植物组织培养-外植体的选择与建立
《植物组织培养技术》 知识清单
《植物组织培养技术》知识清单一、什么是植物组织培养技术植物组织培养技术是一种在无菌条件下，将植物的离体器官、组织或细胞等培养在人工配制的培养基上，使其生长、分化并发育成完整植株的技术。
这项技术的核心在于创造一个适宜的环境，让植物细胞能够像在体内一样进行分裂、生长和分化，从而实现植物的快速繁殖、品种改良以及基因工程等多种应用。
二、植物组织培养技术的基本原理植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。
这意味着每个植物细胞都包含着该植物的全部遗传信息，在一定条件下具有发育成完整植株的潜力。
细胞分化则是细胞在发育过程中逐渐形成不同形态和功能的过程。
在组织培养中，通过调节培养基的成分和培养条件，可以控制细胞的分化方向，使其按照我们的需求发育成特定的组织或器官。
三、植物组织培养技术的流程1、外植体的选择与消毒外植体是指用于培养的植物器官、组织或细胞。
常见的外植体有茎尖、叶片、花药等。
在选择外植体时，要考虑其来源的植物品种、生长状态和健康程度。
消毒是非常关键的一步，通常使用酒精、升汞等消毒剂对外植体进行处理，以去除表面的微生物，确保培养过程不受污染。
2、培养基的配制培养基是为植物细胞提供营养和生长条件的物质。
它包含大量元素、微量元素、有机成分、植物生长调节剂等。
不同的植物种类和培养目的需要不同的培养基配方。
例如，诱导愈伤组织形成的培养基和诱导芽分化的培养基成分就有所不同。
3、接种在无菌条件下，将消毒后的外植体接种到培养基上。
操作过程要迅速、准确，避免外植体受到污染。
4、培养接种后的外植体需要在适宜的温度、光照和湿度条件下进行培养。
培养过程中要定期观察，及时处理出现的污染、褐化等问题。
5、诱导分化根据培养目的，通过调整培养基成分和培养条件，诱导外植体分化形成芽、根或愈伤组织等。
6、植株再生当分化形成的芽和根发育成熟后，将其转移到生根培养基上，促进根系的生长，最终形成完整的植株。
7、炼苗与移栽再生的植株需要经过一段时间的炼苗，使其逐渐适应外界环境。
植物组织培养的一般流程
植物组织培养的一般流程一个完整的植物组织培养过程一般包括以下几个步骤：1）准备阶段（然根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制订出切实可行的培养方案。
查阅相关文献，并经高压灭菌或过后根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，滤除菌后备用。
2）外植体选择与消毒（将消毒后的外然后进行消毒处理。
选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，接种到初代培养基上。
植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药，）初代培养（3促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。
原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。
（4）继代培养当芽苗繁殖到一分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经多次切割转接。
进行脱毒苗培养的需提前定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。
进行病毒检测。
5）生根培养（提高生长素浓多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，刚形成的芽苗往往比较弱小，度，促进小苗生根，提高其健壮度。
6）炼苗移栽（选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫，防止病虫危害。
当组培苗完全成活并生长一定大小后，即可移向大田用于生产。
P P 1 、二、单项选择题1. 在衡量杂种优势（H ）时，超中优势的计算方法为（[F 1 -(P 1 +P A. H ＝2 分别表示两亲本的性状平均值，F 1 为杂种一代的性状平均值）：[F 1 -(P 1 +P 2 )/2]/(P 1 +P 2 )/2 D. H ＝2 )/2]/(P 1 -P 2 )/2 B. H ＝(F 1 -P 1 )/P 1 C. H ＝(F 1 -P 2 )/P 2层细胞发生突变，则下列器官或组织会发L II 2. 根据植物梢端组织发生层学说，如果生变异的是：中柱C. 不定根D. ．表皮A B. 种子3. 对于孢子体型自交不亲和而言，下列基因型的杂交组合能产生后代的是：S 1 S 2 B ．S 1 S 2 ×S 1 S 3 C ．S 1 S 2 ×．A S 1 S 2 ×S 2 S 3 D ．S 1 S 2 ×S 3 S44. 原始群体性状差异较大的异花授粉园林植物，实生选种时一般采用：A ．一次单株选择B ．一次混合选择C ．混合－单株选择D ．单株－混合选择5. 现有两种菊属植物，其染色体组类型分别为AABB 和CC ，则将它们进行体细胞杂交获得的谐和细胞杂种染色体组类型应该为： A. AABB B. ABC C. AABBCC D.CC6. 下列射线中，哪一种属于可以引起物质电离的电磁波？A ．X 射线B ．β射线C ．紫外线D ．激光7. 园林植物的多倍体与二倍体相比，一般会表现为：A ．气孔增多B ．花大色艳C ．适应性减弱D ．结实率增加8. 常用的化学诱变剂EMS （甲基磺酸乙酯）是一种：A ．碱基类似物B ．烷化剂C ．抗生素D ．生长调节物质9. 在下列有性杂交方式中，被称为双交的是：A ．(A ×B) ×(C ×D)B ．[(A ×B) ×B] ×BC ．A ×BD ．[(A ×B) ×C] ×D10. 对于繁殖系数较高的草花而言，有时为了加速其选种进程，下列哪个程序或圃地可以省略？A ．株系圃B ．品种比较预备试验圃C ．品种比较试验圃D ．区域试验三、填空题（每空0.5 分，共15 分）1. 园林植物品种应具备的三个基本特征是：___ 、___ 和___。
