通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组测序微生物的发现单细胞
北大谢晓亮组又更新了他们的单细胞全基因组扩展方法
北大谢晓亮组又更新了他们的单细胞全基因组扩展方法最近看单细胞相关文献比较多，所以朋友们也开始帮我留意相关的进展了，其实单细胞本身只是一个测序技术，可以利用在不同的组学研究里面，目前就是转录组和基因组的测序应用单细胞技术比较多。
其中基因组的单细胞之前比较流行的是3种单细胞扩增技术MDA,MALBAC, DOP-PCR，全称分别如下：degenerate oligonucleotide–primedpolymerase chain reaction (DOP-PCR)Multiple-displacement amplification(MDA)Multiple annealing and looping-based amplification cycles (MALBAC)其中，MALBAC就是北大谢晓亮组开发的，今年(2017)的3月，他们又更新了他们的单细胞全基因组扩展方法，Transposon Insertion (LIANTI)主要就是设计了一个叫做LIANTI transposon的东西，本质上就是个转座子(含有Tn5)，可以随机插入到基因组的任何地方，但是它有一个小特点，就是自带T7 promoter，这样被LIANTI transposon插入的片段都可以被转录啦！Genomic DNA fragments tagged by T7 promoters are linearly amplified into thousands of copies of RNAs through in vitro transcription, followed by re- verse transcription and second-strand synthesis into double-stranded LIANTI amplicons ready for DNA library preparation.。
单细胞基因组学的方法与数据分析
单细胞基因组学的方法与数据分析【前言】随着生物技术的不断发展，单细胞基因组学在近年来受到了越来越多的关注。
单细胞基因组学是指对单个细胞进行基因组测序和分析的技术，可以揭示单个细胞的遗传变异和表达信息，具有极高的分辨率和敏感性。
对于生命科学的研究和医学的应用具有重要意义。
本文将介绍单细胞基因组学的方法和数据分析。
【单细胞基因组学的方法】单细胞基因组学主要分为以下几个步骤：1、单细胞分离单细胞分离是单细胞基因组学的前提，分离不同类型的单细胞可以得到不同的信息。
单细胞分离的方法有很多，包括手工分选、流式细胞术、微滴分离等。
其中，流式细胞术和微滴分离广泛应用于单细胞基因组测序。
2、单细胞DNA扩增单细胞基因组测序需要扩增单个细胞的DNA，由于单细胞的DNA量很少，因此需要采用各种DNA扩增技术。
目前广泛应用的扩增技术包括MDA（Multiple Displacement Amplification）、MALBAC（Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles）和DOP-PCR（Degenerate Oligonucleotide Primed - Polymerase Chain Reaction）等。
3、单细胞基因组测序单细胞基因组测序有短读和长读两种，其中短读测序适用于SNP、INDEL等小型变异的检测，而长读测序可以检测单个细胞的基因组结构、染色体拷贝数变异等大型变异。
目前高通量测序平台包括Illumina、Ion Torrent、PacBio等，不同平台的选择会影响到单细胞基因组测序的质量和可靠性。
4、数据预处理单细胞基因组测序数据的预处理包括过滤、去重、校正和拼接等步骤，旨在提高数据质量，并为后续的数据分析打好基础。
【单细胞基因组学的数据分析】单细胞基因组学的数据分析主要涉及以下几个方面：1、数据预处理单细胞基因组测序数据的质量控制和预处理包括过滤、去重、纠错和校正等步骤。
MDA 多重置换扩增技术ppt课件
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• SNPs和STRs基因型检测 • 基因拷贝数改变的检测 • DNA测序
总的来说，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖 率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA方法。MDA 已经广泛的应用于包括定量PCR、SNP基因型分 析、Southern印迹分析、染色体图谱中。
多重置换扩增（MDA）技术对单 细胞基因组测序技术研究进展
基因测序技术
• 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两 种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提出 的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法 这两种基本思想。
