巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法的建立
实时荧光定量PCR技术的操作实践
实时荧光定量PCR技术的操作实践实时荧光定量PCR技术是一种在生物医学领域应用广泛的分子生物学技术，主要用于基因表达水平的研究、疾病诊断和生物制品定量等。
本文将介绍实时荧光定量PCR技术的实验原理、操作实践、结果分析和总结。
实时荧光定量PCR技术的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累与PCR产物形成正比的关系，从而实现对目标基因的定量分析。
实验过程中，荧光信号被实时检测并记录，通过荧光阈值设定，将荧光信号转换为数量，最终实现对目标基因的定量分析。
准备实验材料和设备：包括RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR仪、PCR引物、荧光染料等。
提取RNA：将组织或细胞中的总RNA提取出来，根据需要逆转录成cDNA。
实时荧光定量PCR：将cDNA、荧光染料和特异性引物混合，在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。
数据收集和分析：收集荧光信号数据，根据标准曲线计算目标基因的相对表达量。
RNA提取时需选择合适的试剂，根据组织或细胞类型进行优化。
实时荧光定量PCR反应条件需根据目标基因和仪器型号进行调整，以确保最佳扩增效果。
荧光染料的加入要适量，以避免对PCR产物产生影响。
标准曲线的制作要采用已知浓度的样品，以便计算未知样品的相对表达量。
实验数据分析和解读是实时荧光定量PCR技术的关键环节之一。
通过对荧光信号数据的收集和分析，可以获得目标基因的表达量。
在标准曲线上，可以根据已知样品的浓度计算未知样品的相对表达量。
通过比较不同样品中目标基因的表达量，可以研究基因表达水平的差异。
还可以利用相对定量和绝对定量两种方法对目标基因进行定量分析。
在本次实时荧光定量PCR实验中，我们成功地检测了目标基因的表达量，并对其进行了相对定量和绝对定量的分析。
通过比较已知样品和未知样品的数据，我们发现目标基因的表达量在未知样品中明显高于已知样品。
这一结果表明，目标基因在未知样品中的表达水平较高，可能与某种特定条件或因素相关。
实时荧光定量PCR详细操作步骤
实时荧光定量PCR
组织RNA提取：
一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。
所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ng。
反转录反应
反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。
反转录反应条件如下。
37°C 15 min（反转录反应）
85°C 5 sec（反转录酶的失活反应）
Real Time PCR反应
选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。
1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。
全班40人，分为5组，每组做8管。
4管做BDNF，4管做18S rRNA。
4管BDNF 或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。
每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 μl。
2）三步法PCR
首先95°C 作用3 min。
PCR进行35个循环。
步骤温度时间
变性95°C 30 秒
退火58°C 30 秒
延伸72°C 30 秒
融解曲线
温度时间变温速度
95°C 0秒20°C/秒
55°C 15秒20°C/秒
95°C 0秒0.1°C/秒。
聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法 并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析
聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析1. 引言1.1 背景聚合酶链反应（PCR）技术是一种在分子生物学中广泛应用的技术，可以在短时间内扩增DNA片段。
巴尔通体是一种由巴尔通体菌引起的疾病，病原体主要通过猫抓、猫咬或接触猫的皮肤创伤而传播。
猫抓病是一种常见的感染性疾病，主要表现为局部淋巴结的炎症反应。
猫抓病合并双侧支气管肺炎是一种较为罕见但严重的并发症，容易导致呼吸系统的功能障碍。
巴尔通体的检测鉴定在诊断猫抓病及其并发症的过程中具有重要意义。
传统的检测方法主要依靠临床表现和实验室检测，但存在着诊断准确性低、耗时长等缺点。
建立一种快速、准确且可靠的巴尔通体检测鉴定方法尤为重要。
本研究旨在利用PCR技术建立一种高效的巴尔通体检测方法，探索其在临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者中的应用，为疾病的诊断和治疗提供更为准确的依据。
