凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography
GPC与SEC的区别
GPC与SEC的区别凝胶过滤层析（GFC，gel filtration chromatography），体积排阻层析（SEC，size exclusion chromatography），凝胶渗透层析（GPC，gel permeation chromatography）尺寸排阻层析（SEC）按流动相的不同分为两类：以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透层析（GPC），以水溶液为流动相者称为凝胶过滤层析（GFC）。
凝胶色谱法的分离机制只取决于凝胶的孔径大小与被分离组分线团尺寸之间的关系，与流动相的性质无关。
当然需要标准物质了啊，但是GPC/SEC/GFC和HPLC的标定还是不同的：HPLC 是通过标定来确定在某一个保留时间处所出的峰是什么物质，通俗说是什么东西、是哪种物质；而GPC/SEC则不同，标样标定的是分子量、准确说是流体力学体积的大小，与具体是何种物质无关。
HPLC用标样定性，是确定其化学性质；而GPC/SEC用标样定性，是确定其分子量、体积等物理化学性质，这一性质是数字的、连续的，因此才需要用外标曲线法，将样品峰与这一曲线结合，即可得到峰值分子量。
而且，往往是标样与样品并不是同一种化学物质，此时得到的分子量就叫做相对分子量了。
GPC和SEC有什么区别啊基本一样，GPC是按使用的填料来对分离方式称谓的（填料为凝胶），SEC是按分离机理（体积排斥）来称谓的GPC是SEC中的一种，还有GFC，GFC与GPC不同的地方就是流动性的种类一般不同，GFC和GPC都可以用来做分子量测定还是稍微有些区别的。
严格来讲：当你使用有机物作为流动相的时候，被称作凝胶渗透色谱，使用的柱子被成为Organic GPC Columns当你使用水作为流动相的时候，被成为体积排阻色谱，使用的柱子被成为Aqueous SEC Columns他们只是叫法不同而已，原理也是一样的，都是体积排阻，分子大的先出来，分子小的后出来，分子大小和需要的流动相体积有一定的关系来确定其分子量的分布。
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1
凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
(整理)凝胶层析法测定蛋白质分子质量.
凝胶层析法测定蛋白质分子质量一、实验目的1.了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。
2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。
测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。
用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。
即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav 值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V）以及分离物本身的洗脱体积（Ve ）有关：Kav=（Ve-V）/（Vt-V）。
凝胶层析.
凝胶层析简介凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。
1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。
随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
层析过程如图11 所示。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
凝胶过滤层析资料
分类
以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水 溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法 称为葡聚糖凝胶过滤层析。
以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机 溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称 为葡聚糖凝胶渗透层析。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此， 要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、 0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性
葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含 10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团 (尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
的多糖链。 这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到
45℃以下时呈固态。 它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环
凝胶过滤层析
gel filtration chromatogra
phy,GFC
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离
物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻 层析（size exclusion chromatography）、分子筛 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的
4.1 凝胶过滤层析
㈡ Superdex
是由安玛西亚公司开发的一类新型凝胶过滤 介质,是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之 一。Superdex是将葡聚糖与高度交联的琼脂糖 颗粒共价结合而形成的，属于复合型凝胶 。
