园艺植物组织培养第9章

胚培养方法的进一步发展是受到了Laibach(1925,1929)的推动 胚培养方法的进一步发展是受到了Laibach(1925,1929)的推动， 的推动， 这是因为，他首次证实了这种方法在实用上的重要价值。在 这是因为，他首次证实了这种方法在实用上的重要价值。 宿根亚麻和奥地利亚麻的种间杂交中，Laibach发现所结的种 宿根亚麻和奥地利亚麻的种间杂交中，Laibach发现所结的种 子严重皱缩，分量很轻，不能萌发。但是，若把胚由种子中 子严重皱缩，分量很轻，不能萌发。但是， 剥离出来，置于潮湿滤纸上或含有蔗糖的棉絮上， 剥离出来，置于潮湿滤纸上或含有蔗糖的棉絮上，则能得到 杂交植株。 杂交植株。 Laibach因此提出，在所有不能形成有生活力种子的杂交中， Laibach因此提出，在所有不能形成有生活力种子的杂交中， 因此提出 若把胚剥离出来置于人工培养基上，或许能够起死回生。自 若把胚剥离出来置于人工培养基上，或许能够起死回生。 此以后，在由于胚的夭折不能形成有生活力种子的情况下， 此以后，在由于胚的夭折不能形成有生活力种子的情况下， 胚培养即被广泛用于产生杂种。 胚培养即被广泛用于产生杂种。
Monnier(1976,1978)介绍了一种新的培养方法， Monnier(1976,1978)介绍了一种新的培养方法， 介绍了一种新的培养方法 用这种方法可以使50 μm长 球形早期） 用这种方法可以使50 μm长（球形早期）的荠菜胚在 同一个培养皿中无须变动原来的位置即完成全部发育 过程，直至萌发。 过程，直至萌发。
放在胚乳旁边
在进行未成熟胚离体培养的时候， 在进行未成熟胚离体培养的时候，如果在其 周围培养基上存在着来自同一物种另一种子的离 体胚乳，对胚的生长会有明显的促进作用。 体胚乳，对胚的生长会有明显的促进作用。
放在胚乳上
在某些属间杂交中， 在某些属间杂交中，若把杂种未成熟胚放在 事先培养的大麦胚乳上培养， 事先培养的大麦胚乳上培养，能够显著提高获得 杂种植株的频率。 杂种植株的频率。 例如：在大麦和黑麦属间杂交中， 例如：在大麦和黑麦属间杂交中，采用这种方法 30%-40%的杂种未成熟胚可以发育成苗， 30%-40%的杂种未成熟胚可以发育成苗，而用传 的杂种未成熟胚可以发育成苗 统的胚培养法则只有1%。 统的胚培养法则只有1%。 1%
1. 无机盐
用于胚培养的无机盐配方很多，互不相同， 用于胚培养的无机盐配方很多，互不相同， 对其中每种成分的作用并无精确的评价。 对其中每种成分的作用并无精确的评价。Monnier (1976)在研究各种标准的无机盐溶液（ (1976)在研究各种标准的无机盐溶液（包括 在研究各种标准的无机盐溶液 Knop,Heller,MS培养基等） Knop,Heller,MS培养基等）对荠菜胚培养的作用 培养基等 时发现，在一定的培养基上， 时发现，在一定的培养基上，未成熟胚的生长和 存活之间并不存在相关性。 存活之间并不存在相关性。
9.1 合子胚培养的方法 9.1.1 选择植物材料
对用于胚培养的植物的选择， 对用于胚培养的植物的选择，通常是有所遇 到的问题既试验的目的决定的。 到的问题既试验的目的决定的。 演示，如豆科、
十字花科植物成熟胚。 十字花科植物成熟胚。
易获得大量的遗传组成一致又处于同一发 育期的胚的植物。（开花和结实都十分规律的 育期的胚的植物。（开花和结实都十分规律的 。（ 植物） 植物）
