuirct referencn mateaais tbat enn ba used in parallei witb tba clinicni sampia ta stankardisa cn contron for aa-eru step of tba pucenuu,from extraction to tba Onai uualitativa/uuantitativa usulb Currently plasmifr ou in vitro 一transcrinen RNA has been utilisen a r foe tbe assays qaCita controi.Such referencn materiair do noi ccntrol foe tbe extraction procenuro and may tbereforo contrinute tr falsa keeativa osu U s.PsenUoVrus is bin-safe, tbonuh stuictralfy resembfe wild virns,which coc IU ad as ak iOeaf referencn materiaf foe tbe entire procenuro from extraction tbronua ta amplifiention.KenworOt:infections vires;nacletc aciO testink；psenaoviulc referencn material;hARh-CoV-2近二十年来，埃博拉病毒（EBOV）、寨卡病毒（Zina Vias）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、新型冠状病毒（hARh-CoV-2）等传染性病毒引发的重大传染病疫情严重影响了人类健康,并造成社会恐慌。
携带绿色荧光蛋白基因的单轮感染活性HIV假病毒的建立及其活性检测
携带绿⾊荧光蛋⽩基因的单轮感染活性HIV假病毒的建⽴及其活性检测病毒学?携带绿⾊荧光蛋⽩基因的单轮感染活性HIV 假病毒的建⽴及其活性检测仇超 彭虹 黄相刚 任莉 潘翔 邵⼀鸣 徐建青【摘要】 ⽬的 构建携带绿⾊荧光蛋⽩基因的HI V 假病毒载体,并研究该载体包装的HI V 假病毒的感染活性,为进⼀步进⾏HI V ⽣物学研究与中和抗体实验室评价搭建安全的技术平台。
⽅法将增强型绿⾊荧光蛋⽩(enhanced green fluorescent protein ,EG FP )基因插⼊到⾻架质粒pN L43Luc R 2E 2的ne f 基因读码框,获得携带EG FP 基因的质粒pN L43EG FP R 2E 2;通过将pN L43EG FP R 2E 2与编码HI V 膜蛋⽩的质粒共转染293T 细胞,收集上清,获得携带EG FP 基因的HI V 假病毒。
该假病毒感染C D4+CCR5+的H OS 细胞后可表达绿⾊荧光,这样通过流式细胞仪可测定表达绿⾊荧光的细胞数与细胞感染率。
结果 携带绿⾊荧光蛋⽩基因的HI V 假病毒感染C D4+CCR5+的H OS 细胞后,被感染的细胞可以表达绿⾊荧光蛋⽩,细胞的感染率与病毒加⼊量呈线性关系。
结论 获得了携带绿⾊荧光蛋⽩基因的HI V 假病毒载体,并建⽴了具有单轮感染活性的HI V 假病毒感染的检测⽅法。
【关键词】 HI V ;绿⾊荧光蛋⽩;假病毒;中和抗体Ch aracterization of a new pseudotyped HIV with a single 2round infectivity carrying enh anced green fluores 2cent protein gene QIU Chao 3,PENG Hong ,HUANG Xiang 2gang ,REN Li ,P AN Xiang ,SH AO Yi 2ming ,XU Jian 2qing.3National Center for AIDS Prevention and Control ,China Center for Disease Control and Preven 2tion ,State K ey Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control ,Beijing 100050,China Corresponding author :XU Jian 2qing ,Email:***********************【Abstract 】 Objective T o construct and characterize a pseudotyped HI V containing enhanced green fluo 2rescent protein (EG FP )gene ,which will serve as a useful tool for HI V virological study and neutralization assays.Methods The plasmid pN L43EG FP R 2E 2carrying EG FP gene was obtained by inserting EG FP gene into ne f open reading frame of the plasmid pN L43Luc R 2E 2.Then EG FP reporter pseudoviruses were generated by co 2trans fection of 293T cells with the plasmid pN L43EG FP R 2E 2and HI V envelope expressing plasmid.Supernatantof co 2trans fected 293T cells were collected and used to in fect C D4+CCR5+and C D4+CXCR4+H OS cells that were engineered to co 2express C D4and CCR5or CXCR4receptors.F orty 2eight hours after in fection ,G FP positive H OS cells were determined by cell flow cytometry analysis.R esults HI V pseudoviruses containing EG FP gene were capable of in fecting C D4+CCR5+H OS cells and the in fected H OS cells could express EG FP protein.EG FP positive cells linearly correlated with the pseudoviral dosage inoculated into H OS cells.In addition ,the pseudovir 2uses only had single 2round in fectivity and were unable to replicate after entering H OS cells.Conclusion A pseud 2otyped HI V backbone vector containing EG FP gene has been success fully constructed and a platform to use a sin 2gle 2round replicative pseudovirus has been established.