发酵液预处理和固液分离

1.1 主要杂质预处理
高价无机离子 ➢ 杂质危害
在采用离子交换法提炼时，影响树脂的交换容量
➢ 去除方法
• Ca2+ – 草酸 • Mg2+ – 三聚磷酸钠 • Fe3+ – 普鲁士蓝
1.1 主要杂质预处理
蛋白质 ➢ 杂质危害
• 离子交换法提炼时，会降低吸附 能力
• 萃取时，易产生乳化 • 过滤或膜过滤时，使滤速下降，
此外，发酵后期加消沫油或剩余大量末用完的培养基都会使过滤困难。
2.1 影响固液分离的因素
3. 发酵时间
• 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大 • 在菌丝自溶前必须放罐，因为细胞自溶后的分解产物很难过
滤
有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响 发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造 成成品质量降低。
毒等分子水平和微粒的分 Templates, Professional quality templates in a couple of clicks away!
离
工业常速离心机
沉降式
管式
碟式
• 发酵液的主 要分离方式 • 悬浮液处理 量18m3/h，分 离因数最大 1800
过滤式
连续式
批处理式
• 大于10μm晶 体的主要分离 方式 • 适用于连续 和批处理
螺旋式
源自文库卧式
• 含固量较多 发酵液的主要 分离方式 • 操作温度可 达300度 • 胰岛素，细 胞色素，胰酶
发酵液的预处理
1 发酵液的预处理
➢主要杂质预处理 ➢凝聚与絮凝
2 发酵液固液分离
➢影响固液分离的因素 ➢过滤 ➢固液分离器
3 全发酵液提取
3 全发酵液提取
扩张床技术
两水相技术
膜技术
• 相当于过滤、浓缩和吸附的综合效果 • 连接的配基容量需求大 • 膜污染问题严重
➢ 影响颗粒沉降速度的因素 • 颗粒直径 • 密度 • 介质粘度
离心机
常速离心机
• 用于工业、实验室规模 • 收集细胞、菌体、培养基 残渣等较大固体颗粒
根据不同 离心因素
高速和超速离 心机大多用于 冷冻设备
高速离S心TY机LE DESIGN
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动物细胞 40μm
➢ 真菌 菌丝粗大，容易过滤，不需特殊处理。滤渣呈紧密饼状 物，易从滤布上刮下，可采用鼓式真空过滤机过滤。
➢ 放线菌 菌丝细而分枝，交织成网络状，还含有很多多糖类物 质，粘性强，重量比阻r B值高，过滤困难，一般需经预处理 ，以凝固蛋白质等胶体。
真菌细胞 10μm
酵母细胞 10μm
• 固液分离和萃取在同时完成 • 需要选择到合适的两水相体系和操作条件
• 固体颗粒除去和目标蛋白纯化合并于一步完成 • 减少操作步骤，缩短时间，降低成本，提高收率
思考题
1. 发酵液为何需要预处理？处理方法有哪些？ 2. 如何使用助滤剂? 3. 凝集与絮凝过程有何区别？如何将两者结合使用？ 4. 错流微滤与传统过滤相比有何优点？
2.3.1 板框压滤机
➢ 自动板框过滤机：
是一种较新型的压滤设备，板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布 的清洗等操作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减 轻了劳动强度。
板框操作实例-进料
板框操作实例-卸料
2.3.2 鼓式真空过滤机
鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较 小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。而对菌体较细或粘稠的发酵 液不太适用。
发酵液的预处理
发酵液的预处理
1 发酵液的预处理 ➢主要杂质预处理 ➢凝聚与絮凝
2 发酵液固液分离 ➢影响固液分离的因素 ➢过滤 ➢固液分离器
3 全发酵液提取
1 发酵液的预处理
无论是胞外产物还是胞内产物，除去培养液和发酵液中固体悬浮物的 方法主要为过滤和离心。这两种方法受介质影响甚大：细胞或菌体的 大小、介质粘度。
凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒 子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤。
1.2.1 凝聚
➢ 机理
• 中和粒子表面电荷，消除双电层结构
➢ 斯特恩模型
1.2.1 凝聚
➢ ζ电位
• 与扩散层厚度和电动电荷密度成正比
