适用于共聚焦显微镜的玻片结构的制作技术
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)技术简介
.b ž激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
它是在荧光ž显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像, 成为形态学﹑分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。
同时,激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具。
不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”; 进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析; 还可用于活细胞生理信号, 离子含量的实时动态分析监测, 粘附细胞的分选, 细胞激光显微外科和光陷阱技术等。
可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
- www 生物秀-专心做生物w ww .b b i o o .c o mIntroductionžLSCM 是一种高科技显微镜ž荧光显微镜成像为基础，加装了激光扫描装置, 计算机进行图像处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
ž无损伤的“光学切片”ž细胞三维立体机构ž实时动态分析监测激光扫描共聚焦显微镜( LSCM) 是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。
生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mž光学显微镜部分ž激光发射器ž扫描装置ž光检测器ž计算机系统( 包括数据采集, 处理, 转换, 应用软件)ž图像输出设备LSCM 的基本组成生物秀-专心做生物w w w .b b i o o .c o mLSCM 的原理激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源, 标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。
而LSCM 以激光为光源, 激光具有单色性强﹑方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。
激光共聚焦显微镜样品制备方法(二)——组织切片样品
激光共聚焦显微镜样品制备方法(二)——组织切片样品
边玮
【期刊名称】《电子显微学报》
【年(卷),期】2010(029)004
【摘要】应用激光共聚焦显微镜技术对荧光标记的组织切片样品进行三维观察成像是生物学研究的常规手段.本文主要介绍实验室制备用于激光共聚焦显微镜成像的冷冻组织切片及免疫荧光标记过程.
【总页数】4页(P399-402)
【作者】边玮
【作者单位】中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海,200031
【正文语种】中文
【中图分类】Q336;TG115.21+5.3
【相关文献】
1.火花源原子发射光谱法测定海绵钛样品及样品制备方法的影响 [J], 俞超;汪永喜;蒋增辉;曾次元
2.煤岩样品TEM超薄切片制备方法研究 [J], 于冰;周蕊;卢兆林;于红丽;路瑶
3.激光共聚焦显微镜样品制备方法(一)——细胞培养样品 [J], 余礼厚
4.动物源性成分鉴别的样品制备方法研究——应用于PCR及荧光定量PCR方法的样品制备 [J], 李洁;陆仲斐;童锐;李向伟;周凌
5.石蜡切片组织透射电镜样品制备方法的比较分析 [J], 黄远洁
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激光共聚焦显微镜分析技术
狭分缝光谱扫描
光谱扫描带宽 精度 2 纳米
滤光片系统 OTE
灵敏度较光谱式差
光学能量转移效率
94%
98% 88.5% 86.7% 90.3% 88.5% 100%
光谱式探头
棱镜分光,狭缝扫描,全无滤片
• 第一优势:提高灵敏度 • 光谱式与滤光片比较： 88% 对 61% • 为了达到相同样品质量 (相同探测发射 能量), 较低OTE 的仪器需要较高激光能 量作为激发以致更大机会做成样品漂白 ，干 扰 PSF, 因此降低图象质量
• Seamless recording of full spectrum
• Up to 4 PMT´s with individual gain adjustments to compensate for emission properties of stains
(PMT=Photomultiplier tube)
激光光源扫描器内装有针孔光栏分光镜发射荧光单色器及检测器荧光显微镜装有微米步进马达系统光学装置计算机图像存储与处理及控制系统