通过本研究，期望能够提高巴尔通体感染的早期诊断率，减少疾病的传播风险，并为临床治疗提供更好的指导。
本文将重点探讨巴尔通体的检测鉴定方法及其在临床应用中的意义，为该领域的研究和实践提供参考和启示。
1.2 研究目的研究目的：本研究旨在建立一种快速、准确的聚合酶链反应（PCR）技术，用于检测和鉴定巴尔通体，以提高对猫抓病合并双侧支气管肺炎的诊断准确性和效率。
通过该方法的建立和应用，我们希望可以为临床医生提供一种有效的诊断工具，帮助他们更早地发现和治疗这类临床疑似病例，提高患者的治疗效果和生存率。
我们也希望通过本研究的开展，为进一步深入探讨猫抓病合并肺部感染的发病机制提供更为可靠的实验依据，促进相关领域的研究进展，为临床实践提供更多有益信息和指导。
2. 正文2.1 建立巴尔通体的检测鉴定方法差不多了，继续加油！建立巴尔通体的检测鉴定方法是本研究的核心内容之一。
我们通过文献调研和实验验证，确定了聚合酶链反应技术作为检测巴尔通体的最佳方法。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量pcr步骤
实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。
通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
原理：所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
检测方法1.SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。
SYBR定量PCR扩增荧光曲线图PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）2.TaqMan探针法：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。
服务流程1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；6.正式定量实验：对所有样品上机检测；7.实验结果和数据分析，形成报告。
收费标准优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量）（含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复）技术原理将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤1.提取样本RNA/DNA：首先，从研究对象中提取出所需的RNA或DNA样本。
可以使用商业化的提取试剂盒来完成这一步骤。
2. 反转录酶链反应（RT）：如果提取的样本为RNA，则需要先进行反转录酶链反应，将RNA转录成cDNA（即DNA拷贝），反转录酶具有多样性（M-MLV逆转录酶）和过程性（RTase）。
3.准备PCR反应体系：根据实验所需的扩增模板和引物，将PCR反应体系按照厂家提供的信息制备，通常需要包括PCR反应缓冲液、dNTPs、引物、酶、模板DNA/cDNA和稀释水。
4. 调整荧光探针的浓度：如果实验中使用到了荧光探针（如TaqMan探针、MGB探针等），需要根据实验要求对荧光探针的浓度进行调整。
5.放置PCR板：将所需的PCR试管或板放置在适当的位置，以便加载反应体系。
6.反应体系加载：按照实验所需的样品数量和模板浓度，依次向PCR反应管或板中加入反应体系。
注意，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。
7.封闭PCR反应管/板：闭合PCR反应管或板，以防止反应体系的挥发和样品的交叉污染。
8.准备PCR仪：根据PCR仪的要求，调整PCR仪的温度和时间参数。
9.PCR扩增：将已封闭的PCR反应管或板放置在预热的PCR仪中，开始PCR扩增。
根据实验需要，设置不同的PCR程序（如热启动PCR、两步PCR和三步PCR等）。
10. 实时监测PCR过程：在PCR反应过程中，实时监测PCR反应管或板中产生的荧光信号，并记录下每个周期（cycle）的荧光值。
11. 数据分析：根据荧光信号的变化，结合标准曲线法或相对表达量法，对PCR反应中目标序列的数量进行定量分析。
常见的分析软件包括Stratagene MxPro QPCR软件和Applied Biosystems SDS软件等。
12.结果分析和解释：根据数据分析的结果，对实验结果进行解释和讨论，并在图表中呈现。
13. 结果验证：可以使用其他方法验证RT-qPCR的结果，如Western blotting、细胞免疫化学分析等。