在该凝胶的结构中，琼脂糖基质决定了凝胶 具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝 胶的层析特性。
三、Gel过滤色谱中溶质运动的特征
㈠. 洗脱体积Ve Ve 与样品体积 VS 有关
具体影响如下图说明：
(二）. 分配系数Kd
Kd =
固定相中溶质浓度（g/l） 流动相中溶质浓度（g/l）
A类分子 Kd=0 Ve = V0 C类分子 Kd=1 Ve = Vi + V0 B类分子 0〈 Kd〈 1
• 2.脱盐
第一节 凝胶过滤色谱基本理论
一、
简单原理
凝胶颗粒具三维网状结构，可对大小不同 的分子流动产生不同的阻滞作用。
孔隙
间隙
颗粒粒径几十到几百um
间隙几到几十um
孔隙的孔径nm级
（一般大分子也在nm级）
要分离的分子分为三类：
A类：dA＞最大孔径，全排阻（出） 凝胶对它无阻滞，最早流出；
C类：dC＜最小孔径，能进入全部孔隙区 阻滞最大，流速最慢，最晚流出；
二、 实验设计要点 ㈠. 要求
⒈高分辨率 Rs = 2Y/(W1+W2)
Y
W1
W2
Rs应〉1.2 （减小W，增大Y）
⒉回收率高（减少峰宽，可提高回收率）
⒊减少稀释（避免以下几种情况） ⑴. 涡流扩散 （通道不均匀） ⑵. 动定相不平衡（速度过快） ⑶. 纵向分子扩散 （速度过慢）
⒋短时间 尽可能缩短时间，尤其是活性物质的分离
A类与B类、B类与C类、A类与C类间 ⒉分级分离
凝胶柱层析
凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
基本原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。
是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
优点它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
使用方法⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
提高凝胶过滤层析的分辨率的方法概述
提高凝胶过滤层析分辨率的方法概述摘要：凝胶过滤层析的分辨率高低关系到最后的样品纯度，提高分辨率可得到纯度更高的产物。
分辨率的高低与凝胶柱的选择、凝胶的种类、加样量、流速和洗脱液性质有关，在实验过程中，根据目的和要求综合考虑各因素。
【关键词】凝胶过滤层析；分辨率；流速Abstract：The sample purity is related to the resolution of the Gel filtration chromatography.Thus, to obtain a higher purity product, we need to improve the resolution. the selection of the gel column, the type of gel, the amount of pipetting, flow rate can effect the resolution. Consideration of various factors, during the experiment, according to the purpose and requirements.【Key words】Gel filtration chromatography; resolution; flow rate引言凝胶过滤层析法(gel filtration chromatography)也称分子筛层析法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的分子量进行分离和纯化1959年，Porath和Flodin第一次用凝胶过滤分离水溶液中不同分子量的样品。
凝胶凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
因此，凝胶层析广泛的应用于生物化学、高分子化学等方面。
凝胶过滤和亲和层析
（二）、凝胶级别的选择 1.细的（20-80μm）： 2.超细的（10-40μm）：以上二者区带窄， 分辨率高。 3.中等的（50-150μm）： 4.粗的（100-300μm）：以上二者流速快， 适用于制备，组分离。
（三）、层析柱的选择
1.柱长：两个区带的分辨率与柱长的平方根成正比。 2.柱内径：大小由载样量决定。 3.加样装置：样品进入凝胶前避免稀释。 4.死体积：样品经柱分离后避免再混合。 5.层析床支持物：避免阻塞。
亲和层析(affinity chromatography)
一、介绍
（一）、概念：亲和层析是利用配种相互作用包括：
酶----底物、产物、抑制物、辅酶和变构调节剂
激素----结合蛋白、细胞受体 基因----核酸、阻遏蛋白
抗体----互补抗原
2）、有实际应用价值的基质
(1)纤维素 (2)交联葡聚糖 (3)琼脂糖 (4)交联琼脂糖
2、间隔臂 配位体直接和基质骨架偶联，它与互补蛋白质的相互 作用将受到空间阻碍的影响。配位体必须远离网络骨架。 一般是将配位体与基质骨架间加入一段长链，称为间隔臂。
1）、间隔臂的长度 一般认为，为了互补大分子获得最佳相互作用，配位 体与骨架间必须插入至少4到6个亚甲基的臂。然而，当互 补大分子的分子量低或与配位体亲和性高，则间隔臂长度 不像大蛋白质分子或低亲和系统中那样严格。 目前还有采用长链间隔分子的,如聚赖氨酰丙氨酸， 分子量约260,000，纯化作用较短链强。 2）、间隔臂的性质 惰性间隔分子：原认为脂肪族碳氢化合物是惰性的， 但是实验证明存在空间干扰和非特异吸附。 亲水性间隔分子：在长轴方向引入极性基团，如二级 胺、羟基、肽能极大降低非特异性吸附作用，但亲和层析 结果不好。 疏水性间隔分子： 甘氨酸倍半肽（亲水）对肝葡糖激酶吸附差 6-氨基乙酸（疏水）对肝葡糖激酶吸附好
凝胶层析法测定蛋白质分子质量
凝胶层析法测定蛋白质分子质量一、实验目的1.了解凝胶层析（Gel Chromatography）的原理及其应用。
2.通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶排阻层析（Gel Exclusion Chromatography），凝胶过滤（Gel Filtration），渗透层析（Gel Permeation Chromatography）或分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
