活性氧及其检测方法
dcfh-da活性氧检测原理
dcfh-da活性氧检测原理DCFH-DA（Dichlorofluorescein Diacetate）是一种常用的细胞活性氧（ROS）检测试剂，常用于测量细胞内ROS的水平。
下面将详细介绍DCFH-DA活性氧检测原理。
活性氧（ROS）是包括超氧阴离子（O2^-）、过氧化氢（H2O2）和羟基自由基（·OH）等化学物质的总称，它们在细胞内被不同的酶系统产生，并在一定程度上参与调节细胞的生理功能。
然而，当细胞内ROS的产生量超过细胞应对能力时，ROS会产生一系列不利于细胞健康的效应，如氧化应激、炎症反应和细胞凋亡等，从而引发多种疾病的发生。
DCFH-DA是一种脂溶性染料，可以通过细胞膜进入细胞内。
一旦进入细胞内，细胞内酯酶会水解DCFH-DA成为非荧光染料DCFH （Dichlorofluorescein）。
DCFH在细胞内没有荧光，但当与ROS接触时，ROS会氧化DCFH成为强荧光荧光素（DCF）。
DCF既可以通过细胞色素c还原成DCFH，也可以通过氧化还原酶系统产生交替的氧化还原反应。
这使得DCF在细胞内荧光物质充分利用细胞内不同环境中ROS含量变化敏感性。
DCFH-DA活性氧检测的原理主要包括两个方面：首先，DCFH-DA通过脂溶性能够迅速进入活细胞，然后在细胞中被酯酶水解为DFCH，DFCH可以被氧化成强荧光的DCF。
然后，DCF可以发射可见光区的绿色荧光，并且荧光的强度和ROS的浓度呈正相关关系。
因此，通过测量DFC发出的荧光信号的强度，可以间接反映细胞内ROS的水平。
在实际的检测过程中，研究人员通常将DFCH加入到细胞培养基中，培养一段时间以使DFCH进入细胞内。
然后，用PBS（磷酸盐缓冲液）彻底地洗涤细胞，以去除细胞外的DFCH。
然后，通过显微镜或流式细胞术等方法观察细胞内的强荧光信号，并定量测量荧光强度。
通过与一系列的标准曲线比较，可以将荧光信号转换为ROS浓度。
综上所述，DCFH-DA活性氧检测利用DFCH的荧光属性实现了细胞内ROS水平的可视化和定量测量。
植物中活性氧的检测方法
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
植物中活性氧的检测方法
祁艳 王冬梅
（ 河 北 农 业 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 保 定 ０７１００１）
摘 要： 主要对超氧阴离子自由基（ Ｏ ２－·） 、过氧化氢（ Ｈ２Ｏ ２） 等活性氧的检测方法， 包括化学发光法、分光光度法、荧 光染色法， ＥＰＲ 波谱学方法、ＤＡＢ 组织染色法和电子显微技术检测法等进行了综述， 并简单介绍了最近发展起来的一些新 技术。
１．３ 荧光染色法 运用荧光染色技术可进行活体和离体亚细胞水
平的 Ｈ２Ｏ２ 检测。常用的荧光染料有 ２＇ ， ７＇ －二氯氢化荧 光 素 二 乙 酯 （ ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ， ＤＣＦＨＤＡ） 、 ４－ａｍｉｎｏａｎｔｉｐｙｒｉｎｅ、７－羟－６ 甲 基 香 豆 素 （ ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ） 、 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ（ Ｎ－ａｃｅｔｙｌ－３， ７－ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ） 及 高 香 草 醛 酸 （ ｈｏｍｏｖａｎｉｌｌｉｃ ａｃｉｄ） 等 。在 辣 根 过 氧 化 物 酶 的 催 化 下 ， Ｈ２Ｏ２ 可 氧 化 这 些 物 质 生 成 极 易 检 测 的 发 荧 光 的 物 质 ， 此 法 简 便 有 效 ， 应 用 广 泛 。有 研 究 者 用 荧 光染色法检测了豌豆（ Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍ） 叶片衰老过程中 线 粒 体 、过 氧 化 物 酶 体 中 的 Ｈ２Ｏ２［１０］及 萝 卜 （ Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ） 种 子 在 萌 发 过 程 中 经 光 照 、ＧＡ、ＡＢＡ 调 控 下 Ｈ２Ｏ２ 的 释 放 ［１１］。 Ｏｒｏｚｃｏ－Ｃａ′ｒｄｅｎａｓ 等 ［１２］曾 用 Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ 定 量 检 测 了 番 茄 （ Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） 叶 片 提 取 液 中 的 Ｈ２Ｏ２。 本 研 究 室 陈 晓 波 ［１３］以 激 发 子－原 生质体简化实验系统模拟叶锈菌侵染小麦叶片的 互 作 体 系 ， 利 用 荧 光 探 针 ＤＣＨＦＤＡ 标 记 Ｈ２Ｏ２， 并 借 助 激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 （ ＣＬＳＭ） 来 研 究 植 物 抗 病 过 程 中 微 丝 骨 架 与 ＲＯＳ 的 关 系 ， 取 得 了 良 好 效 果 ； 笔者用该法成功检测了受叶锈菌侵染的小麦叶片 中 ＲＯＳ 的 变 化 （ 待 发 表 ） 。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测试验方案一：实验原理活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。
而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。
细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。
检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。
Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。
二：实验步骤⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/ 升。
⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照，3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。
⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分盖住细胞为宜）。
⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。
⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。
洗涤完后每孔加入1ml 细胞培养液。
⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强弱即OD值。
⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml),对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。
⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后荧光的强弱即OD值。
三：数据处理实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100%阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD 值)/刺激前OD值×100%四：注意事项⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
