1,3-β-D-葡聚糖检验简介

1,3-β -D-葡聚糖结构

糖蛋白类

葡聚糖 几丁质

麦角固醇

B1， 3葡聚糖合成酶
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁 中 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成 分50%以上，是真菌细胞壁上 的特有成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄 糖残基骨架作为主链 以分支状1-6-β-D葡萄糖残 基作为侧链
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1,3-β -D-葡聚糖特性

内毒素的理化性质


耐热性：彻底灭活需250高温干烤一小时 可滤过性：能够穿透滤过膜 水溶性：LPS的O-特异性Ag呈亲水性 被吸附性：可被活性碳所吸附 易被强酸、强碱和强氧化剂破坏 不挥发性：加热时，不随水蒸气挥发
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人体内毒素的来源
开放性创伤 烧伤 注射药品 及溶液 外 骨折
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“G”试验缘何而来？
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检测原理（比色法）
旁路反应 β葡聚糖或LAL-RM 活化C因子 活化B因子 B因子 内毒素 C因子
G因子
活化G因子
凝固酶
凝胶法、比浊法
凝固蛋白（凝胶）
凝固酶原 显色法
凝固蛋白原
AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物） pNA（对硝基苯胺，黄色） 405nm测光度值
29 刘芳,吴彤,等. 中国实验血液学杂志 Journal of Experimental Hematology 2009
G试验对IF I诊断率的影响
•在所有162例患者中,若无G试验作为诊断标准,仅20例患者达到确诊+ 临床诊断真菌感染标准,占总病例数12.3%。 •若将G试验阳性作为微生物学标准,则有71例达确诊+临床诊断标准,占 总病例数的43.8%。 •在75例拟诊病例中,其中51例真菌培养阴性而G试验阳性的患者,均对 广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗病情好转,经过临床回顾性分析符合 IFI,故G试验使IFI诊断率提高了31.4%。
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临床医生关注的问题

检测的临床意义； 如何正确理解这些临床意义； 与微生物培养以及PCT的对比关系； BET的适应症和分段区间解释； BET测得值的影响因素有哪些？
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前言
1892年,科学家Richard在研 究霍乱弧菌的时候,发现革兰 阴性菌细胞壁外膜中有一种 不溶性成分,它能够引起人体 发热、休克、器官损害等病 理表现，因其毒性效应和性 质与外毒素有显著差异，就 用内毒素这一术语来描述该 物质。随后多年对革兰阴性 菌细胞壁外膜的超微结构技 术和生物分析技术，证实内 毒素是磷脂双分子层结构。

宿主因素 临床特征 病原学


真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据）

CSF隐球菌抗原阳性——确诊 GM-test, G-test——临床诊断
Clinical Infectious Diseases 2008; 46
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诊断IPFI的三个级别
宿主因素 确诊 临床诊断 拟诊 ＋ ＋ ＋ 临床特征 ＋ ＋ ＋ 微生物学 ＋ ＋ － 组织病理学 ＋ － －




对热极为稳定，高压121℃并不能使其灭活。在念珠菌 和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。 当真菌进入人体血液或深部组织后，经吞噬细胞的吞 噬、消化等处理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释 放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌 在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。 在浅部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来， 故其在体液中的量不增高。 可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡 氏肺孢子菌 不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等）
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小结


1,3-β-D-葡聚糖是侵袭性真菌感染早期 诊断、疗效观察、预后评估有价值的实 验诊断。 1,3-β-D-葡聚糖检验其敏感性优于GM 侵袭性真菌感染的诊断与治疗是一个复 杂过程，实验室与临床应密切联系，为 临床医生提供诸如显微镜检查、真菌培 养、血清学标志物等多方面信息。
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内毒素定量检测
真菌（1-3）-β-D-葡聚糖 与革兰氏阴性菌脂多糖检测
器械部 广东金羽医药发展有限公司
1
鲎
20世纪六十年代，人们 发现一种古老的海洋生物， 被称为“海洋活化石”的 鲎，它的血液与内毒素接 触后会发生特异性的凝集 反应，人们经过大量研究 和实验从它的血液中提取 出了用来检测内毒素的 “鲎试剂”。
2
感染
内
肝脏疾病
休克
大手术术后
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内毒素定量检测的临床意义
发热原因的快速辅助诊断（< 1小时）； 早期判断革兰阴性菌的感染情况； （Gˉ菌所致）脓毒症、MODS等重症疾患的早期诊断 帮助临床医生快速合理筛选适当的药物(抗生素)； 判断抗感染治疗效果及预后； 肠源性内毒素血症的预判及评估；
26 Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005