凝胶层析技术被广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等各种生物化学实验过程之中。
测定蛋白质分子质量也是它的重要应用之一。
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。
用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。
即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav 值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V）以及分离物本身的洗脱体积（Ve ）有关：Kav=（Ve-V）/（Vt-V）。
凝胶过滤层析技术原理讲解
凝胶过滤层析技术原理讲解凝胶过滤层析技术原理讲解(附动画)原创作者;gfzhang凝胶过滤层析(Gel Filtration Chromatography，GFC)又称尺寸排阻层析(Size Exclusion Chromatography，SEC)凝胶渗透层析(Gel Permeation Chromatography，GPC)分子筛层析(Molecular Sieve Chromatography，MSC)注:在高效液相色谱分析中，用GFC或SEC表示凝胶过滤色谱或尺寸排阻色谱，流动相通常是水溶液;在有机高分子分析中，常用GPC表示凝胶渗透色谱，流动相通常是有机溶剂;在蛋白质分离纯化中用GFC或SEC表示凝胶过滤层析或尺寸排阻层析;本文以下内容均针对蛋白质分离，因此均以凝胶过滤层析(GFC)表示。
(1)分离机理GFC填料是由高分子交联而成、内部具有网状筛孔的固体颗粒，利用球状凝胶内的筛孔的大小，不同水力学半径的分子在通过填料时运行路径存在差异，利用该差异将不同大小的蛋白质进行分离。
蛋白质分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，因此总体运行路径较短，从层析柱入口到出口所需时间较短;较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，总体运行路径较长，故在管柱内的停留时间较长;基于此原理可以区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而确定未知样品的分子量。
注1:球形蛋白与线性分子在凝胶过滤层析中的保留行为存在差异，因此使用球形蛋白制作的分子量标准曲线不能用于明胶多肽、淀粉或其它聚合物。
(2)应用范围A蛋白质分离，基于混合中不同蛋白质分子尺寸大小进行分离;B分子量测定，蛋白质分子量(球形)的对数与其在凝胶过滤层析时的保留时间呈线性关系; C样品脱盐或溶剂置换。
(3)填料要求一般状况下，用于制备凝胶过滤层析的填料应不吸附目标成份，所有欲分离物质均被洗脱出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶层析
超胶（ultro-gel ACA)
琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶 比Sepharose 化学稳定性好，强度高，pH3-10， 热稳定性不变 ACA 34：丙烯酰胺3%，琼脂糖4% 分离范围：生物胶P＜超胶＜琼脂糖
规格编号
间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限 G-50 分离限1500-30000 G-150：5000-400000 对蛋白、多糖分离范围不同 （多糖分子体积比相同M的蛋白大） 粒度：直径100-300um粗粒 20-80um细粒 40-120um中粒
保存
湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%NaN3，0-5℃ 干法：乙醇分步处理（20%，40%，60%，80%） 脱水收缩，抽滤，60-80 ℃吹干，室温 半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，4 ℃
⑤床体积（bed volume） 即1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。 Sephadex G50的床体积为9～11 cm3/g干胶。 ⑥空隙体积（void volume） 即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻 极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量 为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。
已知分子量的标准品
凝胶柱
分子量的对数
测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 • 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。
•
主要参数测算
Vo通常占柱床30% Vo、Vi 1. 重量法 Vt=Vo+Vi+Vg=πd2h/4 Vi=gWr g-干胶重量 Wr-吸液量/ g干胶 Vo=Vt-(Vi+Vg) Vg估算为1㎝3/g干胶 2. 过柱法 Ve=Vo+KdVi 2×106蓝色葡聚糖Kd=0 重铬酸钾 Kd=1
第五章-凝胶过滤层析PPT优秀课件
每一种特定的凝胶介质都有特定的分子量分级范围，分级范 围是凝胶介质的重要参数。 根据其分级范围，可以将溶质分子分为三类： 1.分子量大于分级范围上限的分子被称为全排阻分子，它们 完全被排阻在凝胶颗粒网孔外，从颗粒间隙中通过，所受阻 力最小，流程也最短，首先从层析柱中被洗脱下来；
凝胶过滤分离蛋白质 的过程
（1）蛋白质混合物上柱； （2）开始洗脱，小分子进入凝胶颗粒内，大分子被排阻在
颗粒外； （3）小分子被滞留而移动慢，大分子移动快，大小不同的
分子开始分开； （4）大小不同的分子完全分开； （5）大分子已被洗脱，而小分子仍在层析柱内。
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
一、凝胶过滤的概念
不同的溶质因不同程度进入介质而在液相中停留的时间不同, 凝胶的孔径和溶质分子大小的关系决定了层析时该溶质在层 析柱中的保留时间，不同的物质因保留时间不同而分离.