植物组织培养-外植体的选择与建立
第三节 外植体（培养物）的建立
污染（Infection） 能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术之一。对于离体培养的 探索性研究实验，污染会导致实验失败；对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产 成本大大增加。因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问题。 植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养环境四个方面。其中培 养基和无菌操作方面的污染，目前已得到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也 最难控制，其可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生性的，也可 能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的鉴定，并根据不同的微生物种类采取 相应的控制措施，这方面的研究进展较快。
（3）、污染估算及对策：
污染估算：首次接种通常污染率 40—60% 按40%计：接种100个材料 1个材料/容器：
污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 1污染：2X40%X40%=32% 2未污染：60%X60%=36% 弃掉 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62
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不具原基结构的外植体：根、茎、 叶、花、果等器官，需要脱分化。
第二节 外植体 （培养物）的 选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的 选择
第二节 外 植体（培养 物）的选择
第二节 外植体（培 养物）的选择
4、根据外植体的大小选择： 外植体大小 外植体建立 外植体大小与外植体建立
第三节 外植体（培养物）的建立
第三节 外植体（培养物）的建立
三． 褐化发生的可能因素： 与组培植物品种有关： 不同的植物种与品种之间常有很大差异，有人把此归结为基因型的
《植物组织培养技术》 讲义
《植物组织培养技术》讲义一、植物组织培养技术的概述植物组织培养技术是一种在无菌条件下，将植物的离体器官、组织或细胞培养在人工配制的培养基上，使其生长、分化并发育成完整植株的技术。
这项技术具有广泛的应用前景，如快速繁殖优良品种、脱毒苗的培育、植物新品种的选育、植物次生代谢产物的生产等。
植物组织培养的基本原理是植物细胞的全能性，即每个植物细胞都具有发育成完整植株的潜在能力。
然而，在自然条件下，由于细胞受到各种分化信号的影响，这种全能性通常无法表现出来。
通过组织培养技术，提供适宜的营养和环境条件，解除细胞的分化抑制，使其重新恢复分裂和分化的能力。
二、植物组织培养的基本设备和条件（一）实验室设计植物组织培养实验室通常包括准备室、接种室和培养室。
准备室用于器具的清洗、干燥和培养基的配制；接种室要求无菌环境，进行外植体的接种操作；培养室则为培养物提供适宜的温度、光照和湿度条件。
（二）设备和器具1、超净工作台：提供无菌操作的工作区域。
2、高压灭菌锅：对培养基、器具等进行灭菌处理。
3、培养箱：精确控制温度、光照和湿度。
4、天平：用于称量化学试剂。
5、显微镜：观察细胞和组织的形态结构。
（三）培养基的成分1、大量元素：包括氮、磷、钾、钙、镁等。
2、微量元素：如铁、锰、锌、铜等。
3、有机成分：如维生素、氨基酸、糖类等。
4、植物生长调节剂：如生长素、细胞分裂素等，对细胞的分裂、分化和生长起着重要的调节作用。
（四）无菌操作技术无菌操作是植物组织培养成功的关键。
操作人员需经过严格的培训，在操作过程中，使用酒精消毒双手和工具，在超净工作台中进行操作，避免微生物的污染。
三、植物组织培养的基本过程（一）外植体的选择和处理外植体的选择要考虑植物的种类、部位和生理状态。
一般选择生长旺盛、无病虫害的部位，如茎尖、叶片、花药等。
外植体在接种前需进行表面消毒，常用的消毒剂有酒精、次氯酸钠等。
（二）初代培养将消毒后的外植体接种到初代培养基上，诱导其脱分化形成愈伤组织或直接分化出芽和根。
组培苗生产技术—外植体的选择、处理与接种(植物组织培养课件)
3、蔬菜（龙牙百合） 龙牙百合特征:鳞茎，无皮，广卵形，外部鳞片长,将整个鳞茎 包裹，直径5~15厘米，白色，茎高90厘米左右，直立茎上叶 多而散生，披针形，叶色从浓绿，光滑。花单生茎顶。花朵 呈喇叭状长筒形，白色，有清香。
不能损伤组织材料，保持外植体的生活力，使外 植体在良好的培养条件下很快恢复生机，正常 生长和繁殖.
