微生物限度检查法验证方案模板
版药典微生物限度检查方法验证方案
版药典微生物限度检查方法验证方案验证微生物限度检查方法的方案一、实验目的：验证药典中的微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性。
二、实验材料：1.药典中规定的微生物限度检查方法；2.待验证的药品样品；3.适用的培养基和培养条件；4.培养基的质量控制菌种。
三、实验步骤：1.制备适用的培养基：按照药典中规定的方法和成分制备适用的培养基，并进行批次记录。
2.准备质量控制菌种：3.制备菌液悬液：从购买的质量控制菌种中，挑取一株菌种进行连续传代培养至活性最佳的生长阶段。
然后制备菌液悬液，以备后续试验使用。
4.扩大悬液应用范围：从第3步得到的菌液悬液中，取适量接种于适用培养基上，培养出代表性的细菌菌液悬液。
然后，通过菌液的光学检测、显微镜检查和菌落计数，确定菌液的细菌浓度。
5.验证方法的准确性：将待验证的药品样品加入培养基，根据药典中的方法将培养基分成不少于3组。
每组培养基中分别加入一定量的菌液悬液，并在药典规定的温度和时间下培养。
同时，设置对照组，只加入菌液悬液和培养基。
6.菌落计数：取适量的培养基样品，分别进行菌落计数，并根据培养基的数量、培养基总菌落数、对照组的菌落数等数据，计算菌落形成单位。
7.验证方法的可靠性：将待验证的药品样品按照药典中的方法进行连续验证，至少重复3次。
然后，对比不同验证结果的一致性和稳定性，评估方法的可靠性。
8.验证方法的可行性：根据实际的样品情况和验证结果，评估方法在操作上和技术上的可行性。
如，是否存在样品的特殊要求，检测方法是否能满足检测要求等。
四、数据处理与分析：根据实验结果的菌落计数和验证的次数，进行数据处理和统计分析。
评估验证结果的一致性、可靠性和可行性。
五、结论：根据实验结果和数据分析，得出关于药典中微生物限度检查方法的准确性、可靠性和可行性的结论。
如果验证结果与药典一致，说明方法可靠并可以使用。
如果验证结果与药典不一致，需要进一步分析原因和进行修正或优化。
微生物限度方法学验证方案
微生物限度方法学验证方案1.实验目的：本实验的目的是确定产品中大肠杆菌的数量，以评估其微生物污染程度，并验证产品是否符合相关规定的微生物限度标准。
2.实验材料和仪器：-试样：待测试的产品样品（如药品、食品等）-培养基：亚洲太平洋社会协调委员会（APHA）液体培养基或平板培养基-培养器具和耗材：试管、平板、无菌纱布、无菌拔火棉、无菌吸管、无菌移液器、无菌塑料培养瓶等-仪器设备：恒温箱、培养箱、显微镜等3.实验步骤：3.1样品制备：将待测试产品样品均匀涂布于无菌培养基平板上，根据需要，将不同稀释度的样品分别涂布于多个平板上。
3.2培养：将涂布好样品的平板放入恒温箱或培养箱中，在适当的温度（通常为37°C）下培养一定时间（通常为24小时）。
在培养的过程中注意保持无菌环境。
3.3平板计数：在培养完成后，检查每个平板上的菌落形成情况。
根据实验需要，可以选择不同的方法进行菌落计数。
常见的方法有手工计数和自动计数仪器。
例如，使用显微镜进行手工计数，或使用自动计数仪器进行电子计数。
3.4数据处理：根据菌落计数结果计算大肠杆菌的数量，并将结果与相关的微生物限度标准进行比较。
如果实验结果符合标准，则产品可被视为合格；如果结果不符合标准，需要采取相应的控制措施，如重新调整产品配方、改变生产工艺等。
4.实验注意事项：-所有试验操作都必须在无菌环境中进行，以避免结果被外源性微生物污染。
-使用符合相关质量标准的试剂和培养基。
-实验前应进行适当的预试验，以确定最佳的稀释度和培养条件。
-大肠杆菌计数要根据不同的产品、数量和国家的相关标准来确定。
-实验结果的准确性和可靠性需要重复试验和验证。
通过以上实验步骤和注意事项，可以进行微生物限度方法学验证，确定产品中大肠杆菌的数量，并评估其微生物污染情况。
这个验证方案可以用于药品、食品和其他产品的质量控制和安全评估。
微生物限度验证范例(中检所)
复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验1. 样品复方磷酸可待因（欧博士止咳露），批号309315 、402021，生产厂家为香港欧化药业有限公司。
2. 验证用菌种枯草杆菌CMCC（B）63501、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、黑曲霉CMCC(F)98003。
3. 方法中国药典有关微生物限度检查法方法验证试验。
4. 具体操作方法4.1菌液制备：(1) 取经37℃培养18~24h，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1ml +9ml盐水，10倍稀释至10-5~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
(2) 经25 ℃培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml+9 ml盐水10倍稀释至1 0-5~10-7，细菌数约为50~100cfu/ml，做活菌计数备用。
(3) 取经25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，然后取1 ml +9 ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为50~100c fu/ml，做活菌计数备用。
4.2 供试液制备吸取样品10 ml ，加0.1%蛋白胨水氯化钠稀释液90ml浓度均为1：10供试液，分别人工污染上述5种代表试验菌株。
4.3 培养基稀释法：采用加0.5 ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供试液，再加15~20 ml琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~48小时观察结果细菌计数，测定回收率。
结果见表：4.4 回收率测定：(1) 试验组: 分别取不同品种的1：10供试液1 ml、50~100个/ ml 试验菌株同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果。
薄膜过滤法以最后一次的冲洗液加入试验菌.(2) 活菌组测定每一菌株的试验菌数(3) 供试液对照测定供试品本底菌数(4) 稀释剂对照组5 结果菌落计数结果、常规法和培养基稀释法在复方磷酸可待因微生物限度检查法的验证结果见表1、2和表3。
微生物限度检查法验证方案模板