激光共聚焦显微镜技术 第2章
激光扫描共聚焦显微镜的基本结构、 工作原理及基本功能
一 、激光扫描共聚焦显微镜的基本结构和工作 原理 激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集 和分析的大型精密仪器。其主要由以下几部分组 成:激光光源、扫描器（内装有针孔光栏、分光 镜、发射荧光单色器及检测器)荧光显微镜（装 有微米步进马达）系统、光学装置、计算机图像 存储与处理及控制系统。
Emission Filter Emission Pinhole
Principle of a standard Confocal
Detector
Barrier Filter Fixed characteristics Pinholes
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学领域常用的实验技术，它们在细胞和组织的研究中扮演着重要的角色。
虽然它们都是用于检测特定蛋白在生物样本中的表达情况，但在操作方法、原理和应用范围上却有着明显的区别。
在本文中，我将深入探讨这两种技术的区别，并就其在生物医学研究中的应用进行全面评估，以期帮助读者更深入地理解并灵活运用这两种技术。
1. 免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白表达的技术。
它的操作流程大致包括取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、蛋白质检测、染色和显微镜观察等步骤。
在实验过程中，首先需要将样本切片，并通过特定的固定、脱水和包埋步骤将其固定在载玻片上。
随后，利用抗原修复方法还原蛋白的空间结构，以便后续的免疫染色。
接下来，通过加入特定的抗体和标记物，可以对目标蛋白进行特异性染色，并最终通过显微镜观察蛋白在组织或细胞中的表达情况。
2. 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是利用特定抗体与荧光染料结合，通过检测荧光信号的方式来标记和检测生物样本中的特定蛋白表达。
它的操作流程也包括取材、固定、脱水、包埋、切片等步骤，与免疫组化法的操作步骤较为类似。
不同的是，在免疫荧光染色法中，需要利用特定的荧光标记的二抗或荧光素-抗素进行染色，通过激光共聚焦显微镜等设备观察样本中荧光的分布情况，从而检测目标蛋白的表达位置和水平。
在应用范围方面，免疫组化法主要用于研究组织切片或细胞样本中特定蛋白的表达情况，可以定量地评估蛋白的表达水平和分布情况，适用于体内和体外实验样本。
而免疫荧光染色法由于其高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞共聚焦显微镜观察，可以用于检测细胞中蛋白的定位、表达和相互作用等，是细胞生物学和免疫学研究中常用的技术手段。
在本文中，我主要介绍了免疫组化法和免疫荧光染色法的操作原理、步骤和应用范围，并就其在生物医学研究中的应用进行了全面评估。
通过对这两种技术的深入了解，我们可以更好地选择合适的技术手段，并在实验设计和结果分析中更加灵活地运用这些技术来开展生物医学研究。
共聚焦显微镜原理和应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
共聚焦显微镜简介及免疫荧光染色
观察方式：以荧光为主
光源：激光（紫外、可见光）
照明方式：点照明、逐点扫描
成像方式：共聚焦、逐点成像
输出：实时观测，数字化图像，可以进行
图像处理和定量分析
多重染色样品的观察
基本功能
多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像
采集
光学显微镜分辨率：0.25μm
共焦显微镜分辨率：0.18μm
样品经荧光标记组织切片在载玻片上用盖玻片封片固定的或活的贴壁培养细胞应培养在共聚焦专用小培养皿或盖玻片上悬浮细胞甩片或滴片后用盖玻片封片载玻片厚度应在0812mm之间盖玻片应光洁厚度在017mm左右标本不能太厚如太厚激发光大部分消耗在标本下部而物镜直接观察到的上部不能充分激发尽量去除非特异性荧光信号封片剂多用甘油
冲洗后，加入0.3% Triton X-100穿透细胞膜5min，
PBS（5min×3），加入2% BSA封闭抗原30min。
（3）滴加一抗
滴加用PBS稀释的一抗，湿盒内4℃孵育过夜。每次
实验均作空对照白（PBS代替一抗）和同型对照（
兔/鼠血清或IgG亚型代替一抗）。
二、间接免疫荧光染色（FITC标记）
工程师，寻求专业帮助。
➢ 保证外部电源供应稳定。
➢ 由于环境的变化会影响各部件的相对位等，无论
工作与否请保持室内恒温，清洁，干燥。室温
22-25 摄氏度，相对湿度80%以下为宜。
➢ 使用一段时间后，精密器件可能会由于环境等因
数引起偏移，为保证仪器正常使用，请与 Leica
的专业工程师联系，及时调较仪器。
➢ 使用显微镜油镜后请用无水乙醇清洁镜头前部。
日常保养及注意事项
➢ 短时间的停顿工作时，无需关闭系统。
