《基因芯片技术》第4章利用基因芯片进行基因表达谱分析
《基因芯片技术》课件
STEP 02
公平性问题
基因信息属于个人隐私， 如何在科学研究与隐私保 护之间取得平衡是一个重 要问题。
STEP 03
误用风险
基因芯片技术可能被误用 于基因决定论或种族歧视 等不道德用途。
基因技术的应用可能带来 不公平的医疗资源和机会 分配。
展望与未来发展
高通量测序技术
随着测序技术的进步，基因芯片将与 高通量测序技术结合，提供更全面、 深入的基因组信息。
表面活性剂
为了提高芯片表面的亲水性和降低非特异性吸附，通常会 在芯片表面涂覆一层表面活性剂，如聚乙二醇（PEG）。
表面洁净度
芯片表面的洁净度对实验结果至关重要，必须严格控制表 面污染物的种类和浓度。
探针的合成与固定
探针设计
探针是基因芯片的关键组成部分，其设计应考虑特异性、长度、 GC含量等因素。常用的探针合成方法包括化学合成和生物合成。
详细描述
基因芯片可以快速检测和识别各种疾病相关基因的变异，如 癌症、遗传性疾病等。通过基因芯片技术，医生可以精确地 确定疾病的类型、分期和预后，为制定个性化治疗方案提供 依据。
药物研发与毒理学研究
总结词
基因芯片技术在药物研发和毒理学研究中具有重要作用，能够加速新药的发现和开发，同时降低药物研发成本和 风险。
通路和网络分析
通过生物信息学工具对差 异表达基因进行通路和网 络分析，揭示基因之间的 相互作用关系。
基因功能注释与富集分析
基因功能注释
利用生物信息学数据库对基因进 行功能注释，了解其生物学功能 和分类。
富集分析
通过统计方法检测差异表达基因 在特定生物学过程或通路中的富 集程度，揭示基因的功能特点和 潜在作用机制。
高灵敏度
基于生物芯片的基因表达谱分析
基于生物芯片的基因表达谱分析随着基因组学、转录组学和蛋白质组学等生物学领域的发展，越来越多的研究人员开始采用生物芯片技术进行基因表达谱分析。
生物芯片技术是在芯片上固定一定数量的DNA片段或蛋白质，通过检测样本中的RNA或蛋白质与芯片上的DNA或蛋白质的相互作用来分析样本中的基因表达谱或蛋白质表达谱。
生物芯片技术基于基因表达谱分析的原理是，通过将一系列已知的基因片段（例如cDNA，基因组片段或寡核苷酸探针）安置在芯片上，样本RNA会与这些基因片段特异性结合，从而确定样本中某个基因的表达水平。
生物芯片技术可以高效地测定上千个基因的表达谱，进而了解基因调控网络以及与疾病相关的生命体征。
生物芯片技术主要分为两种：DNA芯片与蛋白芯片。
DNA芯片主要用于分析基因表达谱，蛋白芯片主要用于分析蛋白质表达谱。
这两种芯片都是由数千个小点（探针）组成的。
探针设计取决于研究对象及其应用范围。
一般来说，探针的选择基于研究问题，例如从特定生长条件中获得的医学样品，以及特定基因家族和参考数据集等。
DNA芯片是固相合成的高密度芯片，是一种半导体平台，通常由玻璃或硅基底衬、探针耗材面层、链接层、反应室、ALD制作的陶瓷基底（用于QPCR Array）等组成。
DNA芯片基于杂交实验原理开发，样本RNA的互补DNA探针将配对到DNA芯片上的探针，从而量化RNA表达。
蛋白芯片是一种高通量蛋白质分析技术，通过对样本中的蛋白质与芯片上含有多种蛋白质的检测探针相互作用，实现对样本中蛋白质表达谱的检测。
蛋白芯片构成如DNA芯片类似，由各种芯片片段组成。
特定蛋白质标记或DNA/ RNA片段在芯片上呈现出不同颜色或荧光，从而可以进行定量分析。
基于生物芯片的基因表达谱分析有以下特点：1. 高通量生物芯片技术可以在单个实验中测量数千种基因的表达谱，一定程度上有助于高通量数据处理和分析。
因此，可以更快速地有效地解读大规模数据，并挖掘出潜在的有意义的基因信息。
第三讲利用基因芯片进行基因表达谱分析
• 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 • 假阳性：验证 • 基因芯片结果需要传统方法的验证
新一代芯片技术 光纤微珠芯片
Screening Unlabeled DNA Targets with Randomly Ordered Fiber-Optic Gene Arrays,
Steemers, F.J., Ferguson, J.A., Walt, D.R., Nature Biotechnology,18, 91-94, 2000. Techview: Molecular Biology. Bead-Based Fiber-Optic Arrays, Walt, D.R., Science, 287,
3’UTR
11-20 pairs of 25mer probe
Probe Pair
Perfect Match Mismatch
Probe cell or feature
Chip
• Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs • Each probe pair consists of a perfect match and a mismatch
核苷酸的修饰方法
• 生物素标记的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]的结合进行检测， 标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简 单方便，扫描成本较低。
• 荧光素标记的dNTP：Cy3-的dNTP ，Cy5-的dNTP • 同位素标记的dNTP • amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，掺入DNA和
利用基因芯片技术研究基因表达谱
利用基因芯片技术研究基因表达谱第一章：基因芯片技术简介基因芯片技术是目前研究基因表达谱最常用的方法之一。
该技术的原理是利用DNA杂交的特性，将研究对象的RNA转录成cDNA，并通过杂交反应与固定在芯片上的DNA探针结合，从而测定样本中的基因表达水平。
与传统基因表达研究方法相比，基因芯片技术具有高通量、高灵敏度、高复现性等优点，能够同时检测上万个基因，为基因功能研究提供了有力的工具。
第二章：基因芯片技术的主要步骤基因芯片技术主要包括实验设计、样品处理、杂交反应、图像扫描和数据分析等步骤。
1. 实验设计：在进行基因芯片实验之前，需要明确研究问题和目标，确定实验设计方案。
这包括选择适当的芯片类型、样品处理方法、实验重复次数，以及对照组和实验组的设计等。
2. 样品处理：样品处理是基因芯片实验的关键步骤之一。
在样品处理过程中，需要提取RNA并将其转录为cDNA。
此外，还需要对RNA样品进行质量检测和纯化，以确保获得可靠的杂交结果。
3. 杂交反应：杂交反应是基因芯片实验的核心步骤。
该步骤中，将标记有探针的芯片与标记有cDNA的样品进行杂交反应。
在反应过程中，cDNA与芯片上的探针发生特异性结合。
随后，通过洗涤去除未结合的cDNA，然后进行图像扫描。
4. 图像扫描：图像扫描是基因芯片实验的一项重要步骤，主要用于记录杂交反应后的结果。
利用图像扫描仪，将芯片上的探针结合信号转化为可读的图像。
5. 数据分析：数据分析是基因芯片实验后续的重要工作。
通过对扫描得到的图像进行图像分析和信号处理，可以得到反映基因表达水平的原始数据。
接下来，可以进行差异表达分析、聚类分析、功能富集分析等，进一步挖掘基因的生物学功能。
第三章：基因芯片技术的应用领域基因芯片技术广泛应用于生物学、医学和农业领域。
以下列举几个典型的应用领域：1. 癌症研究：基因芯片技术可以帮助科学家了解癌症的分子机制，发现不同类型癌症的特异性基因表达谱，为癌症的诊断和治疗提供依据。
免疫学中基因芯片的应用及数据分析方法
免疫学中基因芯片的应用及数据分析方法基因芯片是一种新型的生物技术工具，它被广泛运用于生物学研究、医学诊断以及农业等领域。
在免疫学研究中，基因芯片可以用来分析基因表达，研究免疫系统的生物学和病理生理学，以及开发新的免疫疗法。