• 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测 序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、 成本贵，而且容易出错。
• 基于MDA的单细胞测序 • 主要研发人：深圳华大基因研究院 • 技术看点：将多重置换扩增(MDA)和测序技术相结合。 • 技术简介： • 本技术基于多重置换扩增(MDA)，并对该方法的扩增均一性、灵敏度、特异性等方面进行了全面
评估。这种将多重置换扩增和测序技术相结合的单细胞测序方法不仅具有更高的分辨率和基因组 覆盖度，而且具有更好的敏感性和特异性。该方法从单核苷酸水平上为各种复杂疾病和生物学过 程的研究开辟了新思路。
• 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极 大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。
• 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序 （SMS）
• 多重置换扩增(Multiple dilacement amplification，MDA)是1998年 由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链 置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA。 该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb 的 DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’ -5’外切酶活性， 错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以 保证扩增的高保真性。
单细胞PCR扩增技术原理解读
单细胞PCR扩增技术原理解读单细胞PCR扩增技术是现代生物学研究中一种重要的工具，它能够在微观水平上对单个细胞进行基因扩增，从而实现对个体细胞的分析和研究。
本文将对单细胞PCR扩增技术的原理进行解读，以帮助读者更好地理解这一先进技术的应用。
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术是一种能够在体外迅速合成特定DNA序列的方法，它以DNA的特性为基础，利用DNA聚合酶将DNA链中的核苷酸互补配对，并利用酶的催化活性在模板DNA上合成新的DNA 链。
PCR技术在生物学研究中得到广泛应用，但传统PCR方法要求有足够多的起始DNA模板，而对于单个细胞来说，其DNA含量极其有限，传统PCR方法难以对其进行扩增。
针对这一难题，单细胞PCR扩增技术应运而生。
其基本原理是在单细胞水平上进行分离和提取细胞DNA，然后利用特定的方法对DNA进行扩增，最后通过各种分析方法对扩增产物进行检测和分析。
单细胞PCR扩增技术的主要步骤包括单细胞的分离和提取、基因特异性扩增、扩增产物的检测与分析等。
首先，单细胞的分离和提取是实现单细胞PCR的关键步骤之一。
由于细胞在体内具有复杂的空间分布和相互作用，因此需要通过特定的方法将单个细胞从组织或液体中分离出来，并提取其DNA。
目前，常用的方法包括流式细胞仪、显微操纵、微流控技术等，这些方法能够对单细胞进行高效、准确的分离和提取，为后续的扩增工作打下基础。
接下来，基因特异性扩增是单细胞PCR的核心步骤。
在单细胞水平上进行PCR扩增需要注意到的问题是扩增反应的特异性，即确保扩增产物只来源于目标基因的DNA。
为了实现这一目的，可以使用特异性引物和特异性探针来增强PCR反应的特异性。
此外，由于单个细胞DNA的极低模板含量，需要使用高灵敏度和高效率的PCR反应体系来保证扩增效果。
近年来，多个新的PCR技术策略如多重断点PCR、多斑点扩增等也被应用于单细胞PCR扩增中，进一步提高了扩增的特异性和敏感性。
微生物领域的全基因组测序技术的应用研究
微生物领域的全基因组测序技术的应用研究随着全球经济、文化及科技的高速发展，微生物在环境污染、生物工业和医学等领域中扮演着越来越重要的角色。
全基因组测序技术是一项强大的工具，它能够对微生物领域中的细胞、菌群和宿主基因进行全面、精确的测定和分析。
在微生物学研究上，全基因组测序技术已经成为了应用前沿和科研热点，飞速发展并广泛应用。
一、全基因组测序技术的基本原理全基因组测序技术是指利用高通量的测序技术，将微生物细胞中的所有基因组DNA序列读入计算机，并利用生物信息学方法进行分析的过程。
全基因组测序技术的主要步骤包括：1.提取样本、制备库：在开始全基因组测序之前，需要从微生物样本中提取高质量的DNA，并对DNA进行处理，如：嵌入式PCR扩增、加入adapter 接头等，制备成合适的文库。
2.选种序列平台：目前市场上的测序平台主要有Illumina、ABI-SOLiD、Roche 454 Pyrosequencing等，每种平台都有其特点，例如：Illumina平台的测序速度快、准确性高、数据质量好，适用于小型基因组测序；Roche 454 Pyrosequencing适用于长DNA序列的测序；ABI-SOLiD平台的特点是适用于大规模基因组测序和重测序。
3.测序过程：在测序过程中，需要将制备好的文库中的DNA进行扩增、测序，生成大量序列读取输出，并在计算机中将DNA序列组装成为连续的序列。