激光共聚显微镜最适合的组织切片厚度
总之，最适合的组织切片厚度在10-50微米范围内，但具体选择应根据研究目的、样品类 型和显微镜系统的要求进行综合考虑。
一般来说，LSCM适用于观察较薄的组织切片，通常在10-50微米的范围内。这是因为激 光在组织中的穿透深度受到散射和吸收的限制，较厚的切片会导致光的衰减和散射，从而影 响成像质量度
然而，对于某些特定的组织类型或研究目的，可能需要更厚的切片来观察组织的整体结构 和关系。在这种情况下，可以使用透明化技术（如组织透明化或免疫组织化学透明化）来提 高光的穿透性，以获得更好的成像效果。
激光共聚显微镜最适合的组织切片厚度
激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分 辨率的显微镜技术，适用于观察细胞和组织的三维结构。对于使用LSCM进行组织切片观察 ，最适合的切片厚度取决于多个因素，包括光的穿透深度、分辨率要求和样品类型。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围激光扫描共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。
把光学成像的分辨率提高了30%~40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代的研究工具。
1 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的原理从基本原理上讲,共聚焦显微镜是一种现代化的光学显微镜,它对普通光镜从技术上作了以下几点改进:1．1用激光做光源因为激光的单色性非常好,光源波束的波长相同,从根本上消除了色差。
1．2采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板,将焦平面以外的杂散光挡住,消除了球差;并进一步消除了色差1．3采用点扫描技术将样品分解成二维或三维空间上的无数点,用十分细小的激光束(点光源)逐点逐行扫描成像,再通过微机组合成一个整体平面的或立体的像。
而传统的光镜是在场光源下一次成像的,标本上每一点的图像都会受到相邻点的衍射光和散射光的干扰。
这两种图像的清晰度和精密度是无法相比的。
1．4用计算机采集和处理光信号,并利用光电倍增管放大信号图在共聚焦显微镜中,计算机代替了人眼或照相机进行观察、摄像,得到的图像是数字化的,可以在电脑中进行处理,再一次提高图像的清晰度。
而且利用了光电倍增管,可以将很微弱的信号放大,灵敏度大大提高。
由于综合利用了以上技术。
可以说ＬＳＣＭ是显微镜制作技术、光电技术、计算机技术的完美结合,是现代技术发展的必然产物。
2 ＬＳＣＭ在生物医学研究中的应用目前,一台配置完备的ＬＳＣＭ在功能上已经完全能够取代以往的任何一种光学显微镜,它相当于多种制作精良的常用光学显微镜的有机组合,如倒置光学显微镜、紫外线显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜(ＰＨ)、微分干涉差显微镜(ＤＩＣ)等,因此被称为万能显微镜,通过它所得到的精细图像可使其他的显微镜图像无比逊色。
共聚焦制片方法
共聚焦制片方法共聚焦制片方法是一种在生物学和医学领域中广泛使用的技术，主要用于制作高分辨率、三维的样品图像。
其基本原理是利用激光束扫描样品，同时收集每个点的荧光信号，并通过对这些信号的精确分析，生成样品的三维图像。
下面将详细介绍共聚焦制片方法的基本原理、操作步骤和优缺点。
一、基本原理共聚焦制片方法基于共聚焦显微镜的原理，通过将激光束聚焦在样品上的某一特定点，激发该点的荧光。
然后收集该点的荧光信号，并将其传递给光电倍增管（PMT）进行检测。
由于激光束的聚焦点非常小，因此可以获得高分辨率的图像。
同时，通过对样品进行扫描，可以得到整个样品的图像。
二、操作步骤1.样品准备：选择适当的固定剂和染料，将样品固定在载玻片上，并进行染色。
2.扫描步骤：将样品放置在共聚焦显微镜下，调整焦距和光源，启动扫描程序。
扫描过程中，激光束会逐点扫描样品，同时收集每个点的荧光信号。
3.图像重建：通过对收集到的荧光信号进行分析和处理，可以重建出样品的三维图像。
三、优缺点1.优点：共聚焦制片方法具有高分辨率、高灵敏度和高轴向分辨率等优点。
它能够清晰地呈现出样品的细节和结构，适用于各种不同类型的样品，如细胞、组织、蛋白质等。
此外，共聚焦制片方法还可以进行多通道检测和定量分析，为研究提供了更多的信息。
2.缺点：共聚焦制片方法也存在一些缺点。
首先，由于激光束的聚焦点很小，因此需要逐点扫描样品，这使得扫描速度较慢。
其次，由于需要使用激光束和光电倍增管等昂贵的设备，因此共聚焦制片方法的成本较高。
此外，操作共聚焦显微镜需要一定的专业技能和经验，这也增加了使用难度。
最后，由于样品需要经过固定和染色等处理，可能会对样品的结构和活性产生影响。
四、应用领域共聚焦制片方法在生物学、医学、材料科学等领域中得到了广泛应用。
例如，在生物学中可以用于研究细胞结构和功能；在医学中可以用于诊断和治疗各种疾病；在材料科学中可以用于研究材料的微观结构和性能。