本文将探讨免疫学中基因芯片的应用及数据分析方法。
一、基因芯片在免疫学研究中的应用基因芯片技术基于DNA序列互补的原理，可以同时探测几千个基因在不同生理和病理条件下的表达水平。
在免疫学研究中，基因芯片技术可以用来研究免疫系统中与疾病相关的基因表达变化，为免疫治疗的开发提供重要的信息。
1. 免疫系统基因表达谱的分析免疫系统是一种复杂的网络，包括免疫细胞、激素和细胞因子等多种成分。
在不同生理和病理条件下，免疫系统中的基因表达模式会发生变化，这些变化与多种疾病的发生和发展密切相关。
利用基因芯片技术可以对免疫系统中的基因表达谱进行全面的分析，从而发现与免疫系统相关的新的治疗靶点。
2. 免疫治疗的监测免疫治疗是一种新兴的治疗模式，包括肿瘤免疫治疗、自身免疫病治疗以及感染病治疗等。
基因芯片技术可以用来监测免疫治疗的效果，并评估治疗的预后。
例如，利用基因芯片技术可以分析免疫治疗后T细胞的基因表达谱，从而预测治疗是否成功。
3. 病原体识别和分析免疫系统的主要功能是识别和清除病原体，基因芯片技术可以用来识别和分析各种病原体的基因表达模式，从而发现新的病原体治疗靶点，为针对性治疗提供依据。
二、基因芯片数据分析方法基因芯片技术可以同时测量成千上万个基因的表达水平，产生的数据量很大，数据分析也是一个复杂的过程。
一般情况下，基因芯片数据分析包括数据预处理、差异基因筛选、聚类分析、生物学意义的解释等几个步骤。
1. 数据预处理数据预处理指的是原始的基因芯片数据清洗与归一化的过程，这是数据分析的关键步骤。
数据预处理的目的是剔除芯片噪声、基准样本处理、将不同芯片数据进行标准化处理，提高数据质量和可靠性，为后续分析打下基础。
《基因芯片技术》利用基因芯片进行差异表达基因分析解读64页PPT
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
《基因芯片技术》利用基因芯片进行差 异表达基因分析解读
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、
基因芯片的操作流程及步骤
02
基因芯片操作流程
基因芯片的设计与制备
01
02
03
确定目标基因
根据研究目的，确定需要 检测的目标基因或基因组 区域。
设计探针
根据目标基因序列，设计 特异性捕获探针，确保探 针的特异性、灵敏度和稳 定性。
制备芯片
将探针合成并固定在芯片 基质上，形成基因芯片。
样本准备
样本收集
采集待检测样本，如组织、 血液、细胞等。
背景校正
通过特定的算法和技术，对基因芯片中的背景信号进行校正，排除非特异性信号和背景 噪声的干扰，提高数据的准确性和可靠性。
数据分析与结果解读
数据分析
运用统计分析、机器学习等方法，对基 因芯片数据进行深入分析，包括差异表 达基因的筛选、基因功能注释、通路富 集分析等。
VS
结果解读
根据分析结果，结合生物学知识和文献资 料，对基因表达谱进行解释和推理，揭示 基因之间的相互作用和调控关系，为后续 实验提供理论依据和指导。
06
应用实例
基因表达谱分析
目的
了解不同组织或不同生长条件下基因的表达情况，寻找差异表达基 因。
操作步骤
提取组织或细胞的总RNA，逆转录为cDNA，将cDNA标记后与基 因芯片进行杂交，洗涤、检测并分析结果。
注意事项
确保RNA质量、标记效率和杂交条件的优化。
单核苷酸多态性检测
目的
检测基因组中单核苷酸的变异，如SNPs，了解遗传变异与疾病的 关系。
交，洗涤、检测并分析结果。
注意事项
03
确保DNA标记效率和杂交条件的优化，注意控制实验条件和背
景噪音。
THANKS
感谢观看
核酸提取
从样本中提取出所需的核 酸（DNA或RNA）。
基因芯片技术在基因表达研究中的应用
基因芯片技术在基因表达研究中的应用随着现代科学技术的不断发展，基因芯片技术作为一种新兴的科学技术，引起了人们的广泛关注。
基因芯片技术是一种基于DNA 光学成像技术的高通量分析技术，能够以高效的方式同时识别和监测上千个基因，并且可以用于大规模、高通量的基因表达研究。
一、基因芯片技术的原理基因芯片技术通过特定的方法把数万个 DNA 片段置于一个非常小的芯片上，在每个 DNA 碎片的位置上附着荧光分子或其他化学分子，然后监测每个位置上分子的光信号来测量每个 DNA 片段的实时表达情况。
通过这种方法，可以大规模地研究生物体内基因的表达模式，以及这些表达模式与生物体的生理状态和疾病发生的关系。
二、基因芯片技术是一种非常有前景的新兴分析技术，可以广泛应用于生命科学领域的基因研究、基因表达分析和疾病诊断。
下面我们将重点介绍基因芯片技术在基因表达研究方面的一些应用。
1、基因表达谱分析基因芯片技术不仅可以识别和量化单个基因的表达，同时还能够同时测量并比较限定的许多基因。
这种方法的产生使学者们无需单独的克隆和筛选，也不需要对基因的序列信息有很深的了解，就可以大规模快速、全面地分析基因表达谱。
举个例子，基因芯片技术可以在一个非常短的时间内分析一组基因的表达情况，通过分析，把不同结构和功能基因的表达情况可视化，这有助于学者们理解基因和生物体之间的关系。
这一应用在生命科学领域中被广泛使用。
2、发现基因与疾病之间的关系基因芯片技术不仅可以发现表达谱在基因水平上的变化，同时还能够帮助学者们发现与某些疾病有关的基因。
基因芯片技术通过对于基因的大规模分析，可以大大缩小关键基因的范围，这对于医学研究者来说，是一个极为宝贵的资源。
3、建立生命科学数据库基因芯片技术还可以通过全面的基因识别研究，为构建生命科学数据库作出重要贡献。
基因芯片技术可以获取基因表达谱信息，用以建立相应的数据库，这有助于学者们研究生物体的生理状态、基因调控网络的建立和控制机制的研究等方面。
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现1.表达谱芯片及其应用表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。
用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。
cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。
用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计•算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。
在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。
基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。
基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。
表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。
芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。
②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。
③不同个体的相同基因表达上的差异。
利用基因芯片分析小麦春化过程中茎尖基因表达谱的研究的开题报告
利用基因芯片分析小麦春化过程中茎尖基因表达谱的研究的开题报告一、研究背景及意义小麦是我国主要农业作物之一，春小麦籽粒产量的高低受到生育期长短的影响。
而小麦春化过程中茎尖是一个重要的生长点，春化不成功，小麦就不会形成足够多的叶片及生殖器官，进而严重影响产量。
因此，深入研究小麦春化过程中茎尖的基因表达谱有助于探明小麦春化的调控机制和优化小麦品种发展。