【CN110317888A】一种猫血巴尔通氏体SYBRGreenI荧光PCR检测方法及引物【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910267851.5(22)申请日 2019.04.03(71)申请人 云南农业大学地址 650201 云南省昆明市盘龙区黑龙潭申请人 云南省动物疫病预防控制中心(72)发明人 邹丰才 段博芳 吕艳 杨建发 曾邦权 赵焕云 (74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.C12Q 1/689(2018.01)C12Q 1/04(2006.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(54)发明名称一种猫血巴尔通氏体SYBR Green I荧光PCR 检测方法及引物(57)摘要本发明属基因检测技术领域，涉及一种猫血巴尔通氏体SYBR Green I荧光PCR检测方法及引物，包括以下步骤：提取猫血液中全基因组DNA，设计引物，引物稀释，优化反应条件，绘制溶解度曲线，绘制标准曲线，检测特异性，测定变异系数，验证及结果分析。
本发明检测方法优点在于建立了不用核酸探针即可检测的PCR技术，简单、快速、价格低廉，在一般的实验室即可实现，与传统的普通PCR方法相比较，这种方法无需对PCR产物进行凝胶电泳分析，可避免产物引起模板污染，而且可实时观察反应来判读结果，在一定程度上避免了传统PCR容易产生的假阳性结果。
权利要求书2页 说明书5页 附图2页CN 110317888 A 2019.10.11C N 110317888A1.一种猫血巴尔通氏体SYBR Green I荧光PCR检测引物，其特征在于，所述引物序列如下：F -2a：5'-GAA TAA GTG ACA GCW AAC TAT -3'；R -2b:5'-ATA TCT ACR CAT TCC ACC GCT -3'。
实时荧光定量PCR操作步骤
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH25分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。
样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
荧光定量pcr操作流程
荧光定量pcr操作流程
荧光定量PCR技术是一种常用的实时PCR技术，可以检测DNA和RNA的含量。
它被广泛应用于病毒检测和转基因研究等。
本文将介绍荧光定量PCR技术的操作流程。
首先，在实验室中准备所需要的实验材料，包括样本，PCR引物，模板DNA，dNTP，DNA聚合酶和实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。
其次，将样本进行DNase处理，解析得到模板DNA，将模板DNA 用合适的容量放入每个实验管中，以此来建立实验。
然后，将PCR反应液配制好，将与模板DNA一起放入PCR反应管中，包括PCR引物，dNTP，DNA聚合酶，实时PCR荧光探针，缓冲液，水等。
接下来，将放入PCR反应管中的反应液放入PCR设备里进行反应，PCR反应完毕分为一系列步骤，包括反应温度的上升，溶解和延迟，合成，放大等。
其中最重要的步骤是DNA聚合酶与模板DNA的结合，可加速DNA的复制。
最后，PCR反应完毕后，将反应管中的反应液进行荧光定量，将荧光的强度和弱度绘制成曲线，而反应体系中的DNA含量可以用曲线来测定，从而得出DNA的数量。
以上就是荧光定量PCR技术的操作流程。
它可以检测DNA和RNA 的含量，是实验室中常用的实时PCR技术。
它具有灵敏度高，操作简便，时间节约，可重复性好，可用于病毒检测和转基因研究等。
荧光定量pcr检测方法建立流程
荧光定量pcr检测方法建立流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
实时荧光定量PCR的方法学建立
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，QRT-PCR）的方法学建立QRT-PCR原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
检测方法包括SYBR GreenⅠ法和TaqMan探针法，在基础研究中，应用比较广泛的为SYBR GreenⅠ法，因此，以下主要针对SYBR GreenⅠ法的方法学建立。
一、RNA的提取及质量检测Trizol法提取RNA的原理：Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使ＲＮＡ释放出来的同时，保护ＲＮＡ的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
1、用液氮将组织研碎，按照50-100 mg组织加入1mL的Trizol® Reagent（若样品为细胞，则按照5-10x106个细胞加入1mL的Trizol® Reagent来裂解细胞），室温裂解5 min，使核蛋白复合物充分分离。
2、每1 mL的Trizol® Reagent加入200 μl氯仿，剧烈摇晃、混匀，室温静置5 min。
于4℃离心机12000 g离心15 min，离心后，混合物分为下层（红色酚氯仿）中层和上层（无色的水相层，约占总体积的50%），RNA存留于上层水相中。