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
凝胶色谱分离原理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的
颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、
沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液
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第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
2.分子量低于分级范围下限的分子被称为全渗透分子，它们 完全进入凝胶颗粒网孔内部，洗脱时所受阻力最大，流程也 最长，最后从层析柱中被洗脱； 3.分子量在分级范围内的分子被称为部分渗透分子，它们依 据分子大小不同程度的进入凝胶颗粒内部的，是该凝胶介质 的有效分离对象。 如果两种物质分子量均大于凝胶介质分级范围的上限，或者 均小于分级范围下限，它们就无法通过层析而分离。
凝胶层析法
型号 G10 G15 G25 G50 G75 G100 ＜700
分离范围 （分子量）
吸水量 （ml/g） 1.0±0.1 1.5±0.2 2.5±0.2 8.0±0.3 7.5±0.5 10.0±1.0
床体积/干凝胶 （ml/mg） 2~3 2.5~3.5 4~6 9~11 12~15 15~20
三．凝胶层析分离的过程
5 ． Ve (elution volume) 洗 脱 容 积 ： Ve=Vo+KdVi 。 自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰） 出现时所流出的容积。 6．Kd：样品组分在两相间的分配系数。 7．Kd: 通过实验可求得。 Ve=V0+Kd•Vi Kd=(Ve-Vo)/Vi
二．样品 积 为 柱 床 体 积 的 1~4%； 制备分离时，样品体积为柱床体积的 25~30%。 2. 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2） 当样品体积≥Vsep时，两个相邻组分不能 完全分离。
三．操作压的影响
1．洗脱时维持流速的恒定。 2．用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。
分子量的测定和计算
一般都采用标准曲线法。只要测得几种标 准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的 相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一 直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中 确定它的相对分子质量。
凝胶层析法
第一节：引言
一．凝胶层析(Gel chromatography)
凝胶层析也称： 排阻层析(ellusion chromatography)、 凝胶过滤(gel filtration)、 分子筛层析(moleculer chromatography)。
凝胶层析中常用凝胶的类型 （4种主要类型）
二．凝胶的类型
第四节：凝胶层析的实验技术
凝胶分离法
观察凝胶与水分层, 此间不能使胶面干掉。
注：如床表面不平整，可在凝胶表面用玻璃棒轻轻 搅动，再让凝胶自然沉降，使床面平整。
③调节流速：调节凝胶床所能承受的最大水压，
使出口流速7-8d/min。
3、加 样、洗脱、收集
①.放水： 将出口打开，使床面上的蒸馏水缓慢下流， 达到床面将近露出为止，关紧出口。 （注意：不可使床面干掉，以免气泡进入凝胶）
交联葡聚糖凝胶（Sephadex）
• 葡聚糖和3-氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。
• 按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。
• Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200
• 数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。 Sephadex
G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。
②加样：用吸管吸取0.5ml脲酶粗提取液，缓慢地沿着 层析柱内壁加于床表面 注意：尽量不使床面扰动
③洗脱、收集：接上贮液瓶，进行洗脱，流出的液体分别 收集在小离心管中， 流速：7- 8d/分钟， 收集量：为3ml/管 (先用一支刻度离心管, 后可根据高度用普通管) 数量：共收集约8-9管（澄清后在收集1-2管） 注意：必须保持床面平整，而且不能干，随时加蒸馏水。
实验2
脲酶的凝胶过滤 分离纯化
实验 原理
脲酶分子量较大，脲酶粗制品通过交 联葡聚糖Senhadex G－150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内， 而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可 扩散进入凝胶颗粒。
用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶 首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离 的目的。
0.1ml 2.9ml 2滴
充分混匀
Nessler试剂 0.75ml 0.75ml 0.75ml
凝胶过滤层析gelfiltrationchromatography
凝胶过滤层析gel filtration chromatogra phy定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛chromatography）、分子筛层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography）Chromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
进行脱盐、去热源和脱色。
原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
小分子进入当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子葡聚糖珠内质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进相对分子质量较小的物质可自由地进大分子不出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移能进入珠内，经珠动速率慢而最后流出层析柱。
之间缝隙中等大小的分子在大分子物质与小分中等大小的分子在大分子物质与小分流出子物质之间被洗脱。
这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
带网孔的葡聚糖珠固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构小分子样品流动相大分子分子筛效应：分子筛效应：按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