二、研究内容和方法本研究将采用基因芯片技术，分析小麦春化过程中茎尖的基因表达谱，并运用生物信息学手段进行数据分析和挖掘。
具体包括以下几个步骤：1. 样本准备：以小麦春化过程中茎尖为研究对象，采集不同生育阶段的小麦茎尖样本，总RNA抽取，获得RNA样本。
2. 芯片设计：根据小麦的基因组信息，设计基因芯片，筛选出与春化过程中茎尖相关的基因，涵盖转录因子、信号传导、代谢物合成等功能模块。
3. 荧光染色：将取得的RNA样本经过荧光标记后，进行芯片杂交。
4. 数据分析：通过基因芯片扫描得到的信息，利用生物信息学手段实现数据过滤、标准化、差异分析、聚类分析。
5. RT-PCR验证：将基因芯片筛选出的关键基因进行RT-PCR验证，以确保数据的科学性和可靠性。
三、预期研究结果本研究将获得小麦春化过程中茎尖基因表达的全谱，探明了小麦春化的调控机制，为小麦优化品种发展提供基础理论研究。
同时，本研究还将筛选出一些关键基因，为小麦春化调控机制的深入研究提供了支撑。
四、研究难点及解决途径基因芯片技术具有高通量和高灵敏度等优点，但是也存在与样品质量相对应的高假反应和高噪音等问题。
因此，本研究的难点在于样品的短期保存和保护，以及数据分析的准确性。
解决途径包括加强样品的保存和保护，在数据分析时加强质量控制和标准化流程等。
以上是本研究的开题报告。
生物芯片技术在基因表达谱分析中的应用
生物芯片技术在基因表达谱分析中的应用基因表达谱分析是研究生物体中所有基因的表达活动的过程。
通过分析基因表达谱，我们可以了解基因在不同生理状态下的表达水平及其调控机制，从而揭示生物的生理和病理过程。
然而，由于人类基因组中含有数万个基因，传统的分子生物学实验方法相对耗时且费力，难以满足大规模基因表达谱分析的需求。
而生物芯片技术的出现为基因表达谱分析带来了革命性的突破。
生物芯片技术利用微加工技术制备出具有特定功能的微芯片，可同时检测大量基因的表达。
其工作原理基于互补配对的碱基识别，通过固相法将大量的探针（probe）固定在芯片表面。
当目标基因样品与芯片上的探针发生互补配对，便可检测到基因的表达水平。
这种高通量、高灵敏度的方法，使得基因表达谱分析研究不再受到基因数量的限制，具有极高的实验效率和可行性。
在基因表达谱分析中，生物芯片技术的应用主要包括两方面：基因检测和基因表达定量。
首先，生物芯片技术可以用于基因检测。
通过设计一系列与待检测基因序列互补的DNA探针，并固定在芯片表面上，可以快速、高效地检测目标基因是否存在。
当待测样品与芯片上的探针序列互补匹配时，探针序列受到样品的靶向结合，形成荧光信号。
通过对芯片上信号的检测和分析，可以确定目标基因在样品中的存在与否，从而实现基因的快速筛查。
这种方法广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域。
其次，生物芯片技术还可以进行基因表达定量。
通过将不同基因的探针组合在一起，形成芯片上的基因表达谱图案，可以一次性检测样品中大量基因的表达水平。
此外，芯片上的探针还可以是荧光标记的，当目标基因与其互补配对时，可通过荧光检测技术测定基因的表达量。
相比传统的基因表达分析方法，生物芯片技术具有试剂用量少、重复性好以及高通量等优势，大大提高了实验效率和数据准确性。
总之，生物芯片技术在基因表达谱分析中的应用为生物医学研究提供了便利，并在临床诊断和药物研发中发挥了重要作用。
这项技术的快速发展与不断创新，将进一步推动基因表达谱的研究，为我们深入了解生物体内基因调控提供更多机会。
基因表达谱的分析与应用
基因表达谱的分析与应用基因表达谱是指在特定的生理和疾病状态下，细胞内不同基因的表达量。
它记录了一个细胞或组织中基因表达的整体情况，并反映了这个细胞或组织所处的状态。
近年来，随着DNA芯片技术的发展和大数据分析方法的不断更新，基因表达谱已成为了生物学、医学等研究领域的重要工具之一。
本文将从基因表达谱的原理及其分析方法、在医学领域中的应用等方面进行探讨。
一、基因表达谱的原理人体内的每一个细胞都包含相同的基因序列，但在不同的时间和空间中，各基因是否表达以及表达的水平都是不一样的。
基因表达谱通常由DNA芯片技术获得，DNA芯片是一种高密度的固相芯片，上面固定了数千至数百万个不同的DNA探针，用于检测样品中mRNA的表达量。
通过将细胞或组织中的mRNA荧光标记后杂交到DNA芯片上，利用荧光信号检测出不同探针的信号强度，得到基因表达量的信息。
二、基因表达谱的分析方法1、差异基因分析差异基因分析是基于不同条件下的基因表达谱数据，找出表达量差异显著的基因。
在疾病的机制研究中，可以将正常组织与被检测组织的基因表达谱进行对比，找出在疾病状态下存在显著差异的基因。
该方法常用于发掘分子标志物、疾病发生机制研究以及药物作用机制的研究等方面。
2、基因功能注释基因功能注释是将差异表达基因的生命学信息进行分类、整合和分析，以发现基因的生物学功能及其网络关系。
这项工作常常将基因表达谱数据与对基因的生物学注释进行比对，以验证差异表达的基因是否具有特殊的生物学含义，从而有针对性地深入研究。
3、基因集富集分析基因集富集分析是将差异表达分析结果中的基因按其生物学功能和通路进行分类，再与基因注释数据库中的通路进行比较，检测差异表达基因是否与特定通路、过程、功能相关。
三、基因表达谱在医学上的应用1、疾病标志物的筛选基因表达谱作为一种高通量技术，能大规模地筛选疾病标志物。
通过对不同疾病状态下的基因表达谱进行分析，能够找到在疾病发生和发展过程中特异的基因表达变化，从而寻找到新的疾病标志物，弥补传统生物化学方法的缺陷。
基因芯片和基因表达谱分析
基因芯片和基因表达谱分析在人类基因测序技术不断发展的背景下，基因芯片和基因表达谱成为了研究生物学和医学领域的重要工具。
本文将重点探讨基因芯片和基因表达谱分析的原理、应用以及未来发展方向。
一、基因芯片基因芯片（Gene chip）又称为微阵列芯片（microarray）是一种将数万个DNA序列可控地捕捉在一个硅片上的生物技术产品。
其原理基于同位素标签法和荧光标记法，用来研究生物大分子（包括DNA、RNA和蛋白质）在细胞周期、转录和翻译等生物活动过程中的表达差异和变化规律。
基因芯片的操作过程分为如下几步：1. DNA序列打印和固定。
通过免疫印刷技术，将已知的DNA序列按照一定的规则打印到芯片上，并使用化学方法将其固定在芯片上，作为反应体系中的探针。
2. 样品准备和反应。
将待测样品中的RNA提取、反转录成cDNA，再将其标记为荧光分子，加入到含有探针的芯片反应体系中。
其中，标记为红色和绿色的荧光分子分别代表着样品RNA在两种不同条件下的表达水平。
3. 芯片扫描和数据统计。
将芯片送入扫描仪中扫描，获得荧光信号强度。
通过芯片上探针的位置、荧光信号的强度以及探针序列的注释信息等，对数据进行分析和解读，得到各种基因的表达信息。
基因芯片在各个领域有着广泛的应用。
在医学领域，它可以用于疾病诊断、治疗效果预测、药物靶点筛选等方面的研究。
在生物学研究中，它可以分析基因调控、遗传变异和发育过程等生物学领域的课题。
二、基因表达谱分析基因表达谱分析是以生物体内mRNA的转录活性水平为信号，分析在不同条件下各种基因的表达水平差异。
常见的基因表达谱分析方法有RT-qPCR、Northern blot、Western blot、RNA-seq等。
其中，RT-qPCR方法是一种基于荧光信号检测的技术，可以非常精确地检测出RNA的拷贝数。
其操作过程分为三步：反转录、定量PCR和数据分析。
反转录过程中，RNA被逆转录酶逆转录成DNA。
基因表达谱芯片的数据分析