用移液器吸出样品中的水相转移至另一EP管中，勿吸出中间相和有机相。
3、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl异丙醇，轻轻混匀，室温孵育10 min。
于4℃离心机12000 g离心10 min，RNA沉于管底，弃上清。
4、按照每1 mL的Trizol® Reagent加入500 μl 75%的乙醇洗涤RNA，于4℃离心机7500 g 离心10 min，用75%乙醇洗涤RNA两次。
5、去除管中75% 乙醇，将RNA自然晾干5 min。
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程与规范
实时荧光定量PCR（Real-TimePCR）实验流程与规范⼀、RNA的提取(详见RNA提取及反转录)不同组织样本的RNA提取适⽤不同的提取⽅法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较⾼，所以，正式实验前要选择⼀款适合⾃⼰样品的提取⽅法，在实验过程中要防⽌RNA的降解，保持RNA的完整性。
在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进⾏RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要⽤DNase I进⾏消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加⼊适量RNA酶抑制剂）。
⼆、DNase I 消化样品RNA 中的DNA⽤DNase I 消化DNA组份加量模板(RNA)10ugRNase Inhibitor 4ulDNase I buffer10ulDNase I 10ulDEPC处理H2O ⾄100ul混匀，37℃ 90min三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖0.45g放⼊三⾓瓶中，向其中加⼊4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC⽔，放微波炉⾥溶化。
2）待冷却到60摄⽒度左右时，加⼊1ml甲醛，摇匀（避免产⽣⽓泡）。
倒⼊凝胶板上凝固30min。
2．取各个RNA样品4µl，加⼊6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀，加⼊变性胶加样孔中。
3．120V电压下电泳25min。
⽤凝胶紫外分析仪观察，照相保存。
4．RNA电泳结果如下图所⽰。
可见28S和18S两条明亮条带，⽆DNA条带污染。
四．RNA反转录为cDNA反转录程序(以MBI的M-MLV为例)组份加量(20ul体系)加量(40ul体系)模板(RNA)0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整)3ug(根据条带的亮度适当调整)引物T18(50uM)(或其他引物)2.0ul 4.0ulDEPC处理H2O⾄12.5ul⾄25ul混匀，70℃ 5min，⽴即冰浴5*buffer 4.0ul8.0ul dNTP(10mM) 2.0ul 4.0ul RNase Inhibitor0.5ul 1.0ul混匀，37℃ 5minM-MLV 1.0ul 2.0ul42℃ 60min ，70℃ 10min反转录引物的选择与Real-Time PCR引物设计的要求：1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终⽌的序列⽽难以拷贝其全长序列时，可采⽤随机六聚体引物这⼀不特异的引物来拷贝全长mRNA。
实时荧光定量PCR操作步骤
v201412Da
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● 制品说明 ● 试剂盒原理 ● 制品内容 ● 试剂盒外必备主要试剂和仪器 ● 保 存 ● 使用注意 ● 操作方法 ● 实验条件的选择 ● 附 录 ● 质量标准 ● 关联产品
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● 制品说明
本制品是采用 SYBR® Green I*嵌合荧光法进行 Real Time PCR 的专用试剂。 制品中含有 Real Time PCR 反应的最适浓度 SYBR® Green I，是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，进行实验时，PCR 反应液的 配制十分方便简单。 