1175例羊水细胞培养染色体核型分析

中华医学遗传学杂志２００９年１２月第２６卷第６期ＣｈｉｎＪＭｅｄＧｅｎｅｔ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００９，Ｖ０１．２６，Ｎｏ．６１１７５例羊水细胞培养染色体核型分析朱瑞芳杨滢张颖吴星许争峰茹彤胡娅莉羊膜腔穿刺术为当今最常用且安全可靠的产前诊断取材方法，已被广泛应用于羊水细胞培养诊断胎儿染色体病及胎儿畸形。

我院自８０年代起就开展了羊水细胞培养及染色体核型分析，对胎儿进行产前诊断，现将１１７５例羊水染色体核型结果分析和应用羊水细胞培养、进行产前诊断的相关问题报告如下。

１对象与方法１．１对象２００３年１月至２００６年７月，在我院产前诊断中心咨询门诊检查，因有各种高危因素接受羊膜腔穿刺术，进行羊水细胞培养与染色体核型分析的孕妇计１１７５例，年龄２２～４０岁，平均３１岁，孕周１７～３０周。

其中≤２４周者１０２２例，＞２４周者１５３例。

１．２方法在Ｂ超定位后，无菌条件下经腹壁行羊膜腔穿刺术，取羊水细胞２０ｍＬ，离心后去一ｋ清，细胞悬液接种于两个２５ｃｍ２Ｎｕｎｃ培养瓶中，置３７℃二氧化碳培养箱中原代培养，５～６ｄ换液，每天观察细胞生长情况，当羊水细胞贴壁生长旺盛，镜下见多个克隆和适量圆形、双圆形透明细胞时，加入秋水仙素，终浓度２ｐｇ／ｍＬ。

３０ｍｉｎ后，根据原瓶细胞生长情况，分别采用原位、胰酶消化或应用细胞刷等不同方法进行细胞收集。

再经过低渗、固定、制片、烤片后Ｇ显带，镜下核型分析。

核型计数不少于１５个分裂相，异常核型计数３０个分裂相以上，分析３～５个核型。

２结果２．１孕周对羊水细胞培养成功率的影响１１７５例孕中晚期羊水细胞原代培养，１１６４例一次培养成功。

５例经两次穿刺培养收获成功，３例孕周较大选择脐血管穿刺，３例放弃二次穿刺，总成功率９９．４９％（１１６９／１１７５）。

其中孕１７～２４周者１０２２例，１０１９例一次培养收获成功，孕２４周以上者１５３例，１４５例一次培养收获成功。

不同孕周羊水细胞培养成功率不同，孕２４周以上者羊水细胞培养成功率较低（Ｐ＜ｏ．０１）。

２．２孕周与羊水细胞生长时间的关系我们以７ｄ为标准，研究孕周与羊水细胞生长时间的关系。

孕１７～２４周者细胞生长时间＞７ｄ２４２例，≤７ｄ７７９例；孕周＞２４周者细胞生长时间＞７ｄ１２０例，≤７ｄ２８例。

细胞生长时间差异有统计学意义（Ｐｄ０．０１）。

孕２４周以上者，羊水细胞生长时间较长。

２．３染色体制备方法对核分裂相的影响在细胞生长良好的前提下，根据原瓶细胞生长密集程度，我们分别应用原位收获３３５例（核分裂相≥３０个２８９例，＜３０个４６例），细胞刷或胰Ｄ０ｌ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９４０６．２００９．０６．０ｉｆ３作者单位：２１０００８南京大学附属鼓楼医院产前诊断中心（朱瑞芳、杨滢、张颖、吴星、茹彤、胡娅莉）；南京市妇幼保健院（许争峰）通信作者：胡娅莉，Ｅｍａｉｌ：Ｙａｌｉ—ｈｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ・临床细胞遗传学・酶消化收获８２９例（核分裂相≥３０个７１９例，＜３０个１１０例），虽然全部获得成功，但收获的核分裂相数差异具有统计学意义（Ｐ＜０．０１），两种方法获得的有效核分裂相数明显不同。

２．４各种高危因素的异常核型检出率各种高危因素与异常核型检出率见表１。

双亲之一为结构性染色体畸变携带者，胎儿异常染色体发生率最高，为３３．３３％，本次妊娠有异常超声波检查结果者，胎儿染色体异常占第二位，生育过三体患儿者、高龄孕妇、母亲血清筛查阳性者及有畸胎史者，异常发生率在１．９６％～２．２０％之间。

表１羊水产前诊断指征与异常核型检出率２．５异常核型检出率１１７２例孕妇的羊水细胞检查，发现异常核型３２例，异常检出率为２．７３％（３２／１１７２）。

其中三体占５６．２５％，性染色体异常占第二位，见表２。

表２３２例羊水染色体异常核型３讨论３．１羊水染色体检查结果分析及在产前诊断中的应用本中心近年成功培养的１１７２例羊水染色体（含３例脐血）中，高龄万方数据中华医学遗传学杂志２００９年１２月第２６卷第６期ＣｈｉｎＪＭｅｄＧｅｎｅｔ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００９，Ｖ０１．２６，Ｎｏ．６孕妇２２７人，占羊水穿刺总数的１９．３７％，发现５例染色体异常，包括２１三体２例，１８三体２例，柯氏综合征１例，异常检出率为２．２０％，三体检出率为１．７６％，对于胎儿染色体畸变与孕妇年龄密切相关，孕妇年龄越高，卵子老化，更易致减数分裂时染色体不分离而发生三体综合征，故其生育染色体病患儿的风险越大，三体综合征尤为突出。