凝胶层析.
凝胶层析简介凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。
1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。
随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
层析过程如图11 所示。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
凝胶层析——精选推荐
凝胶层析简介凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。
它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。
1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。
1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。
随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
凝胶层析的基本原理凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。
层析过程如图11 所示。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
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凝胶过滤层析gel filtration chromatogra phy定义凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。
利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用, 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻物质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层析（size 层析（size exclusion chromatography）、分子筛chromatography）、分子筛层析（Molecular 层析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗Chromatography）、凝胶渗透层析（Gel 透层析（Gel Permeation Chromatography）Chromatography）应用凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。
进行脱盐、去热源和脱色。
原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
小分子进入当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子葡聚糖珠内质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进相对分子质量较小的物质可自由地进大分子不出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移能进入珠内，经珠动速率慢而最后流出层析柱。
之间缝隙中等大小的分子在大分子物质与小分中等大小的分子在大分子物质与小分流出子物质之间被洗脱。
这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
带网孔的葡聚糖珠固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构小分子样品流动相大分子分子筛效应：分子筛效应：按分子大小不同, 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞作用有差异有差异, 阻滞作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。
胶柱中的迁移速度不同得到分离。
小分子被延滯固定相较快流出基本概念外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积间液体流动相的体积。
间液体流动相的体积。
内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。
基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。
(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。
柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。
(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积洗脱体积(Ve) 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）分配系数（Kd）每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数Ve=Vo+Kd Ve=Vo+KdVi KdViVo，(1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外全部分布于流动相里最先流出Vi，(2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻完全向凝胶颗粒内部扩散在两相分配的比值为1, 1,最后流出在两相分配的比值为1,最后流出<1，(3) 0 <Kd <1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散特点：特点：与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关Kd=0大分子量小分子量0＜0＜Kd<1 Kd=1洗脱体积典型的凝胶类型交联葡聚糖凝胶：Sephadex? 交联葡聚糖凝胶：Sephadex? 聚丙烯酰胺凝胶：Sephacryl ? 聚丙烯酰胺凝胶：琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel? 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel? 其它：有机凝胶Sepharon Sepharon，其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚Toyopeal，纤维素凝胶，Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。
最常用的凝胶化产品制备中最常用的凝胶。
基本骨架：葡聚糖（dextran）; 基本骨架：葡聚糖（dextran）交联剂：,2交联剂：3-氯-1 ,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。
交联度越大，应条件来控制。
交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。