• 对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层厚度， 促使ζ电位迅速降低
2 发酵液固液分离 ➢影响固液分离的因素 ➢过滤 ➢固液分离器
3 全发酵液提取
2 发酵液固液分离
➢ 目的 • 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相 • 收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮物
➢ 方法 • 离心 • 过滤
2.1 影响固液分离的因素
1. 菌种
植物细胞 100μm
• 粒子越小，难度越大，费用越高 • 采用预处理方法增大粒径
2.2 过滤
➢ 过滤特性指标 • 滤饼的质量比阻rB • 表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关
➢ 过滤操作方式分类 • 恒压过滤-压缩空气或真空作为推动力 • 恒速过滤-定容泵输送料液 • 变速变压过滤-离心泵
➢ 滤饼的质量比阻可衡量各种不同发酵液过滤难易程度 • 菌丝粗大，比阻小，易过滤 • 菌丝细小，比阻大，需预处理
• 万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速 度加快
2.2.2 过滤方式
➢ 直流过滤（传统过滤） • 滤浆垂直于过滤介质的表面流动，固体被介质所截留，逐渐形 成滤饼。随着过滤的持续进行和滤饼层的增厚，过滤速度明显 减小，直至滤液停止流出。
➢ 错流过滤 • 滤浆一边平行于过滤介质流动，一边受到过滤。滤液的流速远 低于滤浆的流速，二者的流动方向是相互垂直交错的。滤浆的 快速流动对堆积在介质上的颗粒起到了剪切扫流的作用，从而 抑制了饼层的增厚，因此有可能实现恒速的高过滤速度。
• 当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的 结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来
Stern layer
Diffuse layer
pH change
1.2.1 凝聚
➢ 凝聚价
• 电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示 • 使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度(毫摩尔／升)，称
为凝聚价或凝聚值 • 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序
膜受到污染。 ➢ 去除方法
• 加热 • 等电点沉淀法 • 有机溶剂 • 蛋白沉淀剂
不稳加定热蛋白 颗调 蛋粒节 白相等 质互电 失聚点 去 水集化而膜沉保淀护
不调 加聚溶 调稳节 热集剂 节定等 或沉脱 电蛋电 有淀水 荷白点 机
应用举例
➢ 透明质酸发酵液
三氯乙酸调pH至4.5，静置1h后回调pH至6.0，静置5h。 经硅藻土过滤后的蛋白质除去率提高90%。而加热会降 低透明质酸分子量，不推荐。
一种较好的解决办法是，过滤前在转鼓面上预铺一层助滤剂，操作时，用 一把缓慢向鼓面移动的刮刀将滤饼连同极薄的一层助滤剂一起刮去，这样
使过滤面积不断更新，以维持正常的过滤速度。
鼓式真空过滤机在葡萄酒制作流程中的介绍
2.4 离心分离
➢ 离心分离 • 借助于离心机旋转锁产生的离心力的作用，促使不 同大小，不同密度的粒子分离的技术。 • 沉降速度
2.2.3 错流过滤
➢ 影响错流过滤的主要因素 • 过滤的液体 • 过滤介质 • 滤室的几何形状 • 反冲洗
➢ 震动膜过滤VS错流过滤 (点击)
2.3 固液分离器
不同性状的发酵液应选择不同的固—液分离设备。 具有工业意义的分离器为两大类：压力和真空
常用分离设备： ➢ 板框压滤机 ➢ 鼓式真空过滤机 ➢ 离心沉降分离机
2.3.1 板框压滤机
➢ 优点：过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进
行调整，并能耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵 液适应性强，同时还具有结构简单，价格低，动力消托少等 优点。
➢ 缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件
差，非生产的辅助时间长(包括解框、卸饼、洗滤饼，洗滤 布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。
细菌细胞 2μm
细胞碎片 0.4μm