基因表达谱芯片的数据分析(2012-03-13 15:25:58)转载▼标签：杂谈分类：生物信息摘要基因芯片数据分析的目的就是从看似杂乱无序的数据中找出它固有的规律, 本文根据数据分析的目的, 从差异基因表达分析、聚类分析、判别分析以及其它分析等角度对芯片数据分析进行综述, 并对每一种方法的优缺点进行评述, 为正确选用基因芯片数据分析方法提供参考.关键词: 基因芯片; 数据分析; 差异基因表达; 聚类分析; 判别分析吴斌, 沈自尹. 基因表达谱芯片的数据分析.世界华人消化杂志2006;14(1):68-74/1009-3079/14/68.asp0 引言基因芯片数据分析就是对从基因芯片高密度杂交点阵图中提取的杂交点荧光强度信号进行的定量分析, 通过有效数据的筛选和相关基因表达谱的聚类, 最终整合杂交点的生物学信息, 发现基因的表达谱与功能可能存在的联系. 然而每次实验都产生海量数据, 如何解读芯片上成千上万个基因点的杂交信息, 将无机的信息数据与有机的生命活动联系起来, 阐释生命特征和规律以及基因的功能, 是生物信息学研究的重要课题[1]. 基因芯片的数据分析方法从机器学习的角度可分为监督分析和非监督分析, 假如分类还没有形成, 非监督分析和聚类方法是恰当的分析方法; 假如分类已经存在, 则监督分析和判别方法就比非监督分析和聚类方法更有效率。
根据研究目的的不同[2,3], 我们对基因芯片数据分析方法分类如下: (1)差异基因表达分析: 基因芯片可用于监测基因在不同组织样品中的表达差异, 例如在正常细胞和肿瘤细胞中; (2)聚类分析: 分析基因或样本之间的相互关系, 使用的统计方法主要是聚类分析;(3)判别分析: 以某些在不同样品中表达差异显著的基因作为模版, 通过判别分析就可建立有效的疾病诊断方法.1 差异基因表达分析(difference expression, DE)对于使用参照实验设计进行的重复实验, 可以对2样本的基因表达数据进行差异基因表达分析, 具体方法包括倍数分析、t检验、方差分析等.1.1 倍数变化(fold change, FC) 倍数分析是最早应用于基因芯片数据分析的方法[4], 该方法是通过对基因芯片的ratio值从大到小排序, ratio是cy3/cy5的比值, 又称R/G值. 一般0.5-2.0范围内的基因不存在显著表达差异, 该范围之外则认为基因的表达出现显著改变. 由于实验条件的不同, 此阈值范围会根据可信区间应有所调整[5,6]. 处理后得到的信息再根据不同要求以各种形式输出, 如柱形图、饼形图、点图等. 该方法的优点是需要的芯片少, 节约研究成本; 缺点是结论过于简单, 很难发现更高层次功能的线索; 除了有非常显著的倍数变化的基因外, 其它变化小的基因的可靠性就值得怀疑了; 这种方法对于预实验或实验初筛是可行的[7]. 此外倍数取值是任意的, 而且可能是不恰当的, 例如, 假如以2倍为标准筛选差异表达基因, 有可能没有1条入选, 结果敏感性为0, 同样也可能出现很多差异表达基因, 结果使人认为倍数筛选法是在盲目的推测[8,9].1.2 t检验(t-test) 差异基因表达分析的另一种方法是t检验[10], 当t超过根据可信度选择的标准时, 比较的两样本被认为存在着差异. 但是t检验常常受到样本量的限制, 由于基因芯片成本昂贵, 重复实验又很费时, 小样本的基因芯片实验是很常见的, 但是小样本导致了不可信的变异估计. 为了克服这种缺点, 研究者提出了调节性t检验(regularized t-test), 它是根据在基因表达水平和变异之间存在着相互关系, 相似的基因表达水平有着相似的变异这个经验, 应用贝叶斯条件概率(贝叶斯定理)统计方法, 通过检测同一张芯片临近的其它基因表达水平, 可以对任何基因的变异程度估计进行弥补. 这种方法对于基因表达的标准差估计优于简单的t-test和固定倍数分析法[11].1.3 方差分析(analysis of variance, ANOVA) 方差分析(ANOVA)又称变异数分析或F检验, 其目的是推断两组或多组资料的总体均数是否相同, 检验两个或多个样本均数的差异是否有统计学意义, 方差分析可用于差异基因表达研究[12]. 方差分析需要参照实验设计, 参照样本常用多种细胞的mRNA混合而成, 由于所有的细胞同时表达的基因众多, 结果低表达基因在样本混合后就被稀释而减少了参照样本的代表性, 因此, 增加参照样本的细胞不会提高参照样本的代表性[13].方差分析能计算出哪些基因有统计差异, 但它没有对那些组之间有统计差异进行区分, 比如用单因素方差分析对A、B、C、D 4组进行分析, 对于某一个基因, 方差分析能够分析出A组与B、C、D组之间有差异, 但是B、C、D之间无统计学意义. 这就需要使用均值间的两两比较(post-hoc comparisons)检验, 该检验是对经方差分析后的基因进行下一水平更细节的分析[14]. 即t-检验只能用于检验两样本中均值是否存在显著性差异, 而两两比较技术考虑了多于2样本间均数的比较.上述所有的参数分析方法必须平衡假阳性、假阴性错误[15,16], 控制假阳性率有4种方法: (1)邦弗朗尼(Bonferroni)方法, 计算公式: Corrected P-value ＝P-value×n(number of genes in test), 如果纠正P值仍小于错误率(如0.05), 则该基因将属于有表达差异的基因.(2)Bonferroni Step-down(Holm)法, 这种校正方法与邦弗朗尼很相似, 但没有前者严格. 主要思想如下: 每个基因的P值从低到高排序, Corrected P-value＝P-value×n(n-1/n-2……), 如果纠正P值仍小于错误率(如0.05), 则该基因将属于有表达差异的基因. (3)Westafall &Young参数法, 前面2种方法都是单独对P值进行纠正, 本方法通过同时对所有基因进行排序, 充分利用基因间的独立性进行P值纠正. 每个基因的P值是按原始资料的排序进行计算; 将资料划分为人工组和对照组而产生新的数据. 采用新数据计算所有基因的P值, 新P值再与以前的P值进行比较, 上述过程重复很多次, 最后计算出纠正P值. 如果纠正P值仍小于错误率(如0.05), 则该基因将属于有表达差异的基因. (4)Benjamini & Hochberg假阳性率法, 该方法是4种方法中最不严谨的方法, 因此可能产生很多的假阳性和假阴性, 其方法如下: 首先对每一个基因的P值由小到大排序, 最大的P值保持不变, 其它基因按下列公式计算P值,Corrected P-value ＝P value×(n/n-1)以此类推, 若P<0.05则为有差异基因.上述前3种方法可概括为误差率判断族(family-wise error rate, FWER), 它的特点是允许很少的假阳性基因发生, 而假阳性率(false discovery rate, FDR)是允许一定率的假阳性基因发生. 总之, 假阳性率(FDR)在差异表达与控制假阳性率之间提供了一个好的平衡统计, Bonferroni是最严格的方法, 也是最保守的假阳性估计方法. Westfall & Young参数法是以基因的共同调节进行计算, 因此它的计算是很慢的, 对假阳性率的估计也是很保守的[17,18]. 1.4 非参数分析(nonparametric analysis) 由于微阵列数据存在＂噪声＂干扰而且不满足正态分布假设, 因此使用t-检验和回归模型进行筛选的方法可能有风险. 非参数检验并不要求数据满足特殊分布的假设, 所以使用非参数方法对变量进行筛选虽然粗放, 但还是可行的[19]. 目前用于基因表达谱数据分析的非参数方法除了传统的非参数t-检验(nonparametric t-test)、Wilcoxon秩和检验(Wilcoxon rank sun test)等外[20], 一些新的非参数方法也应用于基因表达谱数据的分析中, 如经验贝叶斯法(empirical Bayes method)[21]、芯片显著性分析(significance analysis of microarray, SAM)[22]、混合模型法(the mixture model method, MMM)[23]等. 