培养即将衰亡的胚： 培养即将衰亡的胚： 从即将夭折的种子中获得植株，则必须在夭折 从即将夭折的种子中获得植株， 开始之前，将种子剥离下来进行培养。 开始之前，将种子剥离下来进行培养。
9.1.2 消毒
合子胚受珠被、子房的双重保护，只需对胚珠、 合子胚受珠被、子房的双重保护，只需对胚珠、 子房消毒即可，然后在无菌的条件下剥出合子胚直 子房消毒即可， 接置于培养基上进行培养。 接置于培养基上进行培养。
胚培养的类型： 胚培养的类型： 成熟胚培养：成熟胚培养是指由成熟种子中剥取的胚。 成熟胚培养：成熟胚培养是指由成熟种子中剥取的胚。成熟 胚培养的目的是为了克服种子本身（特别是种皮）对胚萌发 胚培养的目的是为了克服种子本身（特别是种皮） 的抑制作用。成熟胚培养比较容易，在只含有无机盐、蔗糖 的抑制作用。成熟胚培养比较容易，在只含有无机盐、 和琼脂的培养基上就能长成植株。 和琼脂的培养基上就能长成植株。
胚由异养转入自养是胚发育的一个关键时期， 胚由异养转入自养是胚发育的一个关键时期，但 这个时期出现的早晚因物种而异。 这个时期出现的早晚因物种而异。 在荠菜中，胚在球形期以前肯定是异养的， 在荠菜中，胚在球形期以前肯定是异养的，只有到 心形晚期它们才转为自养。就是在这两个时期之内，培 心形晚期它们才转为自养。就是在这两个时期之内， 养中的胚对外源营养的要求也会随着胚龄的增加而渐趋 简单。 简单。 为使胚正常生长， 为使胚正常生长，在培养过程中必须把它们由一 种培养基转入另一种培养基。 种培养基转入另一种培养基。
Monnier（1980） Monnier（1980）对由球形期开始发育的未成熟胚在活体 和离体条件下的发育状况进行了比较。由他的研究可以看 和离体条件下的发育状况进行了比较。 出，在离体条件下，胚的生长过度，但发育延迟；在双子 在离体条件下，胚的生长过度，但发育延迟； 叶植物中，一片子叶先长， 叶植物中，一片子叶先长，而不是像在活体中那样两片子 叶同时生长。另外，在离体条件下还有形成多个子叶的倾 叶同时生长。另外， 向。
注意： 注意： 在剥取更小的胚时， 在剥取更小的胚时，要避免它们在操作过 程中干掉。 程中干掉。
9.1.4 培养
胚乳看护培养 在人工培养基上幼龄胚通常很难培养。尽管 在人工培养基上幼龄胚通常很难培养。 培养基已经有了不少改进， 培养基已经有了不少改进，但胚的夭折若发生在 发育的极早期，要想拯救杂种仍有很大困难。 发育的极早期，要想拯救杂种仍有很大困难。
未成熟胚培养：未成熟胚培养指的是未成熟种子中的胚或夭 未成熟胚培养： 折之前的远缘杂种胚。进行未成熟胚培养的目的，在前一种 折之前的远缘杂种胚。进行未成熟胚培养的目的， 情况下是研究胚胎在不同发育时期的营养需求， 情况下是研究胚胎在不同发育时期的营养需求，在后一种情 况下是避免杂种胚的夭折。未成熟胚往往不易剥离，而且只 况下是避免杂种胚的夭折。未成熟胚往往不易剥离， 有在成分相当复杂的培养基上才能长成植株。 有在成分相当复杂的培养基上才能长成植株。未成熟胚培养 的成功几率主要取决于胚的发育时期。 的成功几率主要取决于胚的发育时期。
荠菜在某些方面能满足这些要求。 荠菜在某些方面能满足这些要求。