4.序列分析：通过对读取序列的分析，包括DNA组装、基因预测、同源序列比对和注释等，最终得到完整的微生物基因组序列。
二、全基因组测序技术在微生物领域的应用全基因组测序技术可以对微生物种群和个体进行全面的基因组测定和分析，并揭示其生理和生态特性，深入研究微生物的分子历史和进化、代谢通路、毒性和耐药性等方面。
1.微生物生态学：在微生物生态学领域，全基因组测序技术被广泛应用于生物体内微生物菌群的分析和研究。
利用全基因组测序技术，可以对不同肠道菌群的基因组信息进行比对，揭示不同菌群间的区别和交互作用。
MDA 多重置换扩增技术
• 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极 大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。 • 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序 （SMS）
基因测序技术
• 基因测序需要一定量的DNA模板，所以测序前需对微生 物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可 培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难
MDA的应用
• SNPs和STRs基因型检测 • 基因拷贝数改变的检测 • DNA测序
总的来说，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖
率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA方法。MDA 已经广泛的应用于包括定量PCR、SNP基因型分
析、Southern印迹分析、染色体图谱中。
MDA 反应的产量 受起始DNA浓度的 影响较小，Dean等 通过对不同量的模 板DNA进行MDA 反应，发现终产量 较一致。这对于大 范围的遗传学应 用十分有利，因为 不需要测量或平衡 DNA浓度而直接进 行扩增，而能产生 同样量的DNA。
初始模板量分别为：0.1ng,1ng,10ng,100ng，产量均为40μg左右。
电化学和化学等多种检测系统以及与质谱等分析手段结合的很多检测手段已
经被用在微流控芯片中,对样品进行快速、准确和高通量分析。
微流控芯片的最大特点是在一个芯片上可以形成多功能集成体系和数目众多的复 合体系的微全分析系统。微型反应器是芯片实验室中常用的用于生物化学反 应的结构,如毛细管电泳、聚合酶链反应、酶反应和DNA 杂交反应的微型反应 器等。
方法可以高效地分离到单细胞，如跟FISH结合从环境样本中筛
选出特异的种类用于MDA扩增单细胞DNA实验。
细胞分选
MDA多重置换扩增技术
MDA的应用
• SNPs和STRs基因型检测 • 基因拷贝数改变的检测 • DNA测序
总的来说，MDA 由于其基因型的可靠性、高敏感性、高基因组覆盖 率以及较低的扩增偏向性等优点，使得该方法成为目前最有优势的 WGA方法。MDA 已经广泛的应用于包括定量PCR、SNP基因型分 析、Southern印迹分析、染色体图谱中。
• 基因测序需要一定量的DNA模板，所以测序前需对微生 物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可 培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难 度。
• 单细胞全基因组测序技术：通过一种叫做全基因组扩增 技术，不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个 细菌中的DNA获得作为模板所需的微克DNA 。
• 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强大的工具，它可用 于对从环境DNA的提取物（宏基因组序列）得到的多重有机体 通过鸟枪法测序来指导构建基因芯片。
多重置换扩增（MDA）的示意图：
首先随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接
下来Phi 29 DNA 聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，
生命科学中的新兴技术——单细胞测序技术介绍
生命科学中的新兴技术——单细胞测序技术介绍近年来，随着科学技术的不断进步，在生命科学的各个领域都涌现出了许多新兴技术。
其中，单细胞测序技术成为备受关注的技术之一。
本文将从单细胞测序技术的基本原理、发展历程、应用前景等方面进行介绍。
一、基本原理单细胞测序技术是一种能够对单个细胞进行基因测序和表达谱分析的技术。
它首先通过细胞分选技术将单个细胞从组织中分离出来，然后对细胞进行全基因组扩增，得到足够的DNA量用于测序。
同时，通过RNA测序技术对单个细胞进行转录本测序，获得单细胞的表达谱信息。
二、发展历程自从2009年首次报道了基于微流控技术的单细胞测序方法以来，单细胞测序技术就开始迅速发展。
在接下来的几年里，利用微流控技术和独特的芯片设计，单细胞测序技术开始有了商业化的应用。
同时，不同的细胞分选方法也不断涌现，如FACS、LMD等。
在2015年，人们已经可以利用单细胞测序技术完整地测定一个小鼠的全基因组和转录本谱系。