参数法的缺点是分析数据有假设检验, 比如改变样本中的变异可明显影响分析结果, 对同样数据的转换(如对数), 对其分析结果也有明显的影响. 非参数方法对于这种情况的发生更有效, 但是它对表达数据分析的敏感性不如参数方法.1.5 回归分析(regression analysis) 目前使用的一些简单的参数分析方法是通过数据转换(如对数)来达到正态分布为假设前提的, 或者是估计的经验分布, 然而这二种方法对基因表达数据可能都是不合理的, 非参数方法忽视了数据的分布, 而参数方法又会误判数据的分布[24,25]. 基因表达谱的回归分析是可以处理多个基因变量间线性依存关系的统计方法, 于是研究者们提出了使用回归分析基因表达谱数据, 如Li et al[26]使用互变量(Cox)回归方法分析基因表达谱数据, 用于患者的生存率预判; Huang et al[27]将线性回归方法应用于肿瘤的分类研究中.2 聚类分析(clustering analysis)组聚类分析的目的在于辨别在某些特性上相似的事物, 并按这些特性将样本划分成若干类(群), 使同类事物具有高度同质性, 而不同类事物则有高度异质性. 聚类分析是通过建立各种不同的数学模型, 它把基于相似数据特征的变量或样本组合在一起. 归为一个簇的基因在功能上可能相似或关联, 从而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能. 但是由于使用数据转换、归一化等因素, 导致对聚类分析结果的影响较大; 此外, 聚类只是为了寻求类, 不管所聚的类别是否有意义[28].2.1 分层聚类法(hierarchical clustering, HCL) 分层聚类是将n个样品各作为一类, 计算n个样品两两之间的距离, 构成距离矩阵, 合并距离最近的两类为一新类, 计算新类与当前各类的距离[29]. 再合并、计算, 直至只有一类为止. 分层聚类是第一个被应用于基因表达谱数据分析的聚类方法[30], 由于结果的可视化和基因间关系的明确表现, 广泛地应用于基因表达谱的肿瘤亚型分类和幸存率研究中[31,32].2.2 K-均值聚类(K-means clustering, KMC) K-均值聚类是先选择初始凝聚点, 根据欧氏距离系数, 将每个样品归类, 各类的重心代替初始凝聚点, 根据欧氏距离将每个样品不断地归类, 直至分类达到稳定. K-均值算法是采用误差平方和为准则函数的动态聚类方法, 其计算快速, 适合于大规模的数据计算[33]. 如D'ambrosio et al[34]为了理解肥大细胞增生的分子机制和寻找其鉴定的分子标记, 选取肥大细胞增生症患者和正常人的骨髓的单核细胞进行基因芯片实验, 应用K-均值聚类和分层聚类得到同一类的10个基因, 进一步分析鉴定出3个基因属于该疾病的候选标记基因. 但是K-均值聚类也有不足之处, 它对初始凝聚点比较敏感, 如果初始凝聚点没有选择好就可能集合在标准功能值的局域极小值上. 而另一个问题在于它是完全无结构的方法, 聚类的结果是无组织的[35].2.3 自组织映射图网络(self-organizing map clustering, SOM) 神经网络中邻近的各个神经元通过侧向交互作用彼此相互竞争, 自适应地发展成检测不同信号的特殊检测器, 这就是自组织特征映射的含义. 其基本原理是将多维数据输入成几何学节点, 相似的数据模式聚成节点, 相隔较近的节点组成相邻的类, 从而使多维的数据模式聚成2维节点的自组织映射图. 自组织映射图允许对类进行调整, 属于监督类聚类[36]. 自组织映射图分类标准明确; 优化的次序好于其它聚类法, 在基因表达谱的数据分析中得到广泛的应用. 如Covell et al[37]认为多种肿瘤可能具有共同的基因表达谱, 他们选取了14种肿瘤和正常对照组织进行基因表达谱研究, 结果自组织图能完全将肿瘤和正常组织区分出来, 自组织图对各种肿瘤的分辨率达到80%的准确性, 其中对白血病、中枢神经系统肿瘤、黑色素瘤、子宫癌、淋巴瘤有很好的判别作用, 对直肠癌、乳腺癌、肺癌的判别差.2.4 双向聚类(two-way clustering, TWC) 基因表达谱常采用单向聚类法(one-way clustering), 即要么以整个样本中特性相似的基因进聚类, 或者以基因表达相似的样本进行聚类. 对样本和基因同时进行聚类就是双向聚类法(two-way clustering)[38], 目前基因表达谱的数据分析常用的双向聚类有基因剃须(gene shaving, GS)和格子模型(plaid models). 基因剃须是通过基因的共同表达值或表达量来鉴定基因的亚类, 基因表达谱分析方法常用监督进行聚类, 没有考虑一个基因可能属于多个类. 基因剃须对基因或样本进行分类既可以是监督的, 也可以是非监督的. 基因剃须近年逐渐被应用于基因表达谱的分析中, 如Hastie et al[39]使用基因剃须方法分析了B细胞淋巴瘤患者的基因表达谱, 鉴定了一小类可用于生存率预判的基因. 作者认为基因剃须方法是一种潜在有用的基因表达谱数据分析方法. Jiang et al[40]使用了2种基因剃须方法筛选肺腺癌的标志基因, 通过和正常组织的基因表达谱比较, 分别筛选到13条和10条, 其中5条是共同的. 格子模型的目的是分析基因芯片数据可解释的生物结构, 即基因或样本的亚类. 各类之间可以进一步聚类, 从而获得稳定的、有意义的分层结构[41,42]. 目前应用格子模型进行基因表达数据分析的实例还不多.2.5 混合聚类法所谓混合聚类就是先非监督(unsupervised)聚类再监督(supervised)聚类. 其优点是可以整合多种聚类方法的优点, 目前混合聚类受到越来越多研究者的关注, 如由于基因芯片数据的复杂性和多维性, 为利于基因表达谱数据的处理, 有必要对复杂多维的原始数据进行简化处理, 为了解决这个问题, Wang et al[43]提出了双水平分析, 即首先使用自组织图减少原始数据的多维性, 然后进行了K-均值和分层聚类以建立样本判别的基因表达模型. Herrero et al[44]还论述如何将自组织图和分层聚类组合成一个优秀的工具用于基因表达谱的数据分析.3 判别分析(discriminant analysis)判别分析能够依据样本的某些特性, 以判别样本所属类型. 与聚类分析不同的是, 判别分析是用某种方法将研究对象分成若干类的前提下, 建立判别函数, 用以判定未知对象属于已知分类中的哪一类. 基因判别分析(有监督学习)是在已有数据的基础上建立分类器, 并利用所建立的分类器对未知样品的功能或状态进行预测[45,46]. 目前使用的判别分析方法主要有: 支持向量机、决策树、贝叶斯分类、神经网络法等.3.1 费希尔判别分析(fisher discriminant analysis, FDA) 费希尔判别分析是以线形函数为准则进行判别[47], Cho et al[48]应用费希尔判别方法分析肿瘤患者的基因表达谱资料以判别肿瘤的分型. 如Dangond et al[49]将费希尔判别方法应用于计算肌萎缩侧索硬化病的基因表达谱研究中.3.2 贝叶氏网络(bayesian networks) 也被称为因果网络(causal networks), 是描述数据变量之间依赖关系的一种图形模式, 是一种用来进行推理的模型. 贝叶斯网络为人们提供了一种方便的框架结构来表示因果关系, 这使得不确定性推理在逻辑上更为清晰、更好理解[50]. 如Imoto et al[51]结合贝叶斯网络和生物学知识进行基因表达谱数据的基因网络分析, 并以酿酒酵母的基因表达谱数据为例进行了论证. Kim et al[52]将贝叶斯网络法应用于时间系列的基因表达谱数据的基因网络分析等.3.3 支持向量机(support vector machines, SVMs) 支持向量机是数据挖掘中的一个新方法. 支持向量机能非常成功地处理回归问题(时间序列分析)和模式识别(分类问题、判别分析)等诸多问题, 它通过训练一种＂分类器＂来辨识与已知的共调控基因表达类型相似的新基因[53-55]. 