然而低于３５岁的高危孕妇，异常检出率为２．８５％，高于高龄孕妇的异常检出率，三体检出率为１．０６％。

提示除高龄因素外，对有其他产前诊断指征的低龄孕妇，也应进行羊水染色体检查。

异常超声波检查在产前诊断中具有重要意义，胎儿外观的异常，往往提示胎儿染色体有异常的可能。

９７例Ｂ超提示异常的孕妇，发现染色体异常６例，检出率为６．１８％，６例Ｂ超均提示：胎儿多发性畸型。

羊水染色体分析５例为１８三体。

１例核型为４６，ＸＸ，５ｐ＋，其父外周血染色体核型是４６，ＸＹ，ｔ（３；５）（ｐ２４；ｑ１５）的平衡易位携带者，其核型异常导致了胎儿遗传物质不平衡而出现表型异常，以上６例均已终止妊娠。

在我中心就诊的１８例染色体结构异常携带者中，胎儿染色体异常发生率为３３．３３％，分别为易位和倒位。

表明亲代之一染色体结构异常，其下一代染色体异常风险非常大。

Ｄｏｗｎ’Ｓ综合征筛查发现的两例结构异常胎儿，经检查其双亲之一也为携带者。

染色体平衡易位或倒位，可由双亲遗传，或生殖细胞新生突变所致，如由双亲遗传，由于遗传物质没有丢失，表型正常，故对其均选择了保留胎儿继续妊娠。

采用检测孕妇血中游离人绒毛膜促性腺激素和甲胎蛋白，再联合Ｂ超检测胎儿颈部半透明厚度的方法，筛查出的高危者６４０人，羊水染色体异常１３例，值得注意的是，除８例为三体外，其余５例均为其他异常，核型分别为超雌、超雄综合征及倒位、易位、三倍体等。

可见筛查不仅仅局限于三体征，对其他染色体异常也能给予提示，应引起重视。

３．２关于羊水细胞培养及收获方法与染色体制备的相关研究高质量的羊水细胞培养及收获技术是进行羊水染色体分析诊断的关键。

由于在细胞培养及收获方法上不断改进，羊水细胞培养成功率不断提高，培养周期缩短，并能够提供较多可供分析核型，避免嵌合体的遗漏，为染色体的分析诊断奠定了坚实的基础，也为患者节省了等待时间。

我们的研究表明，在排除细菌、霉菌等微生物污染和血性羊水影响的前提下，孕周与羊水细胞培养成功率密切相关。

≤２４周羊水细胞培养一次成功率明显高于＞２４周者，提示抽取羊水的最佳时期以不超过２４周为宜。

对于失败的１１例，除３例孕周较大选择脐血管穿刺，３例放弃外，其余５例（其中３例＞２４周）重新抽取羊水培养后，经增加换液次数、延长培养时间（１例最长达１７ｄ），也获得适量集落，并收获成功。

孕周过大不易培养成功的原因，可能是由于羊水细胞的活性降低，细胞生长的潜伏期增加，细胞不易贴壁和贴壁间距太大，使细胞不易伸展移动形成集落。

如果过早干涉，可能导致培养失败。

因而对于孕周过大，细胞生长缓慢超过平均生长周期时，只要有少量细胞贴壁就不能放弃，应继续观察和换液，往往有令人惊喜的收获。

这也印证了孕周大于２４周后，细胞生长时间相应延长，孕周与细胞生长时间密切相关。

因而，对于＞２４周有高危因素的孕妇，临床上应当灵活处理，分别告知羊水细胞培养和脐血穿刺的风险利弊，如果孕妇愿意承担脐血穿刺的风险和相对较高的费用，则应选择脐血穿刺，以减少等待诊断结果的时间。

另外需要关注的是细胞收获时机与收获方式的选择。

恰当的收获时机和合适的收获方法选择及制片技术的把握，是进行羊水染色体分析的另一项关键技术。

我们的研究结果表明，不同的收获方法在细胞生长良好的前提下，对核分裂相的数目有显著影响。

原位收获，由于对细胞几乎没有人为破坏，可以获得大量的核分裂相，但由于分散不良，故可供分析的有效核分裂相数，比实际获得的核分裂相数大为降低。

应用细胞刷或胰酶消化收获，细胞破坏程度虽因操作者的技术手法差异而有不同，核分裂相总量仍明显少于原位收获。

但由于此方法分散良好，故有效核分裂相比例高。

两种方法各有利弊，因而实际工作中，我们针对细胞贴壁生长的情况，选择不同的收获方法，均可获得满意效果。

此外，与细胞培养有关的培养基、培养瓶的选择，细胞刷及相关耗材的质量，都对细胞培养至关重要，不可忽视。

而严格无菌操作，无论在手术取材还是羊水细胞接种、换液等各个环节上均十分必要。

同时，应注意防止霉菌污染，除操作间进行定期消毒、干燥、换气外，培养箱也要定期擦拭、消毒。

参考文献１ＸｕＺＦ，ＨｕＹＬ，ＺｈｕＲＦ．Ａｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄｃｅｌｌｓｃｕｌｔｕｒｅｉｎｓｉｔｕｆｏｒｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＰｏｒｇＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ，２００３，１２：２７３—２７５．［许争峰，胡娅莉，朱瑞芳．改良羊水原位培养法进行产前诊断的研究．现代妇产科进展，２００３，１２：２７３—２７５．］２ＸｕＺＦ，ＨＵＹＬ，ＺｈｕＲＦ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＣｈｉｎＪＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ，２００６，４１：２７５—２７６．［许争峰，胡娅莉，朱瑞芳．高效羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用．中华妇产科杂志，２００６，４１：２７５—２７６．］（收稿日期：２００８１２１８）（本文编辑刘华）万方数据。