文件编号：SVP YF-0-01-00验证文件******微生物限度 检查法验证方案********有限责任公司目录1 适用范围 2 目的 3 概述 4 验证所需要的仪器设备及文件 5 可接受的限度范围标准 6 测试方法 7 异常情况处理 8 测试结果 9 结论 10 再验证周期 11 附表1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。
2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。
3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。
根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。
“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。
3.2 验证时间：************批平行三次试验。
4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备器具名称规格型号检定日期检定单位有效期电热恒温培养箱 HG101-3多用生化培养箱 SP-80 蒸汽灭菌器 ZDX-35B4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准存放地点项目标准规定细菌总数≤1000 个/g霉菌、酵母菌≤100 个/g大肠埃希菌不得检出5.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断在 3 次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于 70%。
若试验组的菌回收率均不低于 70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于 70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
微生物限度方法学验证方案
微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P-批准签字页目录1.目的 (4)2.范围 (4)3.责任者及职责 (4)4.验证简介 (4)5．验证过程 (7)6．结果判断 (8)7．结论和建议 (8)8．异常情况报告 (8)9．再验证 (8)10．附件 (8)附件1：培养基的灵敏度复核 (9)附件2：稀释液的无菌性检查 (10)附件3：方法验证 (11)1. 目的按照中国药典2010版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。
2. 范围本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。
3. 责任者及职责4. 验证简介4.1 定义●CFU：菌落数●供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。
●试验组当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。
●菌液组测定所加的试验菌数。
●稀释剂对照组用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。
4.2 菌悬液4.2.1菌种及来源检查人：复核人：检查日期：4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。
4.3 培养基及稀释液4.3.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水4.3.2培养基灵敏度复核培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》QC2524.3.3稀释液的无菌性检查对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。
最新微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案六、验证内容1.供试液的制备1.1.取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:10的供试液。
1.2.取1:10供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:100的供试液。
1.3.取1:100供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，充分振摇使混匀，作为1:1000的供试液。
备注：供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
2.菌液制备2.1.接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30〜35℃培养18～24小时；分别取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至、、、制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
2.2.接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25℃培养2～3 天；取此培养物用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，依次稀释至，制成每1ml含菌数为小于100cfu的菌悬液。
2.3.将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，使大量的孢子成熟。
加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至，制成每 1ml 含孢子数小于100cfu 的孢子悬液。
2.4.上述菌悬液制备后若在室温下放置，应在2小时之内使用；若保存在2~8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存有效期内使用。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查法验证方案文件编号：起草人：起草日期：_________ 审核人：审核日期：_________ 批准人：批准日期：_________********有限公司****有限公司文件编号：FA-YZ-微生物限度检查法验证方案1．概述药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于微生物限度检查。