培养处于一定发育时期的胚： 培养处于一定发育时期的胚： 须对刚开放的花进行人工授粉。 须对刚开放的花进行人工授粉。在这类研究 中，最好先制成一个对照表，列出胚胎发育期和 最好先制成一个对照表， 授粉后天数的相应关系。 授粉后天数的相应关系。
在剥取较老的胚时， 在剥取较老的胚时，在胚珠上无胚的一侧切一 小口（ 小口（图10. 2C)，用一根钝头解剖针轻压珠被，即 ，用一根钝头解剖针轻压珠被， 可把完整的胚挤出到周围的液体中。整个操作过程 可把完整的胚挤出到周围的液体中。 特别是在剥取未成熟胚时）必须小心进行， （特别是在剥取未成熟胚时）必须小心进行，以免 使胚受伤。 使胚受伤。
鱼雷形胚或更幼龄的胚位置都局限在纵向剖开 的半个胚珠之中（ 的半个胚珠之中（图10. 2D)，由于它们的绿色或由 ， 于它们透明的胚柄囊，因而透过合点清晰可见。在 于它们透明的胚柄囊，因而透过合点清晰可见。 剥取这种未成熟胚的时候，将留下有胚的一半， 剥取这种未成熟胚的时候，将留下有胚的一半，仔 细地剔除胚珠组织，即可把连着胚柄的整个胚取出。 细地剔除胚珠组织，即可把连着胚柄的整个胚取出。
MS培养基中 未成熟胚的生长情况虽然最好， 培养基中， 在MS培养基中，未成熟胚的生长情况虽然最好，但存 活率却很低。 Knop培养基中 虽然它的毒性最小， 培养基中， 活率却很低。在Knop培养基中，虽然它的毒性最小，但胚 的生长情况很差。 的生长情况很差。 为此他变动了ms培养基中每一种盐分的浓度， 为此他变动了ms培养基中每一种盐分的浓度，以研究这类 ms培养基中每一种盐分的浓度 变动的效果。在这些实验的基础上，他推出了一种新的培 变动的效果。在这些实验的基础上， 养基，在这种培养基上，胚的生长与在MS MS培养基上一样理 养基，在这种培养基上，胚的生长与在MS培养基上一样理 同时存活率也很高。 MS培养基中的无机成分相比 培养基中的无机成分相比， 想，同时存活率也很高。与MS培养基中的无机成分相比， 的浓度较高， Monnier培养基中 培养基中K 在Monnier培养基中K十和Ca+的浓度较高，而NH4+的水平较 低。
取决于植物的种类，胚龄的大小和培养基的组成，未成熟 取决于植物的种类，胚龄的大小和培养基的组成， 胚在离体培养中可能有3种不同表现：（ 胚在离体培养中可能有3种不同表现：（1）继续正常的胚 ：（1 胎发育过程，最终形成具有萌发能力的成熟胚（ 胎发育过程，最终形成具有萌发能力的成熟胚（2）早熟 萌发，形成细弱的畸形苗（3）形成愈伤组织 萌发，形成细弱的畸形苗（
9.1.3 胚的剥离
把胚从周围组织中剥离出来 子房 种子 胚珠 胚
小种子或胚很小必须借助解剖镜进行
先把消过毒的蒴果（ 先把消过毒的蒴果（图10. 2A）放在几滴无菌培 ） 养基中。 养基中。 然后切开胎座区域， 然后切开胎座区域，用镊子将外壁的两半撑 开，露出胚珠（图10. 2B)。 露出胚珠（ 。 胎座上取下的1个胚珠放在载玻片的凹穴中 由胎座上取下的 个胚珠放在载玻片的凹穴中 内有1滴培养基），然后用一把锋利的有柄刀片 滴培养基）， （内有 滴培养基），然后用一把锋利的有柄刀片 将胚珠纵切成两半（ 将胚珠纵切成两半（图10. 2D)， ，
嵌入胚乳中
把杂种离体幼胚嵌人到由双亲之一或第三个物 种的正常发育的胚珠取出来的胚乳中， 种的正常发育的胚珠取出来的胚乳中，然后把二者 一起放在人工培养基上培养。 一起放在人工培养基上培养。