例如Williams et al[56]为了鉴定出肾母细胞瘤复发的基因表达谱模型, 研究了27例肾母细胞瘤患者的肿瘤组织, 其中13例2a内复发, 对复发和未复发的肿瘤组织进行基因芯片实验, 并应用支持向量机对基因表达谱数据进行分析, 结果发现了一小类可能用于肿瘤预诊的基因.3.4 决策树(decision trees) 决策树是一种常用于预测模型的算法, 它通过将大量数据有目的的分类, 从中找到一些有价值的, 潜在的信息. 它的主要优点是描述简单, 分类速度快, 特别适合大规模的数据处理[57]. Dettling et al[58]比较了不同决策树算法对基因表达谱分析的影响. Middendorf et al[59]应用决策树方法研究了简单生物的基因调节机制.3.5 人工神经网络法(artificial neural network, ANN) ANN是一种应用类似于大脑神经突触联接的结构进行信息处理的数学模型. 在这一模型中, 大量的节点(或称＂神经元＂, 或＂单元＂)之间相互联接构成网络, 即＂神经网络＂, 以达到处理信息的目的. 其优势是运行分析时无需在心目中有任何特定模型, 而且, 神经网络可以发现交互作用效果(如年龄和性别的组合效果)[60]. O'Neill et al[61]将神经网络法应用于淋巴瘤基因表达谱数据的分析, 该方法对淋巴瘤预后和诊断都具有较好的判别作用. Sawa et al[62]对酵母属基因表达谱数据进行了欧氏距离、相关系数、相互信息和基于神经网络的聚类分析, 发现基于神经网络的聚类结果较前3种方法更为合理.4 其他分析4.1 主成分分析(principal component analysis, PCA) 在大规模基因表达数据的分析工作中, 由于组织样本例数远远小于所观察基因个数, 如果直接采用前述聚类分析可能产生较大误差, 故需要对聚类算法进行改进. 目前已经提出很多改进的聚类方法, 其中较为流行的方法是应用主成分分析方法对数据进行分析[63,64]. 主成分分析的目的是要对多变量数据矩阵进行最佳综合简化. 使用的方法是寻找这些变量的线性组合－称之为主成分, 使这些主成分间不相关. 为了能用尽量少的主成分个数去反映原始变量间提供的变异信息, 要求各主成分的方差从大到小排列, 第一主成分最能反映数据间的差异. 主成分分析通过合并原来的维数得到更少的维数来表示对象, 同时要求新的维数必须尽可能地反映原有维数所反映的信息, 它有较少的信息丢失. 主成分分析有助于简化分析和多维数据的可视化[65]. 如Crescenzi et al[66]应用主成分分析对60个肿瘤细胞株的基因表达谱数据进行分析, 结果发现肿瘤分型相关的基因有1375个, 主成分分析得到细胞运动等5个独立的成份. 主成分分析是把原来多个变量化为少数几个综合指标的一种统计分析方法. 从数学角度来看, 这是一种降维处理技术. 而且使这些较少的综合指标既能尽量多地反映原来较多指标所反映的信息, 同时它们之间又是彼此独立的. 但是使用该方法可能导致一部分有用信息的丢失. 为此, Yeung et al[67]采用两个真实数据集和三个模拟数据集作为实验材料, 对采用主成分分析方法所得出的聚类结果作了评估. 他们发现, 进行主成分处理后的聚类质量没有明显提高, 甚至有所降低. 基于以上研究结果, 他们不主张使用PCA方法进行聚类分析.4.2 基因网络分析(gene network analysis) 基因表达分析包括3个层次[68], 首先是单基因水平, 即比较对照组与实验组的每个基因是否存在表达差异, 这主要指差异基因表达分析; 其次是多基因水平, 如按照基因的共同功能、相互作用、共同表达等进行的聚类分析; 最后是系统水平, 即以基因网络形式解释和理解生命现象. 在生物体系中, 基因从来不是单独起作用的, 它们相互作用呈网络状, 因此从网络的观点分析基因表达谱数据必然会导致对生物系统的更高层次的理解, 目前研究者们已经开始了这方面的研究. 正如前述的各种聚类方法, 假如几个基因被聚类在同一组, 它们有可能是共同表达的基因或者是有同样的信号通径, 深入分析这些基因的增强子可能发现它们共同的调节元件, 从而揭示生物系统更高层次的网络[69]. 另外应用目前已知全序列的模式生物(如酵母、结核分枝杆菌), 人们已研制出加载有他们全基因的芯片, 通过比较不同条件下(突变、基因撬出或设计时间系列)表达谱的变化, 再使用贝叶斯网络法等进行系统分析, 可揭示基因功能和调控网络[70]. 此外还可从代谢等角度研究, 比如从新陈代谢分析基因表达的网络关系等.总之, 基因芯片数据分析的方法众多, 随着研究的进展不断地有新的数学方法应用于芯片的数据分析中步研究5 参考文献1 Reimers M. 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基因芯片技术利用基因芯片进行差异表达基因分析解析PPT教案
差异表达基因分析
在Affymetrix等短的寡核苷酸芯片中，采用单色荧 光标记的方式，实验组和对照组分别用两张芯片进 行检测，表达差异值即为两张芯片的信号比值。
噪声和芯片本身的一些因素以及生物学本身的特点 给筛选差异表达基因带来了很大的麻烦。
必须设定一个差异表达基因的判定标准。这个筛选 的标准就称为差异表达基因的阈值。
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排秩统计量法
选择一个统计量给基因排秩（研究多，方法多） 为排秩统计量选择一个阈值，在阈值之上的值
将被认为是表达差异显著的值
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重复芯片（replicates）M值法
根据比率平均值或M值对基因排序。M值为信 号强度比值的log2值，M杠是任一特定基因在 重复序列中M值的均值。
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Z值法
在一张cDNA芯片上一般都点了很多基因，其实这些基 因中只有一小部分表达有差异，所以一般都假设表达 的比率值满足正态分布。
Z=(X-µ)/σ. |Z|>=1.96 在寡核苷酸芯片中，芯片上的基因在相应实验条件下
或相应组织中也只有一小部分基因有表达，可以假定 强度满足对数正态分布，同样可以对其作Z变换，使其 具有统计意义。
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Z值法
缺点： 如果实验体系中没有一条差异表达的基因，Z值法还是
会挑选出5％的差异表达基因。这是因为在芯片实验中， 总有一些由于背景噪声产生的假阳性点。 如果实际上实验中有大量的基因表达发生改变，Z值法 还是机械的找出5％的差异表达基因，丢失了一部分真 阳性点。
在加权均数中，权重为上面计算的基因间的相似性。K 值的确定具有一定的经验性，但不宜太大和太小。
基因表达谱分析方法的使用教程
基因表达谱分析方法的使用教程基因表达谱分析是研究基因在细胞或组织中的表达水平及其变化的重要手段。
通过分析基因表达谱，可以揭示基因在不同生理状态和疾病发生发展过程中的作用机制，为进一步的研究提供重要依据。
本文将介绍几种常用的基因表达谱分析方法及其使用教程。
1. microarray芯片技术Microarray技术是目前最常用的基因表达谱分析技术之一。
它通过在玻璃片或硅片上固定大量的探针序列，然后将待测样品中的RNA反转录成cDNA标记，与芯片上的探针序列杂交，利用荧光探针检测标记的cDNA的信号强度来反映基因的表达水平。
使用microarray技术进行基因表达谱分析的步骤如下：1) 设计实验：确定实验的目的、样品来源、实验方案和所需探针等。
2) 样品处理：提取RNA并进行反转录，将RNA转化为cDNA，并标记荧光。