三、应用前景单细胞测序技术的开发和应用不仅可以深入理解细胞发育、疾病发生和进化等过程，而且也可作为临床治疗中个体化治疗的一种手段。
其中，对于肿瘤的治疗方面，单细胞测序技术能够挑选出肿瘤细胞中具有开发潜力的单个细胞，从而更好地实现“精准治疗”的目标。
此外，单细胞测序技术也可以应用于种群遗传学、发育生物学、免疫学等多个领域。
在此基础上，人们可以更好地理解复杂疾病的起源和发展，解决染色体异常和基因突变等问题。
总之，单细胞测序技术的发展和应用将引领生命科学的新一轮革命。
我们相信，在未来的某一天，这项技术会成为医疗保健和研究领域中不可缺少的一部分。
单细胞测序技术及其在基因组学研究中的应用
单细胞测序技术及其在基因组学研究中的应用基因组学是研究生物体的全部基因组构成和基因功能调控的分支学科。
近年来，单细胞测序技术被广泛应用于基因组学研究中，能够解决常规测序技术所无法识别的罕见细胞亚群和个体差异等问题。
本文将介绍单细胞测序技术的原理和应用，并分析其在基因组学研究中的优势。
一、单细胞测序技术的原理单细胞测序技术是通过分离单个细胞，并在保证细胞完整性的前提下对其进行基因组、转录组或表观基因组测序。
常用的单细胞测序技术主要包括单细胞PCR和单细胞测序法两种。
1. 单细胞PCR技术单细胞PCR技术是通过微操纵系统将单个细胞的DNA或RNA扩增到数百万倍，然后对扩增产物进行常规的基因组测序或转录组测序，从而获得单个细胞的遗传信息。
该技术优点在于从单个细胞中可以扩增出大量的DNA或RNA，但存在扩增偏差和错配的问题。
2. 单细胞测序法单细胞测序法主要包括单细胞WGA、单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq等多种方法。
其中，单细胞WGA技术通过DNA扩增的方式获得单细胞基因组全景图谱，单细胞RNA-seq技术则是通过RNA逆转录将单个细胞中的RNA转成cDNA，再进行测序。
单细胞ATAC-seq技术可以测定基因组上的开放染色质区域，从而确定单个细胞中的表观基因组测序。
二、单细胞测序技术在基因组学研究中的应用单细胞测序技术已经在多种生命科学领域得到广泛应用。
下面介绍一些常见的应用：1. 发现细胞亚群单细胞测序技术可以挖掘细胞种群中的不同亚群，例如癌细胞中的肿瘤干细胞亚群等。
这种分析有助于深入理解细胞生物学过程，并且有助于开发个性化治疗策略。
2. 探索细胞发育和分化单细胞测序可以揭示不同发育阶段的胚胎干细胞的分化过程，或者在特定治疗中的干细胞的不同反应，从而得到单个细胞生命过程中的遗传图谱，促进对生命的认识。
3. 发现个体差异单细胞测序技术可以准确检测出细胞水平的遗传变异，例如突变和重排等，从而确定细胞间的个体差异。
微生物学中的单细胞测序
微生物学中的单细胞测序近年来，单细胞测序技术在微生物学和生物学领域中得到广泛应用。
单细胞测序技术可以将复杂的微生物群落中的各个单细胞进行分离、扩增和测序，从而了解单个细胞的形态、组成、活动以及在群落中的相互作用等方面的信息。
本文将从单细胞测序技术的原理、应用于微生物学中以及未来发展方向等方面进行讨论。
一、单细胞测序技术原理单细胞测序技术是一种能够微尺度下对单个细胞进行分析测序的技术。
其核心是将一个个单细胞分离出来，使用某种方式将其细胞内DNA扩增，如PCR或MDA（多位移扩增）等方法，然后对扩增的DNA进行高通量测序，最终获得单个细胞的基因组序列信息。
单细胞测序技术可以大幅提升微生物学和生物学领域中对单个细胞的研究，也因此被广泛应用于研究微生物群落和微生物群体中的个体差异等问题。
二、单细胞测序技术在微生物学中的应用单细胞测序技术在微生物学中的应用非常广泛。
例如，在人类肠道中存在着上千种微生物，其中大部分是非培养菌，但是单细胞测序技术可以对各个细胞进行鉴定、分类和功能分析。
此外，单细胞测序技术也可以应用于肿瘤细胞和癌细胞的研究。
研究证明，不同癌细胞之间存在着明显的基因组差异，单细胞测序技术可以将不同肿瘤细胞分离出来进行测序，从而更深入地了解癌细胞的遗传特性和发展过程。
三、未来发展方向目前，单细胞测序技术已经成为了微生物学和生物学领域中的重要工具，但是仍然存在着需要不断完善的方面。
例如，单细胞测序技术在某些情况下可能出现代谢偏差，需要进一步了解其机制。
此外，单细胞测序技术还需要进一步提高其精度和效率，以便更好地应对复杂微生物群落的研究。
未来，预计单细胞测序技术将更广泛地应用于研究微生物学、癌症和分子生物学等领域，推动生命科学研究的进一步发展。
总之，单细胞测序技术在微生物学中的应用极其广泛，不仅可以用于分析微生物群落，还可以应用于肿瘤细胞和癌细胞的研究，并且未来还有着很大的发展空间。
对于微生物学和生物学领域的研究来说，单细胞测序技术无疑是一种重要的工具。
单细胞转录组测序技术原理及其应用
单细胞转录组测序技术原理及其应用随着基因组学技术的飞速发展，单细胞转录组测序（Single-cell RNA-Seq）技术逐渐成熟，能够对单个细胞的基因表达情况进行高通量的测定，为生命科学研究提供了前所未有的工具和机会。
本文将介绍单细胞转录组测序技术的原理及其应用。
单细胞转录组测序技术主要包括以下几个步骤：1. 单细胞的分离单细胞转录组测序技术是指对单个细胞进行RNA测序的技术，因此需要将细胞进行简单的分离。
可使用离心、离子交换、贴壁等方式进行细胞的分离。
