《基因芯片技术》第4章利用基因芯片进行基因表达谱分析

噬菌体T7 DNA编码 的酶，对T7启动子序 列具有高度特异性， 不能识别其它生物来 mRNA 源的启动子。 是依赖于DNA的RNA 聚合酶，具有5'→3' 的RNA聚合酶活性， 以含有T7启动子序列 的双链DNA为模板， 以NTP为底物，合成 cRNA 与启动子下游的模板 DNA互补的RNA。
芯片杂交
样本制备
• 表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA， 抽提出的mRNA需要经过反转录酶的作用转变 为cDNA，同时进行荧光标记，标记好的cDNA 靶分子就可用于杂交。 • 基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子生物 学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的 抽提出组织中的RNA分子，保持实验数据信息 与组织中mRNA拷贝数信息之间的平行性。
逆转录：合成cDNA一链
• mRNA逆转录合成cDNA时用poly（dT）作 引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转 录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从 而减少对组织的需求，也避免了从总RNA中 纯化mRNA的工作 • 总RNA的纯度不如mRNA高，直接从总RNA 进行mRNA的逆转录在一定程度上会影响到 逆转录标记的效率，需要尽可能保证总RNA 的纯度
原核生物样品
第四节 数据分析流程图
原始图象文件(Cy3/Cy5) →定位 →栅格处理(griding)→数据自动提取 →数据入表达谱数据库 →原始数据标准化(normalization)
Ratio值分析
显著性表达差异基因
Cluster分析
具有相似表达谱基因
Experiment group/control :
RNA相对不稳定 Array
RNA:DNA Hybridized Array
Fragmented cRNA Target 裂解cRNA目标
Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]
影响杂交速率和杂交双链稳定性的因素： 1．核酸浓度 2．探针的类型和长度 3．碱基组成 4．杂交液成分 （1）离子强度 （2）Formamide （3）季铵盐溶液 （4）杂交加速剂 5．不匹配序列 6．杂交时间 7．杂交温度
PM-MM探针设计的优势
• 灵敏度提高 将已克隆的转录产物 以不同的浓度掺入到组 织样品中。经过标记的 样品与Affymetrix Genechip人类基因组 芯片杂交，在克隆转录 产物浓度低于8pM时， PM单独探针无法探测 出相应的浓度变化，而 与MM探针联合使用则 可以探测出。
单链和双链探针
• 将靶分子变性后，用预杂交液与芯片进行预杂交 1小时左右（ cDNA和长链寡核苷酸，42℃（50 ％甲酰胺）；短链寡核苷酸，50 ℃ ） • 杂交：温度同预杂交，标记好的样品与杂交仓内 反应14-18小时 • 洗片，扫描检测 • 杂交量依赖靶DNA和探针的浓度，当靶DNA浓 度一定时，荧光信号强度在一定范围内与探针量 成线性关系
第二节 表达阵列分析
Unique PM-MM Probe Design（Affymetrix）
5´
AAAAA
3´
3’UTR
11-20 pairs of 25mer probe
Probe Pair Perfect Match Mismatch
Probe cell or feature
Chip
Each gene is represented on the probe array by multiple probe pairs Each probe pair consists of a perfect match and a mismatch oligonucleotide
基因芯片技术
Gene chip technology
第四章 利用基因芯片进行基因表达谱分析
内容提要： 第一节 基因芯片应用 一、基因芯片的应用范围 二、cDNA 芯片的应用范围 三、寡核苷酸芯片的应用范围 四、单双色荧光系统 第二节 阵列表达分析（Expression Analysis Arrays） 一、Unique PM-MM Probe Design 二、PM-MM探针设计的优势 三、单链和双链探针 第三节 基因芯片实验流程及方法 一、cDNA microarray（TWO CHANNEL MICROARRAY） 二、Affymetrix Expression Analysis 第四部分 数据分析流程图
• 联合应用cDNA扩增和模板指导下的体外转录反应 来完成线性扩增。 • PCR方法： 同一用量和限制循环次数的条件下， 通过RT-PCR可平行的扩增实验组和对照组的RNA 样本以满足实验要求并同时进行荧光标记。 • 基于T7的mRNA线性扩增：利用模板指导下的体外 转录反应来完成线性扩增。该方法能从1～50ng mRNA分子出发扩增出足够数量的cDNA靶分子。 这种扩增方法更具线性
标记方法
• RNA样本不扩增进行标记：在反转录的体 系中加入Cy3或Cy5标记过的dNTP类似物， 通过反转录酶的作用，标记新合成的cDNA。 这种实验方法效率较低，对RNA样本需求 量大，通常要50～200μg总RNA，1～3μg mRNA • RNA样本扩增后进行标记
扩增mRNA（cRNA）靶分子
• 双链探针：在液相条件下自我复性 从而大大降低与固着的靶DNA杂 交的机会，从而降低了探测灵敏度， 因此需更多的探针量。 • 单链探பைடு நூலகம் ：使杂交灵敏度提高
第三节 基因芯片实验流程及方法
cDNA microarray （TWO CHANNEL MICROARRAY ）
步骤： 1 提取mRNA 2 将mRNA逆转录 为cDNA 3 cDNA进行标记 4 杂交 5 将未杂交的cDNA 洗掉 6 激光扫描 7 结果分析
Scan
Wash & stain