本制品中还添加了 Tli RNaseH(耐热性 RNaseH)，以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，可以最大限度抑 制由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 本制品 Buffer 经过改良， 使反应特异性比 SYBR® Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus) （Code No.RR420A） 更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本 Buffer 和 Hot Start 法用 DNA 聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS 组合使用，可以进行重复性好、可信度高的 Real Time PCR 解析。 特长： 1. 适用于 Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2. 在 2×浓度的 Premix 中，预先混有 SYBR® Green I，PCR 反应液配制时，只需加入模板、引 物、灭菌蒸馏水便可进行 Real Time PCR 反应，操作简单方便。 3. DNA 聚合酶使用了 TaKaRa Ex Taq HS，可以进行 Hot Start 法 PCR 反应，再与 Takara Bio 公司独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度之特点。 4. 在 2×浓度的 Premix 中， 预先添加了耐热性 RNaseH(Tli RNaseH)， 可以最大限度抑制以 cDNA 作为模板进行 PCR 反应时，由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。 *：Takara Bio 使用 SYBR® Green I 作为研究试剂已得到 Molecular Probes Inc.的许可。SYBR® 为 Molecular Probes Inc.的注册商标。
聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法 并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析
聚合酶链反应技术建立巴尔通体的检测鉴定方法并用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者分析引言猫抓病是一种由于感染巴尔通体（Bartonella henselae）引起的疾病，其临床表现多样，包括局部淋巴结肿大、皮肤损伤和全身症状等。
巴尔通体也被研究证实与多种其他疾病有关，比如支气管肺炎。
建立一种巴尔通体的检测鉴定方法对于疾病的诊断和治疗非常重要。
本研究旨在利用聚合酶链反应（PCR）技术建立巴尔通体的检测鉴定方法，并将该方法应用于诊断临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者，分析其临床特征和治疗效果。
材料与方法1. 研究对象本研究选取了临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎的患者作为研究对象，共计50例。
其中男性28例，女性22例，年龄在20-60岁之间。
所有患者均经过详细的临床检查和相关实验室检测确认诊断。
2. 样本采集所有患者的外周血和痰样本将被采集进行后续的实验室检测。
外周血用于提取DNA，痰样本用于检测支气管肺炎相关的病原体。
3. DNA提取从外周血样本中提取DNA采用商业提取试剂盒进行。
提取的DNA将用于后续的PCR反应。
4. PCR反应利用特异性引物设计进行PCR反应，以检测巴尔通体的存在。
PCR反应条件为：95°C 预变性5分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸60秒。
最后72°C延伸10分钟，4°C保持。
5. 数据分析收集所有患者的临床资料及实验室检测结果，进行统计学分析。
并对PCR检测结果进行验证和比对，检验其灵敏度和特异性。
结果1. PCR检测结果在50例临床疑似猫抓病合并双侧支气管肺炎患者中，有45例患者的外周血样本中检测到巴尔通体DNA阳性。
而在对照组的外周血样本中未检测到巴尔通体DNA阳性。
2. 临床特征分析对45例巴尔通体DNA阳性的患者进行临床特征分析发现，其中40例患者存在明显的局部淋巴结肿大，38例患者伴有皮肤损伤和全身症状，如发热、乏力等。
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中国热带医学2009年第9卷第10期CHINA TROPICAL M EDICINE Vol.9No.10October2009［论著］巴尔通体是一群革兰氏染色阴性、营养要求苛刻兼性细胞内寄生的需氧杆菌[1]，是一新发现的古老病原体，迄今已发现21种及3个亚种[2~5]。
作为新发及老传染病的病原体，从20世纪80年代开始再次肆虐人类，儿童和青年人发病较多，少数病人尤其是免疫力低下的病人如人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者可表现较为严重的并发症[6]。
因巴尔通体种类多，感染引起的疾病谱比较复杂，给人类健康带来巨大的威胁，日益引起国内外学者的关注。