• 消毒剂的要求 • 要求：具有良好的消毒作用，既不会杀死植物的
组织细胞，又易被无菌水冲洗掉，不影响消毒后 外植体的生长和分化.
常用灭菌药剂的使用和效果
灭菌剂 使用浓度（%） 清除的难易 消毒时间 效 果
2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） 3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，
取材容易，操作方便，但易发生变异）； 4、花球和花蕾 5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
（二）实例分析 1、花卉（非洲菊） • 常用茎尖、嫩叶、花托进行非洲菊的组织培养，也有利用
种子进行组织培养的。 • 茎尖培养操作麻烦，但对于脱毒苗的生产是最有效的。 • 花托培养可直接成苗， 既可保持种性，又易行、 耗时短，是首选的外植体。
• 首先要选择花大、花色艳丽、市场流行的品种，然后再选 择无病虫害、植株生长健壮、花色纯正的优良品种单株进 行取材。
• 一旦选出优株后，应进行挂牌标记，并一直在其上采取花 蕾。作为外植体的花蕾要选取直径在1㎝左右，而且未露 心的小花蕾，太大或是太小的花蕾均不能获得满意的效果 。
2、水果（草莓）
（1）选择结果性优良的草莓母株上新抽出的匍匐茎作外植体，以每年6～7 月份最为适宜。
龙牙百合的许多器官、组织都可作为外植体， 如鳞片、花梗、叶片、茎尖、腋芽、花瓣、花托 、花丝、花药、胚、子房、根尖等，其中采用鳞 片作外植体的较多。
植物组织培养的完整过程
植物组织培养的完整过程1.选择适宜的母体植物：选择具有优良性状和抗病虫害能力的母体植物，从中选择健康的叶片、茎段等组织作为外植体。
2.外植体的准备：将母体植物采集的叶片或茎段进行无菌处理，去除表面杂菌和泥沙，然后用75%酒精或漂白粉消毒外表。
3.外植体的切割：将无菌环境下的外植体切割成小片，大小约为0.5-1cm，同时尽量保持外植体的干燥，以防止外植体内部水分过多。
4.外植体的接种：将切好的外植体小片接种在含有植物生长激素的无菌培养基上。
培养基通常由无机盐溶液、有机源、糖和植物生长激素等组成，植物生长激素的种类和浓度会影响到后续培养过程中的分化和增殖。
5.分化：外植体接种到培养基后，会经历分化阶段，外植体的组织逐渐增殖和分化为不同种类的细胞，形成生长点。
6.增殖：通过定期的次级培养，子培养、分生器、病毒消除等手段，将外植体中的细胞不断分化和增殖，以便大量生产幼苗。
7.再分化：经过增殖后的外植体，可以再次进行分化，形成茎尖、腋芽或花蕾等器官，以便进一步培养和繁殖。
8.根的诱导：在合适的培养条件下，外植体可以诱导生成根系，这是为了使外植体脱离体外培养环境，继续生长的必要步骤。
9.移栽：当幼苗的根系已经发达足够，可以将外植体移栽到含有适宜营养成分的固体培养基上或直接移植到土壤中，进行实地管理和生长。
10.过程控制：在整个培养过程中，要控制好环境条件，例如温度、湿度和光照等，以保证培养的成功率。
11.病毒清除：植物组织培养中经常伴随着病毒感染问题，可以通过不同的方法对外植体和培养基进行检测和清除，以保证获得健康的植株。
总的来说，植物组织培养是一个复杂的过程，需要严格的无菌操作和合适的培养条件。
它广泛应用于植物的繁殖、遗传改良、新品种选育以及病毒和细菌的清除工作中，对推动植物学研究和农业生产具有重要的意义。
植物组织培养实用技术
3、继代培养
1）分离小鳞茎培养 选择直径达到0.5cm大小的小鳞茎，用镊子将
其轻轻剥离，置于增殖培养基中。
把原来的鳞片重新转到新鲜的诱导培养基上继续诱导 小鳞茎，小鳞茎还会在其他的部位产生，整个生长周 期可以延续5~6个月。
小鳞茎继代培养30天左右可增殖1~2倍。开始是在 鳞茎基部产生小鳞茎，40天左右小鳞茎长大，形成丛鳞 茎。小鳞茎慢慢抽出新芽，然后形成小植株。此时可把 丛芽切割继续培养增殖。
消毒步骤 ①用洗涤灵水溶液洗去材料表面的油质 ②用70％的乙醇浸泡数秒以除去表面的蜡质
③用3％的次氯酸钠溶液 浸泡消毒15～30min，然 后用无菌水冲洗3次
三、外植体的原代培养
把芽放在解剖镜下，无菌条件下，用镊子、刀 片、解剖针等工具把芽外面的幼叶和叶原基除 去，使生长点暴露。用利刀切下含有1～2个叶 原基，大小为０.5mm的生长点。
4、增重培养
直径达到1cm以上即可进行生根培养，对于达不到此 标准的小鳞茎，接种到增重培养基中，在此种培养基 上，小鳞茎较少长叶而明显增重。
如果能采用液体振荡培养，则增重效果更佳。一般转 速设为110r/min。是否可以进行浅层液体静置培养， 尚需试验。
五、试管苗的生根与练苗
将丛生的试管芽切成单株，接种在1/2MS+IBA 0.5mg/L+活性炭0.5%生根培养基上，7天后芽 基部开始形成根尖。慢慢伸长成辐射状白色的小 根。20天后根长达7~10cm，基部稍膨大。温度 设置为25~28℃，光照强度为1500Lx．每天给 予10~12h光照。