不同的细胞类型在细胞膜蛋白、表观遗传标记等方面各不相同，因此需要针对不同的细胞类型使用不同的筛选方法，如基于荧光分选或微流控芯片分选等。
单细胞的捕获是单细胞转录组测序的关键步骤之一，其中最常用的方法是微滴分离法（Drop-seq）。
整个过程大致分为三个步骤：① 在一个含有芯片或微型装置的系统中，将单个细胞和一定量的对应量的RNA捕获位点混合在一起。
② 加入GEM转录本测序试剂盒（GEMs），将单细胞、珠子和反应试剂在液滴中混合，形成油-水-珠（Emulsion）结构。
GEMs主要是MDA（多位移扩增）试剂盒和CIS（化学切割等离子）试剂盒。
③ 通过破裂珠子，提取RNA，然后去除DNA和其他杂质，制备RNA测序文库。
3. 测序将单细胞RNA测序文库经过高通量测序技术进行测序，生成大量的读取长度通常为50 bp的测序数据。
4. 数据处理对测序数据进行拼接、去除低质量序列、去除重复序列等质量控制过程，然后将拼接后的数据与参考基因组注释文件进行比对，确定每个基因的表达情况。
最终，可以获得每个单细胞中每个基因的表达谱信息。
1. 发现新的细胞类型和细胞亚群单细胞转录组测序技术可以帮助研究人员发现新的细胞类型和细胞亚群，尤其是那些在组织和器官中难以鉴定的稀有细胞类型。
通过对单细胞转录组数据进行聚类分析，可以将细胞按照其基因表达谱的相似性进行分类。
2. 了解细胞发育和分化过程3. 鉴定不同疾病状态下的细胞分布和功能变化单细胞测序技术还可以帮助研究人员鉴定不同疾病状态下的细胞分布和功能变化。
mda扩增原理
mda扩增原理MDA（Multiple Displacement Amplification）是一种强大的分子生物学技术，主要用于对微量或单细胞水平的DNA进行高效扩增。
该技术基于phi29 DNA聚合酶的独特性质，能够在保持高保真度的同时，实现大量DNA的非均相扩增。
一、MDA扩增的基本原理MDA扩增主要依赖于phi29 DNA聚合酶的高度过程ive和高保真特性。
phi29 DNA聚合酶在复制DNA时，能在3'端生成非常长且连续的引物，这种连续合成的能力使得它可以在一个模板上进行连续且高效的滚动循环扩增，从而极大地提高了扩增效率和产物长度。
在MDA反应体系中，首先将微量DNA与随机引物、dNTPs （脱氧核苷三磷酸）、缓冲液以及phi29 DNA聚合酶混合。
当phi29 DNA聚合酶结合到DNA模板上后，便开始其特有的链置换式复制过程，不断生成新的双链DNA，并逐步取代原有的单链DNA模板，由此实现了DNA序列的指数级扩增。
二、MDA扩增的特点1. **高扩增效率**：由于phi29 DNA聚合酶具有很高的过程ivity和稳定性，MDA能够实现极高的扩增倍数，通常可以达到几百万至几十亿倍，对于微量或单细胞DNA样本尤其适用。
2. **产物长度较长**：相较于传统的PCR扩增方法，MDA 产生的DNA片段更长，有利于获得完整的基因组信息。
3. **较高的保真性**：phi29 DNA聚合酶的错误率远低于热稳定DNA聚合酶，因此MDA技术的扩增误差相对较低。
然而，尽管MDA具有以上优势，但需要注意的是，由于MDA 是非均相扩增，可能会导致某些区域过度扩增而其他区域扩增不足，即所谓的“扩增偏好性”问题，这可能会影响最终的数据分析结果。
三、MDA扩增的应用MDA技术广泛应用于微生物学、遗传学、肿瘤研究、古生物学等领域，特别是在基因组学研究中的单细胞全基因组测序、稀有突变检测等方面发挥了重要作用。
单细胞测序在血液肿瘤疾病中的应用进展
综述评论世界临床药物WORLD CLINICAL DRUGS Vol.42 NO.3•综述•单细胞测序在血液肿瘤疾病中的应用进展苏娜润，翟晓文*(国家儿童医学中心，复旦大学附属儿科医院血液科，上海201102)摘要：单细胞测序（single cell sequencing，S C S)技术指在单个细胞水平上，对基因组或转录组进行扩增并测序的技术，较 传统测序方法具有发现细胞异质性及使用生物材料较少等优势。
近年来，随着测序成本逐渐降低，SCS技术在科研中越来越 受到关注，特别是在血液肿瘤疾病诊治方面。
血液肿瘤疾病具有高度异质性，而SCS技术有助于揭示其发病及克隆演变机制。
本文就近几年SCS技术在血液肿瘤疾病中的应用进展作一综述，旨在为血液肿瘤疾病的诊断与靶向治疗提供临床指导。
关键词：单细胞测序；血液肿瘤；细胞异质性中图分类号：R733 文献标志码： A 文章编号：1672-9188(2021)03-0208-05DOI：10.13683/j.wph.2021.03.011Application progress of single cell sequencing in blood tumor diseasesSU Narun, ZHAI Xiaowen*{Department o f H ematology and Oncology, National Center f or Children's Health, Children's Hospital ofFudan University, Shanghai 201102, China)Abstract: Single cell sequencing (SCS) refers to the amplification and sequencing of genome or transcriptome at the level of single cell. Compared