此外，共聚焦制片方法还可以用于制备高质量的荧光图像，用于科学研究、临床诊断和工业生产等领域。
激光共聚焦显微镜样品制备方法_一_细胞培养样品
第29卷第2期2010年4月电子显微学报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol-29，No.22010-04文章编号：1000-6281（2010）02-0185-04激光共聚焦显微镜样品制备方法（一）———细胞培养样品余礼厚（中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，上海200031）摘要：随着激光共聚焦显微镜在生物学研究中的广泛应用，绿色荧光融合蛋白能够提供蛋白质在细胞体内的精确时空信息。
因此免疫荧光样品的制备也成为基本的细胞生物学实验方法。
本文主要介绍在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
关键词：绿色荧光蛋白；细胞培养；免疫荧光；激光共聚焦显微镜中图分类号：Q336文献标识码：A收稿日期：2010-03-20作者简介：余礼厚（1982－），男（汉族），四川自贡人，博士，E-mail ：lhyu@.随着生物学研究的不断深入，越来越多的研究要求在细胞体内（in vivo ），甚至是动物体水平上研究蛋白质功能或动态变化。
而随着检测设备的提升、各种显微技术的发展和标记手段的提高，使得研究者能够迅速、准确地观察到蛋白质在细胞内的表达情况和定位。
通过激光共聚焦显微镜观察荧光标记细胞内的蛋白质和分子，为生物学的研究提供了更直观的观测手段。
因此免疫荧光样品的制备也成为生物学研究中的基本技术方法。
鉴于生物体内的复杂多样性，制备免疫荧光样品的方法也存在一些差异。
本文主要介绍构建绿色荧光融合蛋白表达载体，并在培养细胞中表达绿色荧光融合蛋白及免疫荧光样品的制备过程。
1绿色荧光融合蛋白表达载体的构建绿色荧光蛋白（green fluorescent protein ，GFP ）及其突变体能在各种不同的生物系统中表达，这对细胞生物学的研究具有重要意义［1］。
而荧光蛋白的折叠能力及其同细胞内蛋白的融合能力，使研究者能直接在细胞体内观察到蛋白质的特性。
激光共聚焦显微镜用法
激光共聚焦显微镜用法
激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）是一种高分辨率的显微镜，其能够通过激光束在样品表面扫描，获得高分辨率的三维图像。
以下是激光共聚焦显微镜的使用方法：
1. 样品制备：将样品制备好，并固定在载玻片或载片上，以便于放入显微镜中观察。
2. 调整显微镜：将载玻片或载片放入显微镜中，调整激光聚焦点的位置和大小，以便于观察样品的细节。
3. 设置参数：根据样品的性质和需要观察的结构，设置激光功率、扫描速度、探测器增益等参数，以获得最佳的成像效果。
4. 开始扫描：启动激光扫描仪，将激光束在样品表面扫描，获得高分辨率的三维图像。
5. 分析数据：通过软件对获得的图像进行处理和分析，以获得更详细的信息和结构。
6. 结果展示：将处理后的图像进行展示和分析，以便于研究人员对样品进行更深入的了解和研究。
总之，激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜，其能够帮助研究人员观察和研究样品的细节和结构，为生物医学研究和材料科学研究提供了强有力的工具。
共聚焦激光显微镜技术
激光共聚焦显微镜技术绪论激光共聚焦显微镜技术（Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM)是将显微镜技术与激光技术有效的结合，对具有荧光标记的物的形态及功能，通过计算机控制可以对其单层面进行快速扫描，也可以对多个层面进行连续光片层扫描。
逐层获得二维光学横断面图像，并可通过计算机三维重组软件支持，获得真三维图像。
激光共聚焦显微镜汇集了激光技术、显微镜技术、免疫荧光技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等，高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。
使其成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
我们大家知道，从人类制作的第一台显微镜到现在以有几百年的历史来了，随着人类对生命科学研究的不断深入，各种显微镜应运而生，使得研究细胞的手段以更加精密化和多样化。
共聚焦显微镜的理论是在1957年Marvin Minsky提出的，但共聚焦显微镜作为商品推出是在20世纪80年代初期，早期的激光共聚焦显微镜在技术上很不完善，其应用也受到限制。
至到20世纪80年代末，光学系统设计不断改进，成像的质量和灵敏度都有所提高，进入90年代初，激光共聚焦显微镜系统中逐步引入混合激光和紫外激光技术。