40天左右发育成球状的可见鳞片的小鳞茎。
四、龙牙百合的继代培养
大田培植
鳞茎
原代培养 形回顾
原代培养 形成再生芽
植物组织培养 组培苗生产技术外植体的选择处理与接种护理课件
ห้องสมุดไป่ตู้湿度
保持培养环境湿度适宜， 以防止培养基干燥和外植 体失水。
培养过程中的观察与记录
定期观察外植体的生长状 况，包括颜色、质地、生 长速度等，并记录观察结 果。
观察外植体是否有异常表 现，如病变、死亡或生长 异常等，及时采取相应措 施。
记录外植体的生长曲线， 以便了解其生长动态和规 律。
培养过程中的问题处理
污染问题
如发现外植体受到微生物污染， 应及时采取措施，如更换培养基、
增加消毒频率等。
褐化问题
外植体褐化是常见的现象，可以通 过添加抗氧化剂、调整培养基成分 等方法减轻褐化程度。
玻璃化现象
玻璃化是指培养中的植物组织出现 半透明状的现象，可以通过降低激 素浓度、增加培养基湿度等方法进 行改善。
外植体的繁殖与移栽
生根过程
无根苗在生根培养基上生长，经过细胞分裂和分 化形成根原基，进而发育成完整的根系。
移栽前的准备
在生根培养过程中，需要对外植体进行适当的炼 苗处理，以适应外界环境，提高移栽成活率。
移栽与驯化
移栽是将培养好的组培苗从培养 容器中取出，移植到自然环境中 的过程。
移栽后的管理：保持适宜的光照、 温度、湿度和水分条件，及时除 草、防治病虫害，促进组培苗健 康生长。
外植体的接种
无菌操作技 术
操作前准备
在操作前，需要对外植体进行彻底清洗，去除表面的污垢 和微生物。同时，操作人员需要对手部进行消毒，确保无 菌操作。
灭菌处理 外植体需要进行严格的灭菌处理，以消除附着在表面上的 微生物。常用的灭菌方法包括使用酒精、次氯酸钠或氯化 汞等消毒剂。
接种环境
接种环境需要保持无菌状态，通常在超净工作台或无菌室 内进行。同时，接种工具也需要进行消毒处理，避免交叉 污染。
植物组织培养的工作流程
植物组织培养的工作流程
植物组织培养是一种常用的植物繁殖和研究方法，其工作流程包括以下几个主要步骤：
1.材料准备：选择适宜的原植物材料，如茎段、叶片、种子等作为外植体。
确保材料的新鲜性和无病原体污染。
2.表面消毒：将外植体进行表面消毒，以去除表面的微生物和杂质。
这可以通过在消毒剂（如酒精、次氯酸钠等）中浸泡、搅拌等方法进行。
3.分离和切割：根据实验需求，将外植体切割成适当大小的组织片段。
可以使用手工切割、离心分离或显微镜下的操作等方法进行。
4.培养基制备：制备适合植物生长和繁殖的培养基。
培养基通常包括基本盐、有机物、维生素、植物激素和其他添加剂。
根据实验需求可以调整培养基成分。
5.外植体接种：将分离和切割好的外植体进行培养基中的接种。
接种可以通过将外植体直接放置于培养基上或将其插入培养基中的凝胶（如琼脂）中进行。
6.培养条件控制：对培养的温度、光照、湿度和气体条件进行控制。
这些条件可以根据不同植物的生长习性和实验要求进行调整。
7.植物增殖和分化：在培养基中，外植体会通过分裂、再生和分化等过程进行植物增殖和不同类型的器官分化。
植物激素的添加和培养条件的调整可以影响生长和分化的过程。
8.增殖体移栽：将培养的增殖体转移到新的培养基或固体培养基中，以促进继续生长和发育。
9.实验分析：通过观察、记录和分析培养组织的生长情况、形态特征、遗传表达等参数，进行实验结果的分析和研究。
植物组织培养
植物组织培养重点名词解释：1、植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。
又称为植物离体培养2、外植体（explant）：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞。
3、愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织。
4、离体生态学（in vitro ecology）：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件。
5、植物细胞全能性（totipotency）：是指任何携带完整遗传信息的植物活细胞都具有表达其所有遗传信息的能力，能够发育成完整的植株。
胞需经过脱分化和再分化过程才能表现其全能性。
6、脱分化（dedifferentiation）：成熟细胞或分化细胞转变为分生状态（即形成愈伤组织）的过程。
7、再分化（redifferentiation）：成熟细胞或分化细胞脱分化转变为愈伤组织后重新分化成异质细胞的过程。
8、植物茎段培养是指对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。