with traditional sequencing methods, SCS has the advantages of discovering the heterogeneity between cells and using less biomaterials. In recent years, with the cost of sequencing gradually reduced, SCS has attracted more and more attention in scientific research, especially in the diagnosis and treatment of blood tumor diseases. Blood tumor diseases are highly heterogeneous, and SCS is helpful to reveal the pathogenesis and clonal evolution mechanism. This paper reviewed the application of SCS in hematological tumor diseases in recent years, aiming to provide clinical guidance for the diagnosis and targeted therapy of hematological tumor diseases.Key words: single cell sequencing; blood tumor; inter-cellular heterogeneity单细胞测序（single cell sequencing,SCS)指在 单个细胞水平上，对基因组或转录组进行扩增并测 序，以检测单核苷酸位点变异、基因拷贝数变异、单细胞基因组结构变异、基因表达水平、基因融合、单细胞转录组的选择性剪切及单细胞表观基因组的 D N A甲基化状态等的技术。
single cell
现 实 X
106
=目标
单细胞扩增须解决矛盾
1 线 性 扩 增
一般的PCR存在扩增偏向性，这种较小的偏向性
还会通过指数扩增放大，会导致严重的覆盖不均一
2 全基因组覆盖
常规的建库方法，因为补平、加A、接头连接效率的问题 起始DNA中有很大一部分会被浪费，没有形成有效分子3 高 扩 增 效 率
单细胞中的每个基因位置理论上都好的扩增效率
多重退火和成环循环扩增技术 Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles
不同于以往的非线性或指数型扩增方法，MALBAC利用特殊引物，
使得扩增子的结尾互补而成环，很大程度上防止了DNA的指数性扩增
Genome wide detection of single nucleotide and copy number variatins of a single human cell. Science, 2012
应 用 实 例
胚胎植入前遗传诊断
男方为单基因显性遗传病患者
后代无论男女都有50%概率患同样的疾病
绘制单精子基因图谱
同源染色体重组是产生生物多样性的重要机制
兄弟姐妹之间的差异即由这些重组决定
采用MALBAC 将胚胎细胞的DNA均匀扩增上百万倍 通过低深度二代测序和生物信息学分析 检测基因突变和染色体异常
单细胞测序
2011年 Nature Methods
将单细胞测序列为
年度值得期待的技术之一
测量基因表达水平更加精确
能检测到微量的
基因表达或罕见非编码RNA
2013年 Science
将单细胞测序列为
年度最值得关注的六大领域榜首
通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组测序微生物的发现单细胞
始模板DNA链的延长，然后被置换并对一个不同的模板延 长，其结果是形成嵌合体。完整的MDA反应物和S1核酸 酶处理后可以消除DNA的单链形式，这可使使嵌合体达到 80％的减少。 对嵌合体形成酶路径的了解目前正被用来减少嵌合体的发 生。
应用：
通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组 测序
微生物的发现 单细胞测序和宏基因组学方法的综合 近来对MDA方法的改进
MDA反应利用随机引物和独特的Phi 29 DNA 聚 合酶(该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连 续扩增100kb的DNA模板而不从模板上解离。同 时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的 高保真性) 反应扩增DNA。一个链置换反应使从 每个模板得到的多个副本作为聚合酶合成新链 ，
正确的将序列结合到当前的数以千计的个体 物种，一直是极为困难的。单细胞序列为这个瓶 颈提供一个解决方案。它们可以通过对鸟枪测序 结果进行筛选找到那些来自同一生物体的基因 。
近来对MDA 方法的改进：
减少MDA的反应体积：通过减少污染的扩增DNA和非特 异性的合成，如引物二聚体，本质上就是通过消除不必要 的反另外，如果在MDA反应前可以对细胞汇集，基因组的覆盖 范围能够得以改善。在细胞分选技术中通过荧光原位杂交 （ FISH ）探针或独特的自体荧光，通过在显微操作中的 形态特征观察，如果一个单一的细胞株因为局部富集生长