网孔越小，吸水膨胀就越小。
交联度越小，网孔越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大交联葡聚糖凝胶的化学结构Sephadex G系列凝胶的分级范围G10 <700 D G15 <1,500 G25 1,000 ~5,000 G-50 1,500~30,000 G-75 3,000~70,000 G100 4,000 ~150,000 G150 5,000 ~400,000 G200 5,000 ~800,000葡聚糖凝胶1．理化性质．葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒。
它带有大量的羟基，亲水性好，因此在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。
由于各种型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，致使如下理化性质理化性质在理化性质水中的有明显的差异：膨胀度(床体积) 膨胀度吸水量(每克干凝胶在水中充分膨胀时所需的水量) 吸水量筛孔的大小分级范围葡聚糖凝胶的型号不同，其性质亦不一样分类以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质水溶性物质水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析葡聚糖凝胶过滤层析。
葡聚糖凝胶过滤层析以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机有机溶剂为流动相，对脂溶性物质脂溶性物质溶剂脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析葡聚糖凝胶渗透层析。
葡聚糖凝胶渗透层析2．稳定性．葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中是稳定的、不溶解的，而且很少产生化学降解。
在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可置高温(120℃)消毒0.5h，其性质并不改变。
在0.1mol／L HCl溶液中浸泡1~2h，甚至在0.02mol／L HCI溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。
当暴露于强酸或氧化剂溶液时，则容易使糖苷键水解断裂，因此，要避免与其接触。
葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不然微生物将生长。
3．吸附性．葡聚糖凝胶系弱酸性物质，葡聚糖凝胶系弱酸性物质，这是由于其每克干胶中含10-20μg当量的羧基基团所致。
10-20μg当量的羧基基团所致。
羧基基团能与分离物中电荷基团尤其是碱性蛋白质) 羧基基团能与分离物中电荷基团(尤其是碱性蛋白质) 发生吸附作用。
发生吸附作用。
这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克这种吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度得以克服。
当离子强度大于0 05时一般对弱碱性蛋白质就无当离子强度大于0.05时，一般对弱碱性蛋白质就无吸附力了吸附力了。
因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。
因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液。
琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)琼脂糖是从琼脂中分离出来的。
琼脂糖是从琼脂中分离出来的。
在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除在制备过程要将其中含硫酸根和羧基基团的琼脂胶除去，得到不带电荷基团的琼脂糖。
得到不带电荷基团的琼脂糖。
琼脂糖是由D 半乳糖和琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成脱水的L 半乳糖连接构成的多糖链。
多糖链。
这种多糖链在100℃左右时呈液态，这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时呈固态。
45℃以下时呈固态。
它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。
该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，pH4 抗力，在pH4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。
的缓冲液中是稳定的。
琼脂糖凝胶室温保存，琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶。
胺和葡聚糖凝胶。
琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动。
含防腐剂的水溶液中同时还要避免剧烈的搅动。
琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2 ％) 、B(2 4B(4％)和6B(6％)。
B(4 B(6 Sepharose 6B 的机械强度大于2B ，但是筛孔小于的机械强度大于2 2B。
琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好。
用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些流速可以快些。
流速可以快些大孔凝胶，Sephadex的上限大孔凝胶，工作范围的下限几乎是Sephadex的上限可分离MW40万以上MW40万以上的物质可分离MW40万以上的物质可用来分离核酸及病毒三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel。
它是以甲撑双丙烯酰胺甲撑双丙烯酰胺(双体)作交联剂交联剂，以过甲撑双丙烯酰胺交联剂硫酸铵作催化剂，硫酸铵在N,N,N’,N’,- 四甲基乙二胺(TEMED TEMED)加速剂TEMED 的作用下，丙烯酰胺(单体)聚合而成的。
将丙烯酰胺丙烯酰胺当改变单体浓度时，就可得到吸水率不同的产物。
凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择2、凝胶的预处理3、装柱4、样品的准备5、上样6、洗脱和收集7、凝胶的再生及保存凝胶过滤层析实验技术1、凝胶的选择选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。
选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。
选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、分离范围（）、理化稳定性凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、非特异吸附性质等非特异吸附性质等。
对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。