所以对******微生物限度检查进行方法的验证。
2．目的为了保证检验质量，对所用的检验方法必须经过验证，才能确保检验结果的准确可靠。
3．适用范围本方案适用于****微生物方法学的确认与验证。
4．验证人员职责4.1．验证小组:组长：质量管理部经理成员：QC主管、微生物操作人员4.2．职责及分工：QC主管组织起草该验证方案，并组织实施该方案；微生物操作人员具体实施该方案；质量管理部经理协助和监控该方案的实施。
4.3．验证方案批准后，应进行培训。
由验证小组指定人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培训。
5．验证依据中国药典2015年版通则“1105”、“1106”6.****生物限度检验方法验证风险分析6.1 结果分析：通过以上采取的措施，风险均控制在可接受范围内。
7. 人员培训确认表8.验证方法6.1验证用样品： ****** 规格： 批号：****** 规格： 批号： ****** 规格： 批号：6.2． 验证用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号： 沙氏葡萄糖琼脂培养基 生产厂家：批号： 配制批号： 营养琼脂培养基 生产厂家： 批号： 配制批号： 胰酪大豆胨液体培养基 生产厂家： 批号： 配制批号： 沙氏葡萄糖琼脂培养基 生产厂家： 批号 ： 配制批号：麦康凯液体培养基生产厂家：批号：配制批号：麦康凯琼脂培养基生产厂家：批号：配制批号：6.3验证用菌种:金黄色葡萄球菌（CMCC(B)26 003）、大肠埃希菌（CMCC(B)44 102）、枯草芽孢菌（CMCC(B)63 501）、白色念珠菌（CMCC(F)98 001）、黑曲霉菌（CMCC(F)98 003）6.4菌液制备：6.4.4取经30℃~35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－5～10－7为不大于100cfu/ml 备用。
微生物限度检查方法学验证报告模板
微生物限度检查法验证试验报告1、样品：奥氮平盐酸氟西汀胶囊（批号20140807，20140808，20140809），规格：12mg/25mg2、试液与稀释液：pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：）、0.9%无菌氯化钠（批号：）、1%红四氮唑（批号：）、含1%聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：）。
3、主要的设备及器具：净化工作台（型号）、培养箱（型号）、电子天平（型号）、恒温摇床（型号）、生物安全柜（型号）、无菌培养皿、菌落计数器、接种环、、酒精棉球、酒精灯、刻度吸管（1ml，10ml）、锥形瓶、试管及试管塞、吸耳球、显微镜等。
4、验证试验用菌种：大肠埃希菌CMCC(B)44 102、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63 501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26 003、白色念珠菌CMCC(F)98 001、黑曲菌CMCC(F)98 003，均由中国药品生物制品鉴定所提供。
5、对照培养基：4-甲基伞形酮葡萄苷酸（MUG）培养基（批号），胆盐乳糖发酵培养基（批号），胆盐乳糖培养基（批号）；玫瑰红钠琼脂（批号）；营养琼脂（批号），营养肉汤培养基（批号），均由中国食品药品检定研究院提供。
6、试验用培养基：营养琼脂培养基（批号）；玫瑰红钠琼脂培养基（批号）；营养肉汤培养基（批号）；改良马丁培养基（批号），胆盐乳糖培养基（批号）；4-甲基伞形酮葡萄苷酸(MUG)培养基（批号），由******公司提供（配制）。
7、试验方案按《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ微生物限度检查法规定，本品微生物限度标准应为：1g供试品中，细菌数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
7.1 验证试验的目的对所采用的方法进行验证，确认该方法适用于本品的微生物限度检查，即确认本品在该检验量及检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除至可忽略不计，以确保检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。
中国药典微生物限度检查方法验证方案
中国药典微生物限度检查方法验证方案一、引言药品的质量与安全性是保障患者用药安全的重要方面。
微生物限度检查是药品质量控制的重要环节，用于评价药品中微生物的污染情况。
为确保检测结果的准确性和可靠性，本文旨在制定中国药典微生物限度检查方法验证方案。
二、背景微生物限度检查方法验证是指确定某一方法在特定条件下的适用性，方法验证的结果直接影响到药品生产和品质控制。
为了保证方法验证的可靠性，必须按照一定的规范和要求进行操作。
三、验证目的验证中国药典中所规定的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性，以确保药品的微生物限度符合国家及相关法规的要求。
四、验证程序1. 确定验证方法：根据中国药典中规定的微生物限度检查方法，选择合适的验证样品和验证条件。
2. 准备验证样品：从实际生产过程中随机选取药品样品，确保样品的代表性。
3. 执行验证实验：按照中国药典中的方法操作，对验证样品进行微生物限度检查。
4. 数据分析和评估：根据验证实验的结果，进行数据分析和评估，评估方法的准确性和可靠性。
5. 结果判定：根据数据评估结果，对微生物限度检查方法进行判定，判断方法是否适用于实际生产中的微生物限度检查。
6. 验证报告编制：根据验证实验的结果和结论，编制验证报告。
五、验证内容本次验证主要包括如下内容：1. 对选择的验证样品进行微生物限度检查。
2. 对验证样品进行菌落计数。
3. 对验证样品进行培养方法的验证。
4. 对不同微生物种类的检查方法进行验证。
5. 对不同微生物菌株的适应性进行验证。
六、风险评估在验证过程中，存在一定的风险因素，需进行风险评估，确保验证结果的可靠性和准确性。