或一些微环境作用（例如感染细菌或作为宿主的共生）占 主导地位，这使得对相同细胞株的细胞进行识别成为可能。
同时取代先前延长的链。与MDA相比，老的基于 随机或简并引物PCR来进行全基因组扩增的方法， MDA创造了更大的扩增偏好性。它们还可以产生 很短的扩增产物。MDA扩增平均12 kb的长度和 范围大于100 kb的序列，使它们更适合用于克隆 和DNA测序。
单细胞测序技术在微生物学中的应用
单细胞测序技术在微生物学中的应用随着科学技术的不断发展，单细胞测序技术作为一种极为重要的技术，其在微生物学领域中也无疑将起到越来越重要的作用。
本文将从该技术的基本原理、技术的应用以及未来发展方向等方面进行论述。
一、单细胞测序技术的基本原理单细胞测序技术是一种针对遗传物质单细胞分析的技术，它的基本原理是将单个细胞的DNA和RNA酶消化后扩增，对其进行测序。
相较于传统的基因组学研究，单细胞测序技术在研究细胞的异质性及功能差异等方面具有更高的精度。
单细胞测序技术可以分为两大类，分别是单细胞转录组测序和单细胞基因组测序。
单细胞转录组测序即对单细胞RNA进行测序，可以了解单个细胞基因表达的状态，从而得到深入了解不同类型的细胞和组织的基因表达模式的能力。
单细胞基因组测序则可以揭示个体细胞的遗传变异信息，如染色体异常、基因缺失、单核苷酸多态性等。
二、单细胞测序技术在微生物学中的应用微生物学是研究微生物结构、生命周期、代谢、分子机制及其在生态和疾病中的作用等的科学领域。
单细胞测序技术在微生物学领域中的应用，主要针对微生物群体内的个体差异进行研究。
以下是其在微生物学领域的一些具体应用：1. 研究微生物的多样性和功能：单细胞测序技术可以在个体水平上了解微生物的基因表达状态及其差异，进而拓宽人们对微生物种类的认知。
2. 发现新的微生物种类：在对采样样本中的微生物进行单细胞测序之后，可以通过和数据库比对寻找相似序列，进一步确定其为新物种或新菌株，并对其进行鉴定和分类。
3. 研究微生物群落结构：单细胞测序技术可以分析微生物群落内不同种类细胞数量的比例，解析微生物群落的结构和稳定性。
4. 研究微生物的生态功能：单细胞测序技术可以对微生物间的相互作用和信号传递进行分析，了解不同类型的微生物之间的互动方式。
三、未来的技术发展虽然单细胞测序技术在最近几年的发展中有了极大的进步，但它仍面临着许多的挑战。
未来的技术发展方向主要包括以下几个方面：1. 提高技术的精度和稳定性：通过改进实验步骤，增加阳性对照，优化扩增条件和提高测序的深度，从而提高技术的精度和稳定性。
科研NatureCommunic...
科研NatureCommunic...编译：朱雯君，编辑：小菌菌、江舜尧。
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导读肠道菌群的区域化被认为对系统功能很重要，但对肠道生态系统的空间组织程度仍知之甚少。
本文使用激光捕获显微解剖沿纵向和横向轴描绘小鼠结肠微生物群。
发现了肠道菌群的精细空间结构，沿结肠长度在组成和多样性上呈梯度变化。
纤维的缺失降低了微生物群落的多样性，破坏了微生物群落组成的纵向和横向梯度。
与粘膜相邻的群落和管腔的群落都受到膳食纤维缺乏的影响，随着典型的远端结肠微生物群的消失和邻近粘膜群落的减少，黏液层也随之消失。
这些结果表明，饮食不仅对肠道菌群的组成有全局性的影响，而且对肠道菌群的组成也有局部性的影响，依位置差异可能会造成功能和恢复力的不同。
论文ID原名：A fiber-deprived diet disturbs the fine-scale spatial architecture of the murine colon microbiome译名：纤维缺乏的饮食扰乱了小鼠结肠微生物组的精细空间结构期刊：Nature CommunicationsIF：11.878发表时间：2019.09通讯作者：巴里·大卫作者单位：奥地利维也纳大学实验设计1 动物实验将九只按标准饮食（R / MH Ssniff，Soest，德国）饲养的野生型C57BL / 6小鼠分为三组（每组n = 3），并在各组饮食中维持1周：富含多糖和纤维组（CON）（含纤维素和淀粉）；缺乏纤维的饮食组（FD）（不含纤维素）；缺乏多糖和纤维的饮食组（PFD）（含蔗糖但不含纤维素或淀粉）（Ssniff，Soest，德国）。
FD和PFD饮食组是等热量的（补充图5）。
为了验证选定的结果，在单独的饮食转移实验（7天）中包括了六只小鼠（三只FD和三只PFD）。
将小鼠共同饲养在可自由获取食物和水的受控环境中（12h / 12h日/夜循环）。
第1、4和7天收集粪便颗粒并速冻在液体氮中，新饮食模式的前一天作为第一天，即基线。
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FISH探针被用来通过细胞流式细胞仪分离候选细 胞。
细胞通过微流控芯片分离，并在1个60 nl的体系内 进行MDA。此方法使用微流控渠道以达到细胞分 选，以及MDA的小体积反应能达到单拷贝DNA模 板的更好目标。