90年代末由美国Meridian公司推出的新型激光共聚焦显微镜系统，已具备完善的光学系统，模块化的仪器设计，灵活的软件和高配置的计算机硬件，从而使共聚焦显微镜系统的功能不断升级，应用的领域不断扩展。
随着生命科学研究的不断深入及荧光探针技术的迅速发展，共聚焦显微镜将推动生命科学研究的迅速发展，同时生命科学研究的进展也将使激光显微镜技术不断改进和完善。
激光共聚焦显微镜是现今最为先进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能，并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图像，并可以任意角度旋转，观察细胞，组织立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。
显微镜切片制作方法
显微镜切片制作方法一、引言显微镜切片制作是一种常见的组织学研究方法，可以通过切割样本制作薄片以便观察细胞和组织的细节结构。
本文将介绍显微镜切片制作的基本步骤和技巧。
二、材料准备1. 组织样本：可以是动植物组织、细胞培养物等。
2. 甲醇、乙醇和戊醇：用于固定组织样本。
3. 蜡块：用于包埋组织样本。
4. 切片刀：用于切割组织样本。
5. 显微镜载玻片：用于固定切片。
三、步骤详解1. 组织固定：将组织样本放入甲醇中固定，固定时间根据组织样本的大小和类型而定，通常为数小时至过夜。
固定的目的是保持组织样本的形态结构和细胞组织的完整性。
2. 组织脱水：将固定的组织样本转移到乙醇中进行脱水处理。
脱水的目的是逐渐去除甲醇，并使组织样本逐渐适应乙醇的性质。
3. 组织透明化：将脱水后的组织样本转移到戊醇中进行透明化处理。
透明化的目的是使组织样本逐渐适应戊醇的性质，为后续的包埋和切片做准备。
4. 组织包埋：将透明化处理后的组织样本放入蜡块中进行包埋。
包埋的目的是将组织样本固定在一个坚硬的蜡块中，以便进行切割。
5. 切片：用切片刀将包埋好的组织样本切成薄片。
切片时要注意控制切割厚度和角度，以获得清晰的切片。
6. 切片上玻片：将切好的组织片用显微镜载玻片固定。
将载玻片放置在切片上，轻轻按压使其粘合在一起。
7. 去蜡：将载玻片放入去蜡盒中进行去蜡处理。
去蜡的目的是去除切片中的蜡质。
8. 染色：将去蜡后的载玻片放入染色盒中进行染色处理。
染色的目的是增强切片的对比度，使细胞和组织的结构更加清晰可见。
9. 封片：将染色后的载玻片用封片剂封住。
封片的目的是保护切片，防止其受到外界的损害。
10. 干燥：将封好的载玻片放置在通风干燥的环境中晾干。
干燥的目的是使封片剂固化，并使切片逐渐变得坚硬。
四、技巧与注意事项1. 操作中要注意卫生和安全，避免污染和伤害。
2. 操作前要确保所使用的材料和设备都是干净的，并且没有损坏。
3. 在切片过程中，要控制切割的速度和力度，以避免切片的厚度不均匀或切割过多。
共聚焦固定流程
共聚焦固定流程标题：共聚焦显微镜固定流程详解一、引言共聚焦显微镜是一种高分辨率、高灵敏度的光学显微镜技术，能够提供细胞和组织的三维图像。
在进行共聚焦显微镜观察前，样本的固定是至关重要的步骤，它能保持细胞结构的完整性，防止样品变形或降解。
以下是一份详细的共聚焦显微镜固定流程指南。
二、固定材料准备1. 固定剂：常用的固定剂有4%多聚甲醛（PFA）或10%中性缓冲甲醛溶液（NBF）。
根据实验需求，可以选择合适的固定剂。
2. PBS缓冲液：用于清洗样本，防止固定剂过量或残留。
3. 防脱剂：如明胶或琼脂糖，用于防止细胞在处理过程中脱落。
三、固定流程1. 样本制备：将待观察的细胞或组织样本放置在适当的载玻片上。
2. 初次清洗：用PBS缓冲液轻轻冲洗样本，去除可能影响固定的杂质。
3. 固定：滴加预热至室温的固定剂，确保样本完全浸没。
固定时间通常为30分钟到2小时，具体时间根据样本类型和实验需求调整。
4. 再次清洗：固定完成后，用PBS缓冲液彻底清洗样本，去除多余的固定剂。
5. 防脱处理：在样本上滴加防脱剂，如明胶或琼脂糖，防止后续操作中样本脱落。
6. 保存：将样本置于4℃冰箱中保存，等待进一步的处理，如染色或切片。
四、注意事项1. 固定过程应避免剧烈震荡，以免破坏细胞结构。
2. 固定剂的选择和浓度应根据样本类型和实验目的来定，例如，对蛋白质免疫标记，4% PFA常被推荐。
3. 固定后，样本应尽快进行后续处理，以防止固定剂对样本产生不良影响。
总结，共聚焦显微镜的固定流程需要精细操作，每个步骤都可能影响最终的观察结果。
理解并遵循正确的固定流程，是获取高质量共聚焦图像的关键。
一种用于激光共聚焦显微镜拍照的细胞培养装置[实用新型专利]
![一种用于激光共聚焦显微镜拍照的细胞培养装置[实用新型专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/b0671be9a6c30c2258019e60.png)
专利名称：一种用于激光共聚焦显微镜拍照的细胞培养装置专利类型：实用新型专利
发明人：马元,曾晓宁,俞琪珺,伏杭江
申请号：CN201820009799.4
申请日：20180104
公开号：CN207793288U
公开日：
20180831