大多数巴尔通体只在动物间传播，引起动物性疾病或菌血症。
1999年至今，已有大量的资料表明巴尔通体普遍存在于鼠群中[7~10]。
巴尔通体感染的实验室诊断方法主要依赖于血清学分析，临床标本培养既困难又低效，平均需要21d才能获得结果。
聚合酶链式反应也常被采用，主要依赖于DNA片段（如16s rRNA、gltA基因、16S23S ITS、rpoB基因和ribC基因）等的扩增[11~15]。
近年来，荧光实时定量PCR技术作为一种新型的PCR 技术备受重视。
本文以SYBR Green为荧光染料，扩增巴尔通体种属特异基因379bp枸橼酸合酶gltA，建立巴尔通体荧光实时定量PCR检测方法，用于鼠血中巴尔通体检测。
1材料与方法1.1材料1.1.1PCR扩增仪Mastercycler ep realplex荧光定量PCR仪（Eppendorf.Germany）.1.1.2试剂RealMasterMix（SYBR Green）和血液基因组DNA 提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司，兔血脑心浸液琼脂平板（Brain Heart Inf usion Agar，BD）。
1.1.3PCR采用的是具有巴尔通体属水平特异性的引物（BhCS781.p-BhCS1137.n,由上海生物工程研究所合成）,上游引物BhCS781.p硷基序列为:5'-GGG GACCAG CTC ATG GTG G-3',下游引物BhCS1137.n硷基序列为:5'-AAT GCA AAA AGA ACA GTA AAC A-3',对枸橼酸合酶基因（gltA）的379bp片断进行扩增。
1.1.4样品鼠全血来自厦门各区207份，宁德53份，漳州49份，合计309份。
于捕鼠当日在实验室以乙醚将动物麻醉后,对其种类、性别进行鉴定、编号、记录,经2%碘伏消毒皮肤,无菌器械剖取股动脉全血0.5～1ml于1.8ml螺口冻存管中置液氮（-巴尔通体实时荧光定量PCR检测方法的建立姚美琳，罗炜，李国伟，苏丽琼，叶曦摘要：目的建立灵敏、特异的SYBR-Green荧光定量PCR检测巴尔通体的方法，以用于巴尔通体的实验室快速诊断和自然疫源地的流行病学研究。
方法利用离心柱法抽提鼠血中巴尔通体细菌基因组DNA，在荧光定量PCR 检测仪上检测基因组中枸橼酸合酶gltA的Ct含量，结合熔解曲线的Tm值进行分析，建立实时荧光定量检测法。
结果检测62份阳性菌株，Ct值小于30，Tm值在81-83℃范围内；检测309份鼠血抽提的基因组DNA样品，阳性128份，阳性率为38.19%。
结论建立了检测巴尔通体枸橼酸合酶gltA的SYBR-Green荧光定量PCR方法，较常规培养法更快捷、简便、敏感，适合大面积调查巴尔通体在鼠群中的分布情况，为流行病学的深入研究提供科学依据,并可作为检测巴尔通体的技术储备。
关键词：巴尔通体；SYBR-Green；荧光定量PCR中图分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1009-9727（2009）10-1963-03Establishment and application of real-time fluorescence quantitative PCR assay for detection of Bartonella.YAO Mei-lin，LUO Wei，LI Guo-wei，et al.（Haichang District Center for Disease Control and Prevention，Xiamen361026，Fujian，P.R.China）Abstract:Objective To develop a sensitive and specific quantitative SYBR-Green fluorescent PCR assay for rapid diagnosis of Bartonella and its natural foci.Methods Bartonella genomic DNA was extracted from rat blood by means of centrifuge column method.Real-time fluorescent quantitative assay was developed based on analysis of the Ct content of citrate synthase gltA combined with the value of Tm of melting curve by using the fluorescence quantitative PCR detection detector.Results There62positive strains were detected，Ct value was less than30and Tm values in the range of81-83℃;309genomic DNA were extracted from