3) 芯片处理：将标记的cDNA杂交于芯片上的探针序列，完成杂交后进行芯片洗涤。
4) 扫描芯片：使用芯片扫描仪检测芯片上标记的cDNA的荧光信号。
5) 数据分析：对扫描得到的图像进行图像分析、标准化、差异基因筛选和功能富集分析等。
2. RNA测序技术RNA测序技术（RNA-Seq）是一种基于高通量测序平台的基因表达谱分析技术，它通过直接测序RNA分子，可以定量测量每个基因的表达水平，并发现新基因和变异。
使用RNA测序技术进行基因表达谱分析的步骤如下：1) RNA提取：从细胞或组织中提取RNA，并进行质量检测和纯化。
2) RNA片段化和逆转录：将RNA经过碱水解或酶处理，得到短的RNA 片段，然后进行逆转录合成cDNA。
3) 文库构建：对cDNA进行末端修复、A尾化、连接测序接头和PCR扩增等处理，构建测序文库。
4) 文库测序：将测序文库装载到测序仪上，进行高通量测序，得到原始测序数据。
5) 数据分析：对原始测序数据进行质控、对齐、定量、差异基因表达分析以及功能注释等。
3. qRT-PCR技术量子链反应实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）是一种常用的基因表达谱分析方法，其优点在于准确、灵敏和高通量。
基因表达谱和基因功能注释的分析方法
基因表达谱和基因功能注释的分析方法随着生物学领域的不断发展，我们对于基因表达和功能的了解也越来越深刻。
基因表达谱和功能注释是分析与解释基因信息的重要方法。
本文将介绍基因表达谱和基因功能注释的分析方法，包括技术原理、分析流程、数据处理等内容，希望能让读者对这方面的知识有更深入的认识和理解。
一、基因表达谱分析基因表达谱是衡量不同细胞、组织或条件下基因表达水平的方法。
它能够揭示基因间的关系，帮助研究人员了解生命体系中基因的功能和调控机制。
而基因表达谱分析是基于高通量技术的方法，用于鉴定和描述特定条件下基因表达的差异性。
下面我们将介绍主要的方法和技术。
1. 基因芯片技术基因芯片技术通过对芯片进行杂交实现对千万个基因进行同时分析。
这种技术被广泛应用于各种研究领域，尤其是对于基因组研究和疾病研究。
但是基因芯片的优势也伴随着一些局限性，比如感知度和特异性等缺点，所以近年来更加应用的是RNA-seq技术。
2. RNA-seq技术RNA-seq技术是通过将RNA分子转化为cDNA来进行分析的。
相比于其他方法，RNA-seq有许多优势，如高灵敏度、更广泛的检测范围和能够分析具有新的转录本，可变剪切异构体和外显子的新基因等。
但是它的分辨率和灵敏度也有一些局限性。
这两种技术都是分析基因表达谱的主流方法。
下面我们将详细的介绍分析流程。
1. 数据获取和清理首先需要从获取基因表达数据，比如在NCBI，GEO，和ArrayExpress等平台可以找到大量的数据资源。
接下来进行数据清理，将原始数据进行预处理，如数据质量控制和归一化处理等。
2. 差异分析差异分析是基因表达谱分析的主要流程，其中涉及许多基于统计的方法和算法。
通过比较不同实验条件下的基因表达差异，我们可以发现哪些基因与哪些疾病或者生理现象有关，从而研究基因调控的模式和机制。
3. 功能注释差异分析的结果就是一大堆数字，需要进行功能注释才能具备生物学意义。
基因功能注释就是为每个差异基因分配一些生物学注释，如基因本体分析，KEGG通路分析等，这样就可以更好的了解差异基因的功能模式。
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PM-MM探针设计的优势
• 灵敏度提高 将已克隆的转录产物 以不同的浓度掺入到组 织样品中。经过标记的 样品与Affymetrix Genechip人类基因组 芯片杂交，在克隆转录 产物浓度低于8pM时， PM单独探针无法探测 出相应的浓度变化，而 与MM探针联合使用则 可以探测出。
单链和双链探针
样本量
• 从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验 需要？非扩增：20微克；扩增：1微克 • 有些情况下，样本极为稀有，不可能得到 大量的mRNA靶分子 • 基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程 度上限制了该技术的推广 • 发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯 片实验样本用量
核苷酸的修饰方法
标记方法
• RNA样本不扩增进行标记：在反转录的体 系中加入Cy3或Cy5标记过的dNTP类似物， 通过反转录酶的作用，标记新合成的cDNA。 这种实验方法效率较低，对RNA样本需求 量大，通常要50～200μg总RNA，1～3μg mRNA • RNA样本扩增后进行标记
扩增mRNA（cRNA）靶分子
合成cDNA二链
1在反转录酶的作用下， 反转录生产cDNA一 条链。 2并在cDNA一链的3’ 端加上非模板的寡聚 C残基 3加入3’端带有寡聚G 的引物，可以结合到 cDNA的3’端，生成一 小段双链的cDNA 4再在DNA聚合酶的 作用下延伸 5加入RNase H，水 解掉RNA模板，以残 留的与cDNA一链配 对的短片段RNA为引 物，在DNA聚合酶的 作用下生成双链 cDNA
原核生物样品
第四节 数据分析流程图
原始图象文件(Cy3/Cy5) →定位 →栅格处理(griding)→数据自动提取 →数据入表达谱数据库 →原始数据标准化(normalization)
Ratio值分析
显著性表达差异基因
Cluster分析
具有相似表达谱基因
Experiment group/control :
噬菌体T7 DNA编码 的酶，对T7启动子序 列具有高度特异性， 不能识别其它生物来 mRNA 源的启动子。 是依赖于DNA的RNA 聚合酶，具有5'→3' 的RNA聚合酶活性， 以含有T7启动子序列 的双链DNA为模板， 以NTP为底物，合成 cRNA 与启动子下游的模板 DNA互补的RNA。
芯片杂交
逆转录：合成cDNA一链
• mRNA逆转录合成cDNA时用poly（dT）作 引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转 录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从 而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中 纯化mRNA的工作 • 总RNA的纯度不如mRNA高，直接从总RNA 进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到 逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA 的纯度
样本制备
• 表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA， 抽提出的mRNA需要经过反转录酶的作用转变 为cDNA，同时进行荧光标记，标记好的cDNA 靶分子就可用于杂交。 • 基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子生物 学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的 抽提出组织中的RNA分子，保持实验数据信息 与组织中mRNA拷贝数信息之间的平行性。
基因芯片技术
Gene chip technology
第四章 利用基因芯片进行基因表达谱分析