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种用于激光共聚焦显微镜拍照的细胞培养装置，属于生物实验器材领域。
所述细胞培养装置包括主板、卡槽、载玻片和培养小室挡板，所述主板为包括至少一个框的框架结构，所述框架结构内侧中部以及主板中与框架结构对应的一侧框中部设有卡槽，所述载玻片置于框架结构内部，并且载玻片的边缘位于卡槽内，所述培养小室挡板设于载玻片上、框架结构内侧，所述培养小室挡板将框架结构内的载玻片上部空间分成至少一个小室。
本实用新型设计合理，操作简便易行，硼酸盐载玻片透明度高、折光性好，便于共聚焦显微镜观察、拍照。
载玻片下部悬空，可防止细胞污染，并防止载玻片底部的污渍干扰实验。
采用多个培养小室设计，便于实验分组，大大降低实验成本。
申请人：马元
地址：210029 江苏省南京市广州路300号
国籍：CN
代理机构：南京经纬专利商标代理有限公司
代理人：唐循文
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显微镜的制作方法
显微镜的制作方法显微镜是一种用于观察微小物体的光学仪器。
它的制作方法主要分为以下几个步骤：选材、磨、磨光、抛光、上薄膜和组装。
下面将详细介绍这些步骤。
1.选材显微镜的主要部件是透镜，因此选材十分重要。
常用的透镜材料有玻璃和塑料。
在选材时需要考虑折射率、透过率、耐热性以及成本等因素。
一般情况下，玻璃透镜的光学性能更好，但成本较高。
2.磨在磨制透镜前，需要制作一个磨盘。
磨盘可以使用坚硬的材料，如玻璃或金属。
磨镜工具通常有砂轮和磨片。
首先，将磨盘用砂轮磨成形状。
然后再碾压石英砂和水，使其粘附在磨盘上。
接着，将透镜材料固定在磨盘上，并开始进行磨光。
磨光的过程需要持续时间较长，通常需要多次重复进行，直到获得所需的曲率和粗糙度。
3.磨光磨光是通过移动材料和磨盘之间的相对位置来完成的。
使用磨片时，通常需要在磨盘上加入一些研磨流体，以减少摩擦和热量，避免透镜受到热损伤。
在磨光过程中，需要经常检查透镜的曲率和粗糙度，以确保达到设计要求。
4.抛光抛光是在磨光的基础上进一步提高透镜的表面质量。
它的目的是去除磨光过程中留下的微小划痕和不均匀区域。
抛光也需要使用磨片和研磨流体。
然而，与磨光不同的是，抛光过程中磨盘和材料之间有更小的接触力，以减少表面划痕的产生。
5.上薄膜透镜的表面常常上有一层薄膜，以提高其防反射和耐磨性能。
通常使用化学气相沉积或溅射技术来制备这层薄膜。
化学气相沉积是将透镜放入真空腔体中，通过蒸发或分解一种或多种化合物，使其在透镜表面上形成一层薄膜。
溅射技术则是将制备好的薄膜材料放入真空腔室中，利用电子束、离子束等作用力将其溅射到透镜表面上。
6.组装最后一步是将透镜组装到显微镜的结构中。
这通常包括将透镜固定在透镜筒子上，并安装其他光学组件，如镜片、物镜和目镜。
组装过程中需要精确的校准和调整，以确保光线能正确地聚焦在样本上。
总结：。
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本技术公开了一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构，包括：中间玻片，所述中间玻片上设有若干第一通孔；盖玻片和载玻片，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次层叠设置；弹性材料制成的密封圈，设于所述第一通孔内且厚度略大于所述中间玻片的厚度，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次贴合时所述密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接。
通过设置密封圈，使用时先把中间玻片放在载玻片上，然后把密封圈放在第一通孔内，然后把观察物置于密封圈内，然后盖上盖玻片，再使用外置的夹紧件夹紧盖玻片、中间玻片和载玻片，由于密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接，透明剂和荧光染料不容易溢出。
权利要求书1.一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：包括：中间玻片，设有若干第一通孔；盖玻片和载玻片，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次层叠设置；弹性材料制成的密封圈，设于所述第一通孔内且厚度略大于所述中间玻片的厚度，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次贴合时所述密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接。
2.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述第一通孔的内侧壁与所述密封圈之间设有第一间隙。