风险评估主要包括验证样品来源的可靠性、实验操作的准确性、验证条件的合理性等。
七、验证结果与讨论根据验证实验的结果和数据分析，可以得出下列结论：1. 所验证的微生物限度检查方法在实际应用中的准确性和可靠性较高。
2. 所验证的微生物限度检查方法适用于不同药品制剂类型的微生物限度检查。
微生物限度检查方法验证方案
产品微生物限度检查验证方案产品微生物限度检查验证方案1.引言1.1概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料，辅料受微生物限度污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
本方案按2010年版药典要求：在建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定；应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。
故这里本方案主要进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证。
1.2范围：本方案适用于产品微生物限度检查法的验证。
2.目的：进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证和控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于产品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查。
3.验证人员：质量部QC 人员4.验证内容：4.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，控制菌检查验证4.1.1菌液制备4.1.1.1 取经30-35℃培养18-24小时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的营养肉汤培养物1ml,以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液逐级稀释至10-5-10-7，即制成每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
4.1.1.2 取经23-28℃培养24-48小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml,以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液逐级稀释至10-5-10-7，即制成每1ml含菌数为50-100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
4.1.1.3 取经23-28℃培养1周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物，以3-5ml pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液洗下霉菌孢子，吸取出孢子悬液至无菌试管内，取1 ml菌液,以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液逐级稀释为10-4，即制成每1ml含孢子数为50-100cfu的孢子悬液，做活菌计数备用。
4.1.2供试液制备称取产品样品10g，加pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，采用10倍稀释法，作为1:10供试液。
版中国药典微生物限度检查方法验证方案
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案起草部门：QC组签名：日期：审核部门：QC组签名：日期：部门：质量部签名：日期：批准质量负责人签名：日期：质量部颁发本文件根据需要应分发于以下部门：01 质量部下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
文件编号修订原因修订日期TS-VP-4201-00 按GMP（2010年修订版）要求新制定目录1. 概述2. 验证目的和范围3. 组织及职责4. 验证进度计划表5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认7.验证项目和验证方法7.1试验菌株7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法8.偏差与漏项控制9.验证报告会审1. 概述我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。
参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。
通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。
人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。
甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。
本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
2. 验证目的和范围验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。
微生物限度检查法验证方案(修订版)
审批及颁发：会审：分发：一、目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
二、范围本公司注射用水及纯化水的微生物限度检查。
三、职责验证组织及人员职责四、术语无五、内容1概述：按照中国药典2010版（第二部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，验证所采用的方法和条件适合于供试品的微生物限度检查。
2验证项目3 验证时间安排3.1 2013年04月01日至 2013 年04月05日制订、审核及批准验证方案；3.2 2013年04月06日至 2013 年04月 15日实施验证3.3 2013年04月16日至 2013年04月 20日写出验证报告4 验证前提条件确认4.1 相关文件及人员培训确认4.1.1 相关文件确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.1.2 验证人员确认结论: 检查人/日期：复核人/日期：4.2 验证用仪器仪表和物品有效性确认结论:检查人/日期：复核人/日期：4.3菌液制备4.3.1接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20～25℃培养24～48h。