9、茎尖培养（shoot tip culture or apical meristem culture）是指对植物顶端的原分生组织和它衍生的分生组织的培养。
10、叶培养的意义：研究叶形态建成、光合作用、叶绿体形成等；叶细胞全能性；原生质体融合；无性繁殖系；诱变育种。
11、离体叶组织发育途径：直接产生不定芽，由愈伤组织产生不定芽，胚状体和其他。
12、植物器官培养是指对植物某一器官的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。
13、植物胚胎培养是指对植物的胚、胚乳、胚珠和子房等进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。
包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。
14、胚乳培养是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术15、胚珠培养是将胚珠从母体分离出来，无菌条件下让其进一步生长发育，使其形成植株的技术。
植物组培关键技术—外植体选择
外植体选取原则
天气要合适，尽可能在晴朗的天气，避免在 下雨时取外植体。
外植体选取原则
工具要选择这种无锈的钢刀或钢剪，避免母本感染，工具要 锋利，避免对母本材料进行挤压式的伤害。
外植体选取原则
选好后我们就用消毒过的工具将花梗从母本 上切除取下来，切的时候要注意要从基部留 取部分以对母本进行保护，这样我们就选取 了一株优良的母本做外植体。
外植体选取原则
第五，工具要选择锋利的无锈的钢刀或钢剪， 避免取材时对母本感染。
外植体选取原则-蝴蝶兰外植体的选取
蝴蝶兰是一种高档的室内花卉，其种子细小，自然条件下播种 困难,而且种子繁殖后代会产生变异，生产过程中采用植物组织 培养为主要育苗方式
蝴蝶兰外植体的选择
选择的品种要选择目前市场上受欢迎的优良品种，这样 组培的组培苗才有市场竞争力。目前市场上比较受欢迎的 蝴蝶兰品种有：大辣椒、火凤凰等。
蝴蝶兰外植体的选择
花序以及花梗的粗壮度等几个方面评价。
蝴蝶兰外植体的选择
一、叶片，叶片要厚实，有光泽，能 很好的进行光合作用。
蝴蝶兰外植体的选择
二、基部、基部要肥大，能为蝴蝶 兰生长储存足够养分
蝴蝶兰外植体的选择
三、根系发达，能更好的吸收养 分，能使花期维持更久
蓝莓外植体选择
蓝莓选择半木质化的当年生枝条为外植 体进行诱导快繁
粗肋草外植体选择
粗肋草外植体选择
粗勒草选择带节的茎段为外植体进行诱导培养
外植体选取原则
首先选择的母本要品种优良、无病虫害的健 壮植株为外植体，母本健壮，培育的后代才 会健壮。
外植体选取原则
第二，选择的部位要合适，选择幼嫩的，生 长旺盛的部位，而避免病残弱的部位。
外植体选取
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒
植物组织培养实务--外植体的选择与消毒1、外植体的选择外植体是指植物组织培养中的各种接种材料。
从理论上讲，植物细胞都具有全能性，能够再生新植株，任何器官、任何组织、单个细胞和原生质体都可以作为外植体。
但实际上，不同品种、不同器官之间的分化能力有巨大差异，培养的难易程度不同。
为保证植物组织培养获得成功，选择合适的外植体是非常重要的。
（1）选择优良的种质及母株无论是离体培养繁殖种苗，还是进行生物技术研究，培养材料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质、特殊的基因型和生长健壮的无病虫害植株。
尤其是进行离体快繁，只有选取优良的种质和基因型，离体快繁出来的种苗才有意义，才能转化成商品；生长健壮无病虫害的植株及器官或组织代谢旺盛，再生能力强，培养后容易成功。
（2）选择适当的时期组织培养选择材料时，要注意植物的生长季节和生长发育阶段，对大多数植物而言，应在其开始生长或生长旺季采样，此时材料内源激素含量高，容易分化，不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。
若在生长末期或已进入休眠期时采样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应。
花药培养应在花粉发育到单核靠边期取材，这时比较容易形成愈伤组织。
百合在春夏季采集的鳞茎、片，在不加生长素的培养基中，可自由地生长、分化；而其他季节则不能。
叶子花的腋芽培养，如果在1月至翌年2月间采集，则腋芽萌发非常迟缓；而在3-8月间采集，萌发的数目多，萌发速度快。
（3）选取适宜的大小培养材料的大小根据植物种类、器官和目的来确定。
通常情况下，快速繁殖时叶片、花瓣等面积为5mm2，其他培养材料的大小为0.5~1.0cm。
如果是胚胎培养或脱毒培养的材料，则应更小。
材料太大，不易彻底消毒，污染率高；材料太小，多形成愈伤组织，甚至难以成活。