3.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述密封圈的颜色为黑色。
4.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述第一通孔有两个。
5.根据权利要求1所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：还包括若干夹紧件，所述夹紧件具有上夹持部和下夹持部，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片均设于所述上夹持部和所述下夹持部之间，所述上夹持部与所述盖玻片抵接，所述下夹持部与所述载玻片抵接，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次紧贴。
6.根据权利要求5所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述盖玻片呈横向设置的矩形板状，所述夹紧件有两个，两个夹紧件分别设于所述盖玻片的左端、右端。
7.根据权利要求5所述的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，其特征在于：所述夹紧件为回形针。
技术说明书适用于共聚焦显微镜的玻片结构技术领域本技术涉及实验器材领域，特别是涉及一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构。
背景技术目前国内许多实验室所使用的激光共聚焦显微镜是倒置式的，一般有两种方式把观察物、透明剂和荧光染料的混合物置于物镜上方；其中一种方式是使用共聚焦专用培养皿，其为塑料的培养皿体底部嵌上厚度约为0.17mm的玻璃片，玻璃片通过一种特殊的透明生物胶与培养皿体底部粘合，直接把共聚焦专用培养皿置于物镜上方即可，但是其难以清洗和灭菌，只能一次性使用，实验成本较高；另一种方式是使用常规的盖玻片与载玻片的组合结构，把观察物置于载玻片上、滴加透明剂和荧光染料，然后盖上盖玻片，然后把整个盖玻片与载玻片的组合结构翻转，再置于物镜上方，由于液体的表面张力作用，盖玻片与载玻片会保持贴合、不会掉落，但这样盖玻片与载玻片之间的空间很小，透明剂和荧光染料容易溢出，而实验中使用的透明剂(如冬青油)和荧光染料(DAPI)等大多具有刺激性气味并具有毒性，经常接触会对人体造成伤害。
技术内容本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
为此，本技术提出一种适用于共聚焦显微镜的玻片结构，所述玻片结构使用时透明剂和荧光染料不容易溢出。
根据本技术实施例的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，包括：中间玻片，所述中间玻片上设有若干第一通孔；盖玻片和载玻片，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次层叠设置；弹性材料制成的密封圈，设于所述第一通孔内且厚度略大于所述中间玻片的厚度，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次贴合时所述密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接。
根据本技术实施例的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，至少具有如下技术效果：通过设置密封圈，使用时先把中间玻片放在载玻片上，然后把密封圈放在第一通孔内，然后把观察物置于密封圈内，然后盖上盖玻片，再使用外置的夹紧件夹紧盖玻片、中间玻片和载玻片，由于密封圈的上、下侧分别与所述盖玻片、所述载玻片抵接，透明剂和荧光染料不容易溢出。
根据本技术的一些实施例，所述第一通孔的内侧壁与所述密封圈之间设有第一间隙。
根据本技术的一些实施例，所述密封圈的颜色为黑色。
根据本技术的一些实施例，所述第一通孔有两个。
根据本技术的一些实施例，本技术还包括若干夹紧件，所述夹紧件具有上夹持部和下夹持部，所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片均设于所述上夹持部和所述下夹持部之间，所述上夹持部与所述盖玻片抵接，所述下夹持部与所述载玻片抵接，使得所述盖玻片、所述中间玻片和所述载玻片依次紧贴。
根据本技术的一些实施例，所述盖玻片呈横向设置的矩形板状，所述夹紧件有两个，两个夹紧件分别设于所述盖玻片的左端、右端。
根据本技术的一些实施例，所述夹紧件为回形针。
本技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本技术的实践了解到。
附图说明本技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1是本技术实施例的玻片组件的结构主视图；图2是本技术实施例的玻片组件的结构俯视图；图3是图2中所示的玻片组件与夹紧件的装配结构示意图。