上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50～100CFU的菌悬液。
4.3.2接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100CFU的孢子溶液。
4.4培养基及稀释液与供试液4.4.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌，即得。
微生物限度检查方法适用性验证方案样本
微生物限度检查办法合用性实验方案验证方案组织与实行微生物限度检查办法合用性实验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门关于人员构成验证小组，参加实行。
方案起草方案审核方案批准目录一、概述二、验证目和风险评估三、验证内容四、办法鉴定五、再验证周期六、参照文献七、成果评价及结论1、概述：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染限度办法。
检查项目涉及需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。
当建立产品微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数办法合用性实验和控制菌检查办法合用性实验，以确认所采用办法适合于该产品需氧菌、霉菌和酵母菌数测定和控制菌检查。
依照中华人民共和国药典，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行办法合用性实验。
2、实验目和风险评估：验证目：确认所采用需氧菌、霉菌和酵母菌计数办法及控制菌检查办法适合我公司所生产产品微生物限度检查。
风险评估：3、验证内容：3.1、培养基来源：确认人：确认日期：3.2、检查用培养基配制办法：确认人：确认日期：3.3、使用仪器确认人：确认日期：3.4、验证明验用菌种：确认人：确认日期：3.5实验办法：取供试品10 ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。
需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。
3.6菌液制备：3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，及时倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取不大于100CFU/ml和1000CFU/ml菌液备用。
3.6.2取白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养24～48h，取白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入9ml0.9％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，及时倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取不大于100CFU/ml和1000CFU/ml菌液备用。
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案微生物限度检查方法验证方案编码：表一、验证方案的起草与批准1.验证方案起草起草人：起草时期：年月日2.验证小组成员：3.验证方案审核4.验证方案批准批准人：批准日期：二、验证方案1.验证目的和原理1.1验证目的为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。
验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。
1.2原理通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。
2.验证方法步骤2.1验证前的准备：进行微生物限度检查方法验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
试验菌应包括G—、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。
2.2验证试验的操作计划：用3个不同批号产品微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断限度检查方法是否对产品有影响。
2.3试验结果可接受标准：用标准菌株评价方法“”的微生物限度检查对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组回收率也不低于70%。
3.试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：恒温培养箱、生化培养箱、电子天平、高压蒸汽灭菌器、净化工作台。
3.1.2操作环境：操作间应该安装空气除菌过滤层装置。
环境洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。
操作间或净化工作台的洁净空气应该保持对环境形成正压，不低于4.9pa。
3.1.3试验样品：批号：批号：批号：3.1.4培养基：3.1.5稀释液：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液以上经115℃高压蒸汽灭菌30min。
3.1.6验证用微生物名称及其编号编号由菌名首字母—传代代数—制备日期组成。
3.1.7器具：无菌薄膜过滤器：（孔径0.45um直径50mm）、无菌移液管（5ml）4.验证方法4.1菌液的制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种至10ml的无菌营养肉汤中在30～35℃下培养18～24小时，将白色念珠菌接种至改良马丁液体培养基中，在23～28℃下培养24～48小时。
纯化水微生物限度检查法验证方案和验证报告