（4）外植体来源要丰富为了建立一个高效而稳定的植物组织离体培养体系，往往需要反复实验，并要求实验结果具有可重复性。
因此，就需要外植体材料丰富并容易获得。
（5）外植体要易于消毒在选择外植体时，应尽量选择带杂菌少的器官或组织，降低初代培养时的污染率。
植物组织培养：第4章 外植体的选择、灭菌及培养
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45μm以下，当溶液 通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直 径而被阻。
在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置； 液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤 膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射 器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出 的溶液就是无菌溶液。
由于在消毒后的环境里和物品上没有活着的微生物， 所以通过严格消毒灭菌的操作空间(接种室、超净台、 等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何 活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无 菌操作。
一 常用的灭菌方法 物理方法
化学方法
湿热灭菌(常压或高压蒸煮) 干热灭菌(烘烧和灼烧) 射线处理(紫外线、超声波、微波) 过滤除菌 大量无菌水冲洗
3. 叶片：由于叶片的来源最有保证，因而许多植物的组 织培养以叶片为起始培养物，如，玫瑰、海棠、矮牵 牛和豆瓣绿等许多植物。
4.子叶或下胚轴：对一些培养较困难的植物，则往往可 以通过其子叶或下胚轴来建立其组织培养体系。 若有可能，最好对培养较困难的植物各部位的诱导及 分化能力进行比较，从中筛选出最佳外植体。
甲醛(福尔马林)
过氧化氢 高锰酸钾 来苏儿 漂白粉 次氯酸钠 升汞(氯化汞) 酒精
（一）物理方法灭菌
1.湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）—培养基灭菌
培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌 的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢， 压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度 也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。 在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐 热的芽孢。
外植体培养实训报告
一、实训目的本次实训旨在通过实际操作，学习并掌握植物组织培养技术中的外植体选择、消毒、接种和培养等基本步骤，了解外植体培养过程中的注意事项，提高实验室无菌操作技能，为后续的植物组织培养研究打下基础。
二、实训时间2023年11月1日至2023年11月5日三、实训地点植物组织培养实验室四、实训内容1. 外植体的选择与采集- 根据培养目的和植物特性，选择生长健壮、无病虫害的植株作为外植体来源。
- 采集外植体时，注意选取具有再生能力的部位，如茎尖、叶片、茎段等。
2. 外植体的预处理- 对采集的外植体进行表面消毒，常用70%酒精和氯化汞溶液交替消毒。
- 将消毒后的外植体放入无菌水中清洗，去除残留的消毒剂。
3. 外植体的接种- 在无菌操作条件下，将处理好的外植体切割成适宜大小（如茎尖1-2mm，叶片0.5-1cm²等）。
- 将切割好的外植体接种到预先配制好的培养基上。
4. 培养基的配制与灭菌- 配制MS培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐、植物激素等。
- 将培养基分装到试管中，高压蒸汽灭菌。
5. 外植体的培养- 将接种后的试管放入培养箱中，设置适宜的温度、光照和湿度条件。
- 定期观察外植体的生长状况，记录培养过程中的变化。
五、实训结果与分析1. 外植体生长情况- 在培养过程中，部分外植体成功诱导出愈伤组织，部分外植体生长出芽苗。
- 成功诱导愈伤组织的外植体在培养基表面形成白色或黄色的愈伤组织，质地较软。
- 成功诱导芽苗的外植体在培养基表面形成绿色或紫色的芽苗，芽苗生长旺盛。
2. 影响因素分析- 外植体的选择与采集：选择生长健壮、无病虫害的植株作为外植体来源，有利于提高培养成功率。
- 外植体的预处理：消毒处理要彻底，避免残留的消毒剂影响外植体的生长。