实验步骤： 1 样本制备：1）提取mRNA（mRNA的纯化方法） 2）将mRNA逆转录为cDNA（方法） 3）cDNA进行标记（样本量） 2 样本标记：1）核苷酸的修饰方法 2）标记方法：a）扩增mRNA（cRNA）靶分子 b）合成cDNA二链 3 预杂交 4 杂交：1）杂交过程 2）原核生物样品杂交过程 5 洗涤 6 染色（如生物素标记） 7 扫描 8 数据分析
第一节 基因芯片应用
基因芯片主要用于： RNA的检测: 表达丰度，剪切体 DNA的检测：SNP，CGH（比较基因组杂交） Methylation（甲基化作用） • cDNA 芯片主要用于：表达谱芯片，CGH • 寡核苷酸芯片主要用于：诊断芯片，SNP分型芯片
DNA
Gene Expression
RNA
双荧光系统芯片的原理及流程图
Cy3标记的A组织mRNA Cy5标记的B组织mRNA
混合探针
杂交
以两种波长的激光扫描 Cy3-532nm Cy5-635nm
数据分析、寻找差异表达的基因
单色荧光系统
• 较短的寡核苷酸芯片如Affymatrix芯片； 载有较长片段的寡核苷酸芯片也可使用， 如Illumina（可照明的）芯片 • 实验组和对照组分别用同样的荧光物质标 记（或生物素biotin），分别与芯片杂交， 即一张芯片只杂交一个样本 • 根据杂交结果判断待测样品同芯片上哪个 片段结合，通过与对照组的比较转化成基 因表达的改变
Affymetrix Expression Analysis
mRNA Reverse Transcriptase（拟转录酶） cDNA 标记 cRNA in vitro transcription（体外转录）
Fragmentation of cRNA （cRNA的破裂） GeneChip Hybridization
合成cDNA二链
1在反转录酶的作用下， 反转录生产cDNA一 条链。 2并在cDNA一链的3’ 端加上非模板的寡聚 C残基 3加入3’端带有寡聚G 的引物，可以结合到 cDNA的3’端，生成一 小段双链的cDNA 4再在DNA聚合酶的 作用下延伸 5加入RNase H，水 解掉RNA模板，以残 留的与cDNA一链配 对的短片段RNA为引 物，在DNA聚合酶的 作用下生成双链 cDNA
aCGH
SNPs
ChIP/LA
Alternate Splicing
miRNA
Chromosomes
DNA
Gene promoters
mRNA
mRNA variants
microRNAs
双色荧光系统
• cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核苷酸芯片 • 实验组及对照组两种组织的mRNA在反转录成 cDNA的过程中分别标记上Cy3和Cy5两种荧光， 竞争性地与芯片上的核酸片段进行杂交 • 两种波长的激光扫描读取竞争杂交的结果，通过 计算机处理就能确定芯片上基因所结合探针的量， 通过计算两种荧光强度的比值来判断两种组织中 基因表达是否有变化。
Hybridization process of GeneChip
L L
L
L
Control Oligo B2 Eukaryotic Hyb.Control
L
Labeling cRNA fragment
Hybridizatio n mixture
hybridization
（16hour）
Data analysis
样本量
• 从多少总RNA中进行逆转录才能满足实验 需要？非扩增：20微克；扩增：1微克 • 有些情况下，样本极为稀有，不可能得到 大量的mRNA靶分子 • 基因芯片实验对总RNA量的需求在一定程 度上限制了该技术的推广 • 发展方向：提高检测灵敏度，减少基因芯 片实验样本用量
核苷酸的修饰方法
荧光标记：标记分子在特定的波长范围被激光光源激 发出荧光，从而对含有标记分子的样本进行检测。如 花青素（Cyanin）Cy3、Cy5，其激发和发射波长分 别为：550/570和649/670。大部分扫描仪都能对这两 种荧光标记进行图像处理。 这种标记方法没有同位 素标记的限制；而且具有极高的灵敏度，能够进行定 量检测
• 生物素标记的dNTP ： 利用biotin-Streptavidin phycoerythrin [Fluorescent dye]的结合进行检测， 标记探针稳定，不失活，并能配用多种检测系统，简 单方便，扫描成本较低。 • 荧光素标记的dNTP：Cy3-的dNTP ，Cy5-的dNTP • 同位素标记的dNTP • amino allyl （氨烯丙基）NTP ：便宜，掺入DNA和 RNA链的效率与未标记的NTP相同；检测的时候只 需在它的氨基反应基团上偶联Cy系列的染料或其他 染料；但实验误差大。
信号叠加图
Hepacellular carcinoma/Normal liver
Red: 明显上调
Yellow: 差异不显著
Green: 明显下调
• 假阴性：一般不关心，但也要看实验目的 • 假阳性：验证 • 基因芯片结果需要传统方法的验证
本章小结:
1掌握单双色荧光系统及其比较 2 理解cDNA microarray的步骤及各步骤注意事项 3 理解PM-MM探针设计方法及其优势 4 掌握核苷酸的修饰常用标记物及其比较 5 掌握芯片数据分析流程
mRNA的纯化方法
• 两步法：从样本中制备总RNA，再从总RNA中 分离mRNA, 总RNA中包括rRNA、tRNA和 mRNA，其中90％以上是rRNA和tRNA，分离 mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的３’ 端都有polyA尾，用poly（dT）-纤维素亲和层 析纯化mRNA。 • 一步法：从组织样本中直接用poly（dT）-纤 维素亲和层析纯化mRNA，这种方法简便，但 RNA的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要 求不高时可采用
单荧光系统芯片的原理及流程图
探针A：biotin标记
探针B：biotin标记
杂交
扫描 两张芯片上 相同位点信 号比 数据分析、寻找差异表达的基因
单通道和双通道的比较
• 单通道实验结果重复性更好，使得比较不 同样品之间各种基因表达的相对比例是可 靠的。进行多个样品之间（芯片之间）的 比较时，只需在多个样本中设置对照。点 样的一般是寡核苷酸。 • 双通道（点样cDNA）重复性相对较差，但 是探针可以测序验证。双色法需在每次杂 交检测中设置对照，只能进行两个样品之 间的比较，多芯片之间的比较并不可靠。