【K ey w ords 】 HI V ;G reen fluorescent protein ;Pseudovirus ;Neutralization antibody作者单位:430071武汉,中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室(仇超,邵⼀鸣);中国疾病预防控制中⼼性病与艾滋病预防控制中⼼病毒与免疫研究室,传染病预防控制国家重点实验室(仇超,彭虹,黄相刚,任莉,潘翔,邵⼀鸣,徐建青);中国科学院研究⽣院(仇超)通讯作者:徐建青,Email :jianqingxu @/doc/ff9a6338783e0912a3162a15.html ,电话:010263184103携带报告基因的⼈免疫缺陷病毒(human immu 2nodeficiency virus ,HI V )载体,已经被⼴泛运⽤于与HI V 相关的研究领域,⽐如中和抗体检测〔1〕,潜伏期病毒感染体外模型的建⽴〔2〕,抗病毒药物的筛选和评价〔3〕,研究病毒调节基因功能〔4〕等等。
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假病毒包装和检测方法，假病毒感染CEM细胞
来源: 日期：2011-4-11(共有0 条评论) 我要评论
我们现在以一个具体的实例来说明假病毒的包装和检测方法。
(一)材料
1．质粒
pNL-Luc-R-Env-或pNL-Luc-R+Env-：质粒包含HIV-1前病毒克隆pNL4.3的大部分基因组，荧光素酶基因Luc代替了HIV的nef基因，HIV的env基因发生了移码突变，R-为vpr基因发生了移码突变，使宿主细胞生长不能到达G2期。
pSV7d-Env：质粒把HIV-1的外壳蛋白基因(如HXB2、JR．FL、ADA、BAL的env基因)插入质粒载体pSV7d。
两个质粒为Amp抗性，都可以转化大肠杆菌细胞进行扩增。
2．细胞系和培养基
HOS细胞或U87细胞的培养基为DMEM／10％FBS／1％青霉素／链霉素。
悬浮细胞的培养基为RPMI／10％FBS／1％青霉素／链霉素。
一般情况下，需要加入puromycin(1ug／m1)来维持共受体分子的长期表达。
3．Ca3(P04)2转染试剂
2×HBS：1．0g HEPES、1．6g NaCl、0．074g KCl、0．025g Na2 HP04。
加去离子水至100ml，调pH至7．05～7．15，灭菌后4~C保存；2．0mol／L CaC12：29．40g CaCl2.H2O，加去离子水至100ml，灭菌；去离子水，灭菌。
4．感染试剂和荧光素酶检测试剂
Polybrene(Sigma)8mg／ml溶于PBS，-20℃保存；荧光素酶检测试剂盒(Pro-mega)。
(二)方法
1．假病毒粒子的包装
1)转染前一天，传293或293T细胞至10cm培养皿，细胞数为2×10^6个／10ml DMEM ／10％FBS
2)用10ug的pNL-Luc-R+Env-和10ug的pSV7d-Env两个质粒共转染293细胞。
转染前纯化质粒，用乙醇沉淀质粒再用450ul去离子水重悬这两个质粒，加入70ul的2．0mol ／L CaCl2，再逐滴加入500u1的2×HBS，冰上静置30min，逐滴加人293细胞中；
3)转染24h后换培养基；
4)转染48h后收上清，用0．45umol／L的滤膜过滤细胞沉淀；
5)分装成lml小管，一80℃保存，取少量检测p24蛋白含量或逆转录酶含量。
2．假病毒感染HOS细胞或U87细胞
1)感染前一天，传HOS．CD4细胞或U87．CD4细胞(表达共受体分子)至24孔板，
5×10^3个／孔／1ml DMEM／10％FBS(不加嘌呤霉素)。
2)把培养基换成含假病毒(10ng p24)的0．5ml的DMEM／10％FBS，可加入终浓度为8ug／ml的Polybrene来增强病毒感染力，也可不加。
同时，加入不同浓度梯度的药物。
3)5~18h后更换含不同浓度梯度药物的新鲜培养基。
4)转染后3天，收集细胞：弃培养基后，用lml PBS洗涤细胞，重悬细胞后，100g离心5min细胞弃上清，用200ul的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育2min。
5)12 000g离心2min取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。
计算药物抑制假病毒复制的EC50值。
3．假病毒感染CEM细胞
1)感染前一天，传CEM细胞，培养基为RPMI-1640／10%FBS；
2)调CEM细胞数为3×10^5／ml，加细胞300u1/孔至24孔板，同时加入假病毒(10ng p24)和不同浓度梯度的药物；
3)3～5h后加入含不同浓度梯度的药物的0．5ml培养基；
4)转染后3天，收集细胞：用1．5ml的离心管收细胞后，100g离心5rain细胞弃上清，用200ul的细胞裂解液重悬和裂解细胞，室温孵育2min；
5)12 000g离心2min取上清液，在荧光仪或液闪仪上用荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶读值。
计算药物抑制假病毒复制的ECso值。
①假病毒也能感染一些原代细胞，如PBMC，但检测时间为5～10天。
②为获得较高的荧光素酶读值，高效的转染是关键。
如果包装的假病毒滴度比较低(p24抗原的浓度小于50~100ng／ml时)，假病毒感染293细胞后，荧光素酶读值会非常低。
此外，假病毒的宿主细胞293细胞的状态非常重要，因为293细胞是非常灵敏的。
如果感染假病毒前，293细胞贴壁性不好或293细胞形态不饱满，感染效率也是很低的，荧光素酶读值也会很低，可以考虑用293T细胞来代替293细胞。
③荧光素酶的底物产生的荧光是非常强的，但产生的荧光也很短暂，半衰期为5min左右，Packard公司提供的荧光素酶试剂盒产生的荧光半衰期要长一些，为lh左右，如果检测时间需要比较长的话，可用Packard公司产品。
④假病毒从一80℃融化后，应立即使用；即便马上再次冻融，活性也只有原来的一半左右。
⑤一般来说，包含AMLV或VSV病毒衣壳蛋白的假病毒的感染力要比包含HIV衣壳蛋白的假病毒活性高1～2倍，用AMLV病毒衣壳蛋白的假病毒感染细胞时，假病毒的推荐用量是5ng左右。
⑥在用假病毒检测化合物活性时，注意化合物的自发荧光对检测效果的影响。
⑦因感染和复制过程不同，假病毒不能完全替代活病毒，经假病毒筛选后的活性物质应使用活病毒确证其活性。