例2
儿童1,3-β-D-葡聚糖水平研究

120名儿童 7月—8岁 1,3-β-D-葡聚糖定量检测结果： 中位数 32 pg/ml 平均值 68±128 pg/ml
注：＊原发性者可无宿主因素，△肺组织、胸液、血液真菌培养阳性（除外肺孢子菌）
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（1,3） - β- D-葡聚糖检测
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真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 b1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 17 角鲨烯环氧化酶
鲎试剂的发明
1981年1月Jack Levin 和 Frederik B.Bang教 授在美国马塞诸塞州 Wools Hole海洋生物实 验室成功分离提取鲎血 细胞并研制成能够检测 细菌内毒素的鲎试剂， 开辟了人类认识和检测 内毒素的新纪元！
3
侵袭性真菌感染率上升↑
AIDS
4
医学和相关科学的进步
Bacteria Endotoxin Test
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检验科医生关注的问题



临床的需求情况； 检测的临床意义以及和微生物培养的对比关系； 临床临检的操作难易度； 仪器、试剂的价格和交易方式； 检测项目是否有收费标准； 检测方法学的科学性如何； 试剂的稳定性和重复性； 后续服务；
临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养 ≥2次分离到同种真菌 2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性
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侵袭性真菌感染的诊断标准 EORTC/MSG2008修订版
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革兰阴性菌脂多糖（LPS）电镜下结构示 意图
O–特异性抗原
核心多糖
脂质A
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内毒素的定义和危害

内毒素（Endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁外膜 的脂多糖（LPS）成分，是革兰阴性菌生长时释放 或死亡后裂解出来的毒性产物，其中起主要致病 作用的是非结合的游离脂多糖（FLPS）。
内毒素能够直接作用于人体，激活组织内的炎性 细胞和炎症因子，导致机体发热并产生全身性炎 症反应（SIRS），继而引起弥散性血管内凝血、 休克、多脏器功能衰竭等严重的病理生理症状， 危及生命，由于内毒素与革兰阴性菌关系密切， 所以内毒素血症在临床非常常见。 37
念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他

7
诊断方法



影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法：
传统的方法
Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable）
8
真菌病实验室诊断主要内容
准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学
12岁 348 pg/ml 2岁 374 pg/ml 14岁 491 pg/ml 13岁 754 pg/ml 14岁 947 pg/ml 94例(78%) <60 pg/ml 8例(7%) 60-79 pg/ml 18例(15%) >180pg/ml 高值 5例

结论
• 研究数据显示, 健康儿童的1,3-β-D-葡聚糖水平高于健康成人 . • 该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重, 1,3-β-D-葡聚糖在儿童 群体的正常值区间有待进一步研究 .
27 P.Brian Smith, Daniel K.Benjamin,Jr, etc. CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007
非免疫功能低下儿童1,3-β-D-葡聚糖水平
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例3
血浆1,3-β -D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性 真菌感染的诊断价值
本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例,其中化疗后患者85例,造血干细 胞移植后患者77例。 按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,所有病例中有 确定诊断2例,临床诊断18例,拟诊75例,排除诊断67例。 结果表明:以20 ng/m l为诊断界值,G试验的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和 阴性预测值(NPV)分别为75%、91%、72.4%和92.4%。
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的 高 危 期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁！
5
真菌感染的危险因素：






中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间
6
感染之前定殖
侵袭性真菌感染

条件致病性真菌
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镜检和培养方法

敏感性低
血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检 证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。


培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区 分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难
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非培养方法优点


快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检 测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效 评估
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非培养诊断的方法简介

真菌细胞壁成分

（1-3） - β- D-葡聚糖检测（G试验）

真菌抗原检查

半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原 （GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验）
D-阿拉伯糖醇

真菌特异的代谢产物


真菌 DNA 的检测
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1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值




早期诊断：侵袭性真菌感染增多且复杂，早期症状无 特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗 效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚 糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效。
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AC-Ile-Glu-Ala-Arg-OH
分析前注意事项


采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8℃最多存放48h 检测环境应保持清洁
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1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
以下情况可出现假阳性：


使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 链球菌血症； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食 物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也 可能造成假阳性。
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曲霉菌半乳甘露聚糖（GM）
Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay
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例1
1,3-β-D-葡聚糖与循环Байду номын сангаас乳甘露聚糖的检测比较： 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病


中性粒细胞减少症患者40例 （发展为曲霉菌病的高危人群） 该研究选择1,3-β-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM） 两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者 BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾 病, 但BG可早于GM升高. BG和GM联合检测用于曲霉菌病 的诊疗, 其特异性和阳性率均为100% . 结论： BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真 菌感染, 并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小 .