- 培养基的配制与灭菌：培养基的营养成分要均衡，灭菌要彻底，避免杂菌污染。
- 培养条件：温度、光照和湿度等培养条件要适宜，有利于外植体的生长。
六、实训总结通过本次实训，我们掌握了植物组织培养技术中外植体的选择、消毒、接种和培养等基本步骤，了解了外植体培养过程中的注意事项。
外植体的选取原则
• 产生原因:是在某个环节消毒灭菌布彻底， 如:无菌水消毒布彻底，或操作中某种工具带菌， 违反操作规程、说话、咳嗽等都能引起杂菌感染。 • 因此，接外植体，进行无菌操作前工作人员一定 要注意自身卫生，最好戴帽子和口罩操作。
②真菌污染
• 病症：首先在有真菌孢子存在的地方产生白色的 菌丝，经常可以在外植体和培养基表面看到。特 别是夏季阴雨天，空气湿度大，周围环境不清洁， 含孢子量较多，甚至棉花塞上也落上了孢子。
外植体取材方法--确定大小
取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不项
1．采样 2．洗涤 3．表面灭菌 4．分割（外植体切割） 5．接种
1．采样
• 在采样前除应预先制备好用于接种的培养 基外，还应携带刀、剪、广口瓶、塑料袋、 采集箱（袋）等， • 到田间或盆栽植物中选取洁净、无病虫伤 害的健壮植株。剪取比较幼嫩，生长能力 较强的部位，但又不能太嫩，
组织培养中降低污染率是工厂化生产 中不可忽视的技术环节 1、防止材料带菌 2、防止用具带菌 3、操作室要处于无菌状态 4、操作人员要按照操作程序进行
对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已 基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗 的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎 段可解决培养材料不足的困难。
常用的外植体种类： ①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发 生遗传变异，但取材有限） ②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易） ③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株， 取材容易，操作方便，但易发生变异）； ④花球和花蕾 ⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。
外植体取材方法--清洗
剪切好一定大小的外植体，在灭菌前要充分浸泡、冲洗，尽量降低 均量。
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第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
（2）、污染的防止： • 母株保护：保持母株清洁，减少喷
灌。温室种植，喷施杀菌（虫）剂， 减少病原菌含量。 • 材料选择：选取生长发育健壮，病 虫危害少的材料。 • 严格清洗、消毒与无菌操作。 • 小容器、分散接种。
第三节 外植体（培养物）的建立
（3）、污染估算及对策：
时间或季节
第二节 外植体（培养物）的选择
3、根据时间和季节取材
取取材材时时间间
抑制物质
物质含量
时间或季节
生长物质
第二节 外植体（培养物）的选择
具原基结构的外植体：茎尖、 侧芽、原球茎、鳞芽、分生 组织
不具原基结构的外植体：根、 茎、叶、花、果等器官，需要 脱分化。
4、根据母株位置选择：
第二节 外植体（培养物）的选择
根据细胞全能性学说，植物体的每一个细胞 都含有全部的遗传信息，都能再生出一个 新植株。但是，要使每个细胞的全能性都 表现出来，在目前还是不易做到的事。因 而，外植体（初始培养物）的选择非常重 要。
第二节 外植体（培养物）的选择
1、基因型：
再生能力 （1）、双子叶>单子叶； （2）、被子植物>裸子植物； （3）、双子叶植物中：茄科（Solanacea）；秋海棠
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择
4、外植根体据大小外与植外植体体的建立大小选择：
外植体建立 外植体大小
第二节 外植体（培养物）的选择
第三节 外植体（培养物）的建立
4、污染（Infection）
能否有效地控制微生物污染是植物离体培养是否成功的关键技术 之一。对于离体培养的探索性研究实验，污染会导致实验失败； 对于大规模的离体繁殖生产来说，污染使生产成本大大增加。 因此，无论是科研机构还是生产厂家都十分重视微生物污染问 题。
• 所取植株的生长土壤，是组织培养中的一个重要污染源。如果采用温室栽培，事先 应进行土壤灭菌。此外，灌溉水也可能成为污染源。取材于用过滤水和用缄市饮用 水灌溉的植株，前者大大降低了微生物污染.