*******有限公司验证文件纯化水微生物限度检查法验证方案纯化水微生物限度检查法验证方案起草、审核、批准：验证组织：目录1.验证目的2.验证人员职责3.参照标准4.验证项目内容5.评价合格标准6.验证试验材料7.验证实施计划8.菌液制备9.供试液制备10.计数方法验证11.控制菌检查方法验证12.验证结论和评价纯化水微生物限度检查法验证方案1. 验证目的：纯化水微生物限度试验采用薄膜过滤法检查。
确认该方法适合于纯化水细菌、霉菌及酵母菌数测定，控制菌的测定。
2．验证人员职责2.1验证领导小组：2、1、1负责验证方案及报告的批准2、1、2组织协调验证工作2、1、3签发验证证书。
2.2.项目验证小组长2.2.1.负责验证方案的起草2.2.2.负责验证的协调工作，以保证本验证方案的顺利实施。
2.2.3.负责验证报告的起草。
2.2.4.负责再验证周期的确认。
2．3. 质量部2．3.1.负责验证方案审核2．3.2.负责取样及对样品的检验2．3.3.负责收集验证记录，并加以分析后，协助项目验证小组长起草验证报告。
2．3.4.负责验证数据及结果的审核3. 参照标准：2010版中国药典一部附录XIII微生物限度检查法。
4. 验证项目内容：细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，控制菌检查方法验证。
5. 评价合格标准：试验组的菌回收率和稀释剂对照组的菌回收率均不得低于70%。
6. 验证试验材料：6.1. 被验证产品：品名纯化水取样点：（1）4T/h纯水系统二级反渗透装置进纯水箱口;(2) 4T/h纯水系统液体制剂二楼洁具间用水点；(3) 4T/h纯水系统三楼固体制剂纯水箱总回水口。
检验量5ml /次6.2. 仪器设备：6.2.1. YX.400A电热蒸汽压力消毒器6.2.2 YS－840净化工作台6.2.3. 101型电热干燥箱6.2.4. SPX-250B型生化培养箱6.2.5.PYX-DUS-X型隔水式电热恒温培养箱6.2.6 303A-4型电热培养箱6.2.7 天平6.3. 稀释剂：PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液；0.9%的无菌氯化钠溶液6.4. 验证用培养基6.5. 验证用菌株：7、验证设施计划8. 菌液制备8.1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌悬液的制备①取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物1白金耳接种至10ml 营养肉汤培养基中，35℃培养18~24小时。
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验证文件
******微生物限度
检查法验证方案
********有限责任公司
1适用范围
2目的
3概述
4验证所需要的仪器设备及文件
5可接受的限度范围标准
6测试方法
7异常情况处理
8测试结果
9结论
10再验证周期
11附表
1适用范围
本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。
《SP-80型生化培养箱操作维护保养SOP》
《ZDX-35B蒸汽灭菌器操作维护保养SOP》
《微生物限度检查法SOP》
5可接受的限度范围标准
5.1******微生物限度检查质量标准
项目
标准规定
细菌总数
≤1000个/g
霉菌、酵母菌
≤100个/g
大肠埃希菌
不得检出
5.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判断
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；若任一次试验中实验组的菌回收率低于70%，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。
5.3控制菌检查方法验证结果判断
若试验组检出试验菌（检出试验菌判断如下），按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用其他方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行验证。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数，玫瑰红钠培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌，细菌菌落数。然后将营养琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上细菌数与玫瑰红钠琼脂培养基上的霉菌和酵母菌或营养琼脂培养基上的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌落数为计数结果。
质量负责人： 审核人： 检验人
10再验证周期
10.1******的处方发生变动或其它因素变更导致******的物料性质改变时，需要对本方案进行调整后作方法学再验证。
10.2国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证。
11附表
附表1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果
试验
分类
实验
次数
大肠埃希菌
6.4验证试验方法:细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采用上述供试品，进行3次平行试验，分别人工污染上述5种代表试验菌株。控制菌检验方法验证采用上述批供试品进行实验。
6.4.1细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验
6.4.1.1试验分组
6.4.1.1.1供试品对照组：
取上述供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底细菌数；
6.3.1.3取新鲜的黑曲霉培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基，经25.5℃±2.5℃培养5～7d，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
2目的
建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。
3概述