附图标记：玻片组件100、盖玻片110、中间玻片120、载玻片130、密封圈140、夹紧件200。
具体实施方式下面详细描述本技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
在本技术的描述中，需要理解的是，涉及到方位描述，例如上、下、前、后、左、右等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本技术和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本技术的限制。
此外，若干的含义是一个或者多个，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。
如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本技术的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本技术中的具体含义。
下面参考图1和图2描述根据本技术实施例的适用于共聚焦显微镜的玻片结构。
如图1和图2所示，根据本技术实施例的适用于共聚焦显微镜的玻片结构，包括盖玻片110、中间玻片120、载玻片130和密封圈140。
中间玻片120上设有若干第一通孔；盖玻片110、中间玻片120和载玻片130依次层叠设置；密封圈140由弹性材料制成，密封圈140设于第一通孔内且厚度略大于中间玻片120的厚度，使得盖玻片110、中间玻片120和载玻片130依次贴合时密封圈140的上、下侧分别与盖玻片110、载玻片130抵接。
例如，如图1和图2所示，盖玻片110、中间玻片120、载玻片130和密封圈140合称为玻片组件100，盖玻片110、中间玻片120和载玻片130可均为横向设置的矩形板状，盖玻片110、中间玻片120和载玻片130由上至下依次层叠设置，密封圈140设于盖玻片110和载玻片130之间且设于第一通孔内。
使用时，先把中间玻片120放在载玻片130上，然后把密封圈140放在第一通孔内，然后把观察物、透明剂和荧光染料的混合物置于密封圈140内，然后盖上盖玻片110，再使用外置的夹紧件200夹紧盖玻片110、中间玻片120和载玻片130，即可整体翻转然后置于物镜上方，由于密封圈140的上、下侧分别与盖玻片110、载玻片130抵接，观察物中的透明剂和荧光染料不容易溢出，密封圈140和载玻片130之间可通过热熔胶贴合，使得添加透明剂和荧光染料时透明剂和荧光染料不会从密封圈140和载玻片130之间流出；同时，使用完毕后可拆分盖玻片110、中间玻片120、载玻片130和密封圈140分别进行清洗和灭菌，可重复使用，实验成本较低。
此外，盖玻片110、载玻片130和密封圈140都可直接购买获得，中间玻片120可由另外一块载玻片130使用玻璃开孔器开孔制成，结构简单，制作简便，便于进行推广使用。
在本技术的一些实施例中，第一通孔的内侧壁与密封圈140之间设有第一间隙。
加工中间玻片120时可把第一通孔的直径加工成比密封圈140的外径大，这样把密封圈140放在第一通孔内第一通孔的内侧壁与密封圈140之间即有第一间隙，当然也可先在中间玻片120上加工出第一通孔，再购买外径比第一通孔的直径小的密封圈140。
这样把观察物置于密封圈140内时，透明剂和荧光染料的量能加至稍微溢出密封圈140，再盖上盖玻片110，排出密封圈140内的空气，出去空气的干扰，而溢出的透明剂和荧光染料会留置在第一间隙内，载玻片130、中间玻片120、盖玻片110紧贴时透明剂和荧光染料不会被挤出，实验员翻转、挪动本技术时不会接触到透明剂和荧光染料。
根据本技术的一些实施例，密封圈140的颜色为黑色。
当第一通孔有两个以上时，黑色的密封圈140能避免共聚焦显微镜拍照时孔间荧光的影响。
根据本技术的一些实施例，第一通孔有两个。
如图1和图2所示，中间玻片120具有两个第一通孔，载玻片130、中间玻片120和盖玻片110均呈横向设置的矩形板状，两个第一通孔左右间隔设置，这样能一次观察两个样品，简化实验操作。
需要说明的是，第一通孔的数量为至少一个即可，当为一个时附图中未示出，第一通孔可设于经常中间玻片120的中部。
根据本技术的一些实施例，本技术还包括若干夹紧件200，夹紧件200具有上夹持部和下夹持部，盖玻片110、中间玻片120和载玻片130均设于上夹持部和下夹持部之间，上夹持部与盖玻片110抵接，下夹持部与载玻片130抵接，使得盖玻片110、中间玻片120和载玻片130依次紧贴。
参照图3，盖玻片110呈横向设置的矩形板状，夹紧件200有两个，两个夹紧件200分别设于盖玻片110的左端、右端，夹紧盖玻片110、中间玻片120和载玻片130，则密封圈140保持与盖玻片110和载玻片130抵接，即使翻转挪动本技术，透明剂和荧光染料也不会溢出；而且两个夹紧件200分别设于盖玻片110的左端、右端能使本技术更牢固。
需要说明的是，夹紧件200的数量为至少一个即可，当为一个时附图中未示出，夹紧件200可置于两个第一通孔之间，同样能达到夹紧盖玻片110、中间玻片120和载玻片130的目的。