➢ 细菌 菌体更细小，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预处理 发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。
2.1 影响固液分离的因素
2. 培养基 • 培养基的组成对过滤速度影响也很大。 • 黄豆粉、花生饼作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难。
➢ 举例 • 在链霉素发酵液的培养基中，加以黄豆粉代替玉米浆，则比阻值增大 0.6—1.0倍。 • 在青霉素发酵的培养基中，加入酵母蛋白，rB值也提高很多。
• 生物大分子盐析沉淀物等 Templates, Professional quality templates in a couple of clicks away! 较小固体颗粒
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IMPACT
•Im生me物nse大visu分al ap子pea、l – P细rem胞ade器Pow、erP病oint
1.2.3 常用的凝聚剂与絮凝剂
➢ 凝聚剂
• 铝盐，铁盐，钙盐，锌盐
➢ 絮凝剂
• 阳离子型：阳离子聚丙烯酰胺，聚丙烯酸二烷基胺乙酯 ，聚二烯丙基四胺盐。
• 阴离子型：聚丙烯酸钠，聚苯乙烯磺酸，木质素磺酸盐 • 非离子型：聚氧乙烯 • 无机高分子类：聚合铝盐，聚合铁盐 • 天然类：壳聚糖，葡聚糖 • 微生物类
1.2.4 絮凝剂应用优化
➢ 混凝 • 非离子型和阴离子型絮凝剂需与凝聚剂搭配使用
➢ 影响因素 • 凝聚剂用量 • 最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物覆盖时所用的絮凝剂量 • 分子量 • 长链能有助于架桥效果 • 溶液pH • 电离度增大，架桥作用明显 • 搅拌速度和时间
发酵液的预处理
1 发酵液的预处理 ➢主要杂质预处理 ➢凝聚与絮凝
➢ 预处理的目的 • 改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固 液分离器的效率 • 尽可能使物质转入便于后续处理的某一相中 • 去除发酵液中杂质，利于后续各步操作
➢ 预处理的方法 • 加热-加速聚集，去除某些蛋白质 • 调pH-促进聚集作用 • 凝聚和絮凝-增大颗粒有效尺寸，加快沉降速率
2.2.1 改善过滤的方法
对于难过滤的发酵液，必须设法改善过滤性能、降低滤饼的 比阻值，以提高过滤速度。
➢ 预处理发酵液
• 等电点，蛋白质变性、吸附以及凝聚和絮凝等方法
➢ 加入助滤剂
• 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，滤速增大
➢ 酶解作用
2.2.1 改善过滤的方法
1. 助滤剂 ➢ 机理：表面吸附胶体及不可压缩型格子结构 ➢ 使用方法：
Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+
1.2.2 絮凝
➢ 机理
• 架桥作用，物理的 集合为主
➢ 架桥作用
• 有机高分子聚合物 絮凝剂具有长链线 状结构，含有相当 多的活性功能团， 可带有多价电荷， 也可以不带电性
• 活性功能团通过静电引力、范 德华分子引力或氢键的作用， 强烈地吸附在胶粒的表面
➢ 柠檬酸发酵液
加热至80C℃以上，使蛋白质变性凝固，降低发酵液钻 度，大大提高过滤速度。
1.2 凝聚与絮凝
➢ 基本概念
• 凝聚 胶体粒子(10-100nm)在中性盐的促进下， 互聚集成大粒子（1mm）。所得颗粒较小。
• 絮凝 大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状，成 形絮凝团的过程。可得粗大絮团。
2.2.3 错流过滤
➢ 原理
• 通过循环泵将要过滤的物质在 不同孔径的滤膜孔道中做高速 循环运动。在压力的作用下， 滤液以切线通过的方式滤出；
• 未滤液由于高速运动而形成湍 流，不断冲洗膜棒的内表面， 将少量附着在膜上的固形物带 走，从而防止了滤膜的阻塞， 保持过滤的正常进行。
➢ 特点 • 介质阻力大 • 不能得到干滤饼 • 需要大的膜面积 • 收率高 （97-98%） • 质量好 • 减少处理步聚 • 染菌罐也能进行处理
• 预先制成滤饼 • 助滤剂混入悬浮液中一起过滤 ➢ 常用助滤剂：硅藻土，珍珠岩，活性炭 ➢ 应用优化因素 • 单位质量助滤剂的滤液最大产量 • 使用周期 • 流速
2.2.1 改善过滤的方法
2. 酶制剂分解粘性物质
如果发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化 为单糖，以提高过滤速度。
➢ 举例