rat blood，128were positive with a positive rate of38.19%.Conclusion Real-time PCR are faster，more convenient，and sensitive for diagnosis of Bartonella infections，compared with traditional culture.This methods may be suitable for large-area survey of the distributioin of Bartonella in rat population，which will be usful for the epidemiological in-depth study of Bartonella.Key words:Bartonella；SYBR-Green Fluorescence quantitative PCR*作者单位：厦门市海沧区疾病预防控制中心，福建厦门361026作者简介：姚美琳（1967~），副主任技师，主要从事卫生微生物检验1963CHINA TROPICAL M EDICINE Vol.9No.10October2009中国热带医学2009年第9卷第10期196℃）中运送检，-70℃保存待检。
1.2方法1.2.1离心柱法提取全血中细菌基因组DNA取200μL鼠全血至1.5ml离心管中，添加500μl CL裂解液颠倒混匀10次后8000rpm1min,弃上清液；加入180μl20mg/ml的溶菌酶37℃处理30min以上；添加20μl蛋白酶K混匀15s；添加200μl GB 混匀至无团块物质，56℃水浴10min,期间颠倒混匀1~2次；添加200μl无水酒精颠倒10次混匀。
核酸吸附：将上述得到的溶液和沉淀物转移至吸附板柱CB3（套放在收集管中），12000rpm 30s，弃废液。
漂洗：添加500μl缓冲液GD12000rpm30s，弃废液；添加700μL漂洗液PW12000rpm30s，弃废液；添加500μl 漂洗液PW12000rpm30s，弃废液；12000rpm3min空甩去除乙醇。
核酸收集：将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，加入60μl洗脱缓冲液TB，室温放置2~5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
1.2.2加热法提取阳性菌株DNA刮取阳性菌落[10]5~10个于灭菌纯水中，置99℃孵育器加热50min，制成细菌基因组模板。
1.2.3引物配制合成引物浓度为100μM所需要加水量的计算公式为：加水量（μL）=摩尔数/102=质量/分子量×106/102=〔（OD 值×33）/（碱基数×324.5）〕×106/102需稀释为10μM使用。
1.2.4SYBR-Green荧光定量PCR扩增扩增反应总体积为20μl：RealMasterMix/SYBR solution9μl,引物上、下游各1μl，提取的细菌基因组DNA2μl，用纯水补足20μl。
在PCR扩增仪Mastercycler ep realplex上设定扩增条件为：95℃2min；95℃30s，48℃30s，70℃30s，40个循环；72℃5min;最后做熔解曲线分析。
2结果2.1gltA基因实时荧光定量PCR扩增将62份阳性菌株用加热法制成模板，上机行SYBR Green法进行PCR扩增，其扩增曲线均呈典型的指数扩增，最后到达平台，结果见图1。
图1巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增曲线2.2gltA基因PCR扩增产物熔解曲线扩增产物的熔解曲线呈单峰状，见图2所示。
从熔解曲线可以看出，其Tm值范围在81-83℃之间，特异性强，可用于培养菌株的鉴定。
图2巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增产物特异性熔解曲线2.3结果判断先看扩增曲线，其形态应为标准的扩增曲线，Ct值应小于30，Ct值与起始模板浓度成负相关关系，Ct值越小，模板含量越大。
再看熔解曲线，在81~83℃之间有尖锐的单峰，判断为阳性（见图3）；图3示非特异性扩增的熔解曲线，其中图3（A）为非特异和特异性扩增并存的熔解曲线，在78-80℃之间有一非特异扩增峰，图3（B）示单一非特异性扩增的熔解曲线，在77~78℃之间出现了宽而钝的单峰。
（A）巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增产物特异性和非特异性并存的熔解曲线图3（B）巴尔通体gltA基因实时荧光定量PCR扩增产物非特异熔解曲线结合gltA基因扩增曲线和特异熔解曲线分析，309份鼠血标本直接抽提基因组DNA，经巴尔通体实时荧光PCR检测结果见表1。
表1鼠全血中细菌基因组gltA的荧光PCR检测结果3讨论枸橼酸合成酶（gltA）基因具有巴尔通体属特异性，它编码的46kDa的多肽与其它细菌的枸橼酸合成酶单体的分子量相符。