杜鹃花 ‘Rhodoendron’
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
年龄
生长
开花
童年期
转变年期 阶段发育
成年期
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
植株的生长与发育
第二节 外植体（培养物）的选择
2、根据母株的年龄和生长发育阶段选择：
• 污染估算：首次接种通常污染 率40—60%
按40%计：接种100个材料 1个材料/容器：
污染量=100X40%=40 获得量=100-40=60。 2个材料/容器： 2污染：1X40%X40%=16% 1污染：2X40%X40%=32% 弃掉 2未污染：60%X60%=36% 污染率=100-36=62% 污染量=100X62%=62 获得量=100-62=48
植物离体培养中的污染可分为外植体、培养基、无菌操作和培养 环境四个方面。其中培养基和无菌操作方面的污染，目前已得 到十分有效的控制。外植体方面污染最复杂，也最难控制，其 可能是细菌引起的，也可能是真菌引起的；微生物可能是附生 性的，也可能是内生性的。近年来，国外较重视各种微生物的 鉴定，并根据不同的微生物种类采取相应的控制措施，这方面 的研究进展较快。
第三节 外植体（培养物）的建立
（1）、产生污染的因素： ①外植体：通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多；
老的材料比幼嫩的带菌多；田间生长的材料比温室的带菌多； 带泥土的材料比清洁的带菌多。一年中以雨季的材料带菌多， 一天中以中午阳光最强时的材料带菌少。 ②培养基：高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况， 以及过滤灭菌中过滤膜孔径、过滤灭菌器械的灭菌处理、过滤 灭菌操作等均影响培养基的灭菌效果。 ③操作环节：接种室是否清洁、干燥、密闭，是否经常用紫外线 灯照射、甲醛熏蒸、70％酒精喷雾杀菌等，操作是否等熟练。 ④培养环境：培养室要求清洁、密闭。每天用70％酒精喷雾除菌、 降尘，每周用少量甲醛熏蒸灭菌。如有空气过滤装置效果更好。 培养室相对湿度太高时，污染加重。
外植体建立 阶段发育
外植体建立 年龄或幼化程度
母株年龄和幼化程度与外植体建立
母株阶段发育与外植体建立
第二节 外植体（培养物）的选择
杜鹃花 ‘van Weerden Poelman’
第二节 外植体（培养物）的选择
第二节 外植体（培养物）的选择3、根据时间和季节源自材抑制物质含量 生长物质含量
时间或季节
第三节 外植体（培养物）的建立
（4）、附生菌控制：
• 采用化学杀菌剂可以有效地杀死附生菌，但是一些较特殊的外植体材料，如密披绒 毛的叶片或幼果、花芽或带苞片的叶芽，附生菌可能潜伏在外植体上，无法彻底清 除。这时，必须采取一些特殊的措施，才能有效控制附生菌。
取材来源：
• 从保护条件下生长的植株上取材，可有效地控制微生物污染。保护条件指温室、培 养箱、生长室等。从温室、培养箱里取材，可有效减少附生菌的群体数量。从栽培 于温室中的植株上取材和从露地取材相比，前者污染率更低。
第三节 外植体（培养物）的建立
1、主要任务：成功的将外植
体建立在试管中。
2、主要技术环节：
（1）、外植体的选择 （2）、外植体的消毒 （3）、培养基的选择、配制 （4）、外植体消毒与接种
3、关键问题：
（1）、污染（Infection） （2）、褐变（Browning）
第二节 外植体（培养物）的选择
3 个材料/容器： 污染率=100-（60%）3=78.4%
污染量=100X78.4%=79 获得量= 100X（60%）3= 21 4 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）4=13 5 个材料/容器： 获得量= 100X（60%）5=8 • 防止污染的对策：
小容器、多数量、尽量分散、相 互隔离