3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010年版附录Ⅺ J《微生物限度检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法2薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。
6.3.2控制菌的检查菌液的制备
取新鲜的大肠埃希菌的培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，经32.5℃±2.5℃培养18～24h，用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含细菌数约为10～100cfu的菌悬液，做活菌计数备用。
6.3.3供试品制备
取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。
6.4.2.4大肠埃希菌的试验
取供试液10 ml（相当于供试品1g），制备滤膜，滤膜接种至适量（不少于100ml）的胆盐乳酸培养基中，30～35℃培养18～24小时，必要时可延长至48h。
取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管中，培养，于5h、24h在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作为本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
金黄色
葡萄球菌
枯草芽孢
杆菌
白色念珠菌
黑曲霉菌
试验组
1
2
3
菌液组
1
2
3
稀释剂对照组
1
2
3
供试品
对照组
1
取1：10供试液1ml，过滤，冲洗，分别在最后一次的冲洗液中加入白色念珠菌和黑曲霉悬液各1ml，过滤，按薄膜过滤法测定霉菌数。
6.4.1.1.4稀释剂对照组：
取实验用的稀释液1ml代替供试品，加入实验菌，制备滤膜，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。
6.4.1.2验证试验操作
6.4.1.2.1取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：10的供试液。取上述供试液1ml，加至适量稀释剂中，混匀，过滤，用pH7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。
6.4.1.3菌数报告规则
以相当于数，或<1乘以稀释倍数的值报告菌落数。
6.4.1.4计算公式
试验组的菌回收率%＝
6.4.2控制菌的检查验证试验
6.4.2.1试验分组
6.2.2.1.1试验组
取1：10供试液10ml，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入大肠埃希菌试验菌悬液1ml，过滤，滤膜接种至100ml的胆盐乳糖培养基中。
麦康凯琼脂
鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润
6测试方法
6.1供试品
******，批号(******)。
6.2培养基及菌种
6.2.1采用符合中国药典规定的干燥培养基，中国药品生物制品检定所制。
6.2.2枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B) 26003、大肠埃希菌CMCC（B）44102、白色念珠菌CMCC (F) 98001、黑曲霉CMCC(F)98003。
3.2验证时间：************批平行三次试验。
4验证所需要的仪器设备及文件
4.1验证需用仪器设备
器具名称
规格型号
检定日期
检定单位
有效期
电热恒温培养箱
HG101-3
多用生化培养箱
SP-80
蒸汽灭菌器
ZDX-35B
4.2验证所需要的文件及存放地方
资料名称
存放地点
《HG101-3电热恒温培养箱操作维护保养SOP》
6.2.2.1.2供试品组
取1：10供试液10ml，制备滤膜，滤膜接种至100ml的胆盐乳糖培养基中。
6.4.2.2阳性对照试验
取大肠埃希菌悬液1ml，同供试品的控制菌检查法检查。阳性对照试验应检出大肠埃希菌。
6.4.2.3阴性对照试验
取稀释液10ml，照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。
6.4.1.2.2阴性对照试验
取实验用的稀释液1ml，制备滤膜，滤膜菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养，每种培养基至少制备一张滤膜，均不得有菌生长。
6.4.1.2.3培养和计数细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至5～7天进行菌落计数报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
若平板上无菌落生长、或生长的菌落与下表所列的菌落形态特征不符，判定供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与下表所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。
培养基
菌落形态
曙红亚甲蓝琼脂
紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽
5.4大肠埃希菌检查结果判断
如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯培养基的平板上，培养18～24h。琼脂判供试品检出大肠埃希菌；
7异常情况处理
严格按照《微生物限度检查法SOP》操作，如在检测中出现不符合要求的情况出现，分析问题原因后，决定是否需对本方案中设定的******的微生物限度检查方法进行修改，并重新进行验证。
8测试结果
8.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表1。
8.2控制菌的检查方法验证结果见附表2。
8.3按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表3。
取上述供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底霉菌和酵母菌数；
6.4.1.1.2菌液组：
分别取上述5种试验菌悬液1ml，制备滤膜，按菌落计数方法测定所加的试验菌数。