FISH技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本 原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与 所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即 可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种 核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告
分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经 荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定 位分析。
MDA反应示意图
通过利用扩增DNA为模板使对单个细胞的DNA进行测序 成为可能。多重置换扩增（ MDA ）可以将一个细菌中很少 的几飞克的DNA放大到可用于测序的微克的DNA。
MDA作为环境研究方法的一个巨大突破，能够用来引 导并可能成为微生物遗传学、生态学及传染性疾病研究的一 种新的研究策略。先前的新发现的微生物只能通过培养菌株 成长到足够的数量，以提供足够的DNA 模板才能测序。然 而，只有不到1％的微生物已被成功培养。对自然环境的深 入研究将出现大量新的不能培养的生物体，它们成为通过传 统的基因组研究方法研究的重大障碍。在这项工作中，单细 胞测序的出现开辟了一个新的领域，可以直接从单个细胞获 取DNA模板而不需要培养方法的改进。
应用：
通过MDA进行单细胞的DNA扩增和基因组 测序
微生物的发现 单细胞测序和宏基因组学方法的综合 近来对MDA方法的改进
MDA反应利用随机引物和独特的Phi 29 DNA 聚 合酶(该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连 续扩增100kb的DNA模板而不从模板上解离。同 时这种酶具有3’—5’外切酶活性，可以保证扩增的 高保真性) 反应扩增DNA。一个链置换反应使从 每个模板得到的多个副本作为聚合酶合成新链 ，
Single-cell genomic sequencing using Multiple Displacement Amplification
使用多重置换扩增（MDA）技术 对单细以通过对多重置换扩增 反应（ MDA）得到的扩增DNA进行测序。在 细菌中几个飞克 (10-15g)的DNA能扩增得到微 克(10-6g)的高分DNA也可直接作为模板供焦磷酸测序。 单个细胞间基因序列的联系也是一个功能强 大的工具，它可用于对从环境DNA的提取物 （宏基因组序列）得到的多重有机体通过鸟 枪法测序来指导构建基因芯片。
从单一的未培养细胞测序首先是通 过对用显微操作分离的取自环境的土
壤细菌进行了分析。显微操作高度确
保了只有一个细胞被选择，也提供了
在分离过程中观察和拍照的形态学信 息。使用单细胞MDAs产物作为模板， 对16S，是通过使用FISH的特异探针来 选取单个细胞。
即使单一细胞的部分序列也可以大大的推动 生物学研究：
一个单细胞测序的序列草图估计可以覆盖 Beggiatoa spp基因组的70％，这种细菌为一 种至今尚未成功培养的海洋细菌。
预测基因被用来确定硫氧化，硝呼吸和氧呼 吸及CO2固定的一些关键酶。它还应当可能 用于克隆新基另外，如果在MDA反应前可以对细胞汇集，基因组的覆盖 范围能够得以改善。在细胞分选技术中通过荧光原位杂交 （ FISH ）探针或独特的自体荧光，通过在显微操作中的 形态特征观察，如果一个单一的细胞株因为局部富集生长
或一些微环境作用（例如感染细菌或作为宿主的共生）占 主导地位，这使得对相同细胞株的细胞进行识别成为可能。
同时取代先前延长的链。与MDA相比，老的基于 随机或简并引物PCR来进行全基因组扩增的方法， MDA创造了更大的扩增偏好性。它们还可以产生 很短的扩增产物。MDA扩增平均12 kb的长度和 范围大于100 kb的序列，使它们更适合用于克隆 和DNA测序。
来自相同细胞株的几个不同的细胞的MDA产物也可 以被用来完成基因组测序。扩增的偏好性在一次 MDA反应到下面的反应中相当随机的发生在不同的 序列。同样，一次MDA反应中序列的缺失也会发生 在其它的细胞中。为确认MDAs的选择能从相同细 胞株真实获得，PCR筛选和循环测序可以对MDA反 应产物的16S rRNA基因和其他标记基因进行。从同 样的细胞类型产生的单细胞MDA产物的所产生的汇 集物可以提供较全面的甚至代表所有的序列，也是
背景知识
MDA是最近几年发展起来的一种全基因组扩 增技术,它采用具有高度延伸活性的DNA聚合 酶和耐核酸外切酶的随机引物在等温条件下 对基因组进行扩增的方法,这种方法是以链置 换为基础,最初被用于扩增巨大的环状DNA如 质粒和噬菌体DNA,现在也被用于线型DNA的 扩增,它能对全基因组进行高保真的均匀扩增, 扩增出10～100 kb大小的片段,能提供大量均 一完整的全基因组序列。
最近的工作表明了单细胞测序能有利的揭示 环境和生理研究甚至从局部草案基因组中预测基 因的存在。基因组数据还可以在这个过程中协助 作用，最终发展为新的培养方法，这仍然是一个 需要充分认识生物有机体的极为重要的目标。代 谢途径的鉴定可以预测培养基和培养条件的设计。 基于MDA的单细胞基因组学的另一个好处是它很 容易自动化，并可以与高通量细胞筛选大量的微 生物相结合。MDA的反应物经PCR筛选信号序列， 如16 S rRNA和recA基因，可以用来确定目的基 因，用于其它的分析。