内容提要： 第一节 基因芯片应用 一、基因芯片的应用范围 二、cDNA 芯片的应用范围 三、寡核苷酸芯片的应用范围 四、单双色荧光系统 第二节 阵列表达分析（Expression Analysis Arrays） 一、Unique PM-MM Probe Design 二、PM-MM探针设计的优势 三、单链和双链探针 第三节 基因芯片实验流程及方法 一、cDNA microarray（TWO CHANNEL MICROARRAY） 二、Affymetrix Expression Analysis 第四部分 数据分析流程图
第一节 基因芯片应用
基因芯片主要用于： RNA的检测: 表达丰度，剪切体 DNA的检测：SNP，CGH（比较基因组杂交） Methylation（甲基化作用） • cDNA 芯片主要用于：表达谱芯片，CGH • 寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯片
DNA
Gene Expression
RNA
• 生物素标记的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]的结合进行检测， 标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简 单方便，扫描成本较低。 • 荧光素标记的dNTP：Cy3-的dNTP ，Cy5-的dNTP • 同位素标记的dNTP • amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，掺入DNA和 RNA链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只 需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他 染料；但实验误差大。
RNA相对不稳定 Array
RNA:DNA Hybridized Array
Fragmented cRNA Target 裂解cRNA目标
Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]
影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素： 1．核酸浓度 2．探针的类型和长度 3．碱基组成 4．杂交液成分 （1）离子强度 （2）Formamide （3）季铵盐溶液 （4）杂交加速剂 5．不匹配序列 6．杂交时间 7．杂交温度
第二节 表达阵列分析
Unique PM-MM Probe Design（Affymetrix）
5´
AAAAA
3´
3’UTR
11-20 pairs of 25mer probe
Probe Pair Perfect Match Mismatch
Probe cell or feature
Chip
Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs Each probe pair consists of a perfect match and a mismatch oligonucleotide
Hybridization process of GeneChip
L L
L
L
Control Oligo B2 Eukaryotic Hyb.Control
L
Labeling cRNA fragment
Hybridizatio n mixture
hybridization
（16hour）
Data analysis
荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光源激 发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行检测。如 花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激发和发射波长分 别为：550/570和649/670。大部分扫描仪都能对这两 种荧光标记进行图像处理。 这种标记方法没有同位 素标记的限制；而且具有极高的灵敏度，能够进行定 量检测
Affymetrix Expression Analysis
mRNA Reverse Transcriptase（拟转录酶） cDNA 标记 cRNA in vitro transcription（体外转录）
Fragmentation of cRNA （cRNA的破裂） GeneChip Hybridization
• 双链探针：在液相条件下自我复性 从而大大降低与固着的靶DNA杂 交的机会，从而降低了探测灵敏度， 因此需更多的探针量。 • 单链探针 ：使杂交灵敏度提高
第三节 基因芯片实验流程及方法
cDNA microarray （TWO CHANNEL MICROARRAY ）
步骤： 1 提取mRNA 2 将mRNA逆转录 为cDNA 3 cDNA进行标记 4 杂交 5 将未杂交的cDNA 洗掉 6 激光扫描 7 结果分析
aCGH
SNPs
ChIP/LA
Alternate Splicing
miRNA
Chromosomes
DNA
Gene promotersFra bibliotekmRNA
mRNA variants
microRNAs
双色荧光系统
• cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片 • 实验组及对照组两种组织的mRNA在反转录成 cDNA的过程中分别标记上Cy3和Cy5两种荧光， 竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交 • 两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过 计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量， 通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中 基因表达是否有变化。
单荧光系统芯片的原理及流程图
探针A：biotin标记
探针B：biotin标记
杂交
扫描 两张芯片上 相同位点信 号比 数据分析、寻找差异表达的基因
单通道和双通道的比较
• 单通道实验结果重复性更好，使得比较不 同样品之间各种基因表达的相对比例是可 靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的 比较时，只需在多个样本中设置对照。点 样的一般是寡核苷酸。 • 双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但 是探针可以测序验证。双色法需在每次杂 交检测中设置对照，只能进行两个样品之 间的比较，多芯片之间的比较并不可靠。
信号叠加图
Hepacellular carcinoma/Normal liver
Red: 明显上调
Yellow: 差异不显著
Green: 明显下调
• 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 • 假阳性：验证 • 基因芯片结果需要传统方法的验证
本章小结:
1掌握单双色荧光系统及其比较 2 理解cDNA microarray的步骤及各步骤注意事项 3 理解PM-MM探针设计方法及其优势 4 掌握核苷酸的修饰常用标记物及其比较 5 掌握芯片数据分析流程
• 联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应 来完成线性扩增。 • PCR方法： 同一用量和限制循环次数的条件下， 通过RT-PCR可平行的扩增实验组和对照组的RNA 样本以满足实验要求并同时进行荧光标记。 • 基于T7的mRNA线性扩增：利用模板指导下的体外 转录反应来完成线性扩增。该方法能从1～50ng mRNA分子出发扩增出足够数量的cDNA靶分子。 这种扩增方法更具线性