活性氧（ROS）测定试剂盒说明书
②、波长设置：最佳激发波长 500(50015nm)，最佳发射波长 525 (53020 nm)。也可按照 FITC 荧光检
测条件检测。 ③、结果以荧光度值表示。
四、细胞样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
二、试剂组成及保存： 1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，20℃保存。 2、1ml 活性氧供氢体，4-8℃保存。
三、组织样本操作步骤：（可用激光共聚焦显微镜观察，也可用于流式细胞仪、荧光酶标仪、荧光分光度 计测定）
1、单细胞悬液制备： 方法 1、采用单细胞悬液制备仪制备单细胞悬液。 方法 2、酶消化法： 方法 3、机械法（网搓法）：
本试剂盒仅用于科研实验
1、直接将探针加入培养液中： ①、直接将 DCFH-DA 探针加入无血清培养基中：一般按照 1 ：1000 用无血清培养液稀释 CFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜， 通常对于 6 孔板的一个孔加入稀释好的 DCFH-DA 不少于 1ml。 ②、取一份不加探针，只加入培养基的细胞设为阴性对照管。阳性对照管：取一份已加入探针的细胞，同 时加入活性氧供氢体诱导细胞，推荐该试剂的工作浓度为 20～100µM。 ③、37℃孵育细胞 30min～几小时，通常为 30～60min 即可，孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA 浓度有关。一般阳性对照在刺激细胞 30 分钟左右，即可观察到明显的绿色荧光。 ④、吸去培养液，利用无血清培养液或者 0.01MPBS 反复吹打，肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成 片)转为透明，细胞层几乎全部吹打到 PBS 中。 ⑤、将细胞悬液全部收集到 1.5ml 离心管中。用无血清培养液或者 PBS 洗涤 2 次，以充分去除未进入细 胞内的 DCFH-DA。1000rpm/min，5min，吸净上清后加入 PBS 重新悬浮细胞进行测定。
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一个广泛存在于植物、动物和微生物细胞中的有害物质，在细胞内氧化还原反应中扮演重要角色。
活性氧包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）等，具有强氧化性。
活性氧在正常细胞代谢和维持细胞信号传导途径中发挥重要作用，但在细胞内过量生成会对细胞结构和功能造成损害，引发细胞衰老和死亡，促进炎症反应，以及导致一系列疾病的发生，包括心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等。
活性氧检测是研究活性氧与细胞过程和疾病发生关系的重要手段。
常用的活性氧检测方法包括荧光探针染色法、电子自旋共振（electronspin resonance，ESR）法、流式细胞仪法、化学法等。
下面是一种基于荧光探针的活性氧检测实验方案，具体步骤如下：材料：1.细胞培养样本（如细胞系或原代细胞）2.活性氧检测荧光探针（如2',7'-二氯二羟苯基-4'-巯基吡啶，DCFH-DA）3.PBS（磷酸缓冲盐溶液）4.离心管5.无菌1.5mL离心管6.显微镜玻片7.荧光显微镜8.细胞培养基实验步骤：1.把细胞培养在合适的培养基中，保持在37°C的恒温培养箱中，条件合适时使其达到对照组的80%～90%接种度。
2.将细胞分装到离心管中，每支40mL细胞悬液。
3.加入DCFH-DA溶液，终浓度为10mM，使细胞充分吸收荧光探针。
将培养管放入37°C恒温培养箱中孵育30分钟以进行探针进入细胞。
4.将细胞洗涤剂去除，用PBS洗涤细胞3次以除去多余探针。
5.加入1mL的PBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中，以进行离心。
去除上清液，避免细胞牵涉。
6.加入1.5mLPBS溶液，留出0.5mL的悬液放入1.5mL离心管中离心，去除上清液。
7.将取得的细胞悬液滴在显微镜玻片上，并加盖玻片。
在荧光显微镜下观察细胞活性氧的荧光信号强度。
DHE-ROS活性氧检测方法
本试剂盒可以用于各种真核培养细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测。本试剂 盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。
产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式
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化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博 DHE 活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针 DHE(Dihydroethidium)进行活性氧检
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流式细胞仪分析： 1、 对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。 用 0.5~1 ml 冰冷 PBS 重悬细胞（5~10 万）。 2、 采用 480~535 nm 波长激发，测定 590 nm~610 nm 以上的发射，细胞应可分成两个 亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的红色荧光。
DCFHDA活性氧的检测
产品号 BB-4101 BB-4102 BB-4201 BB-4202 BB-4203 BB-4204 BB-4131 BB-4133 BB-4122
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DCFH-DA 本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解 生成 DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存 在的条件下，DCFH 被氧化生成荧光物质 DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比， 检测 DCF 的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
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咨询邮箱：bestbio@
电话：021-33921235
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
产品说明书
检测： 对于原位标记探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光 光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光 度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察也可以。 使用 488nm 激发波长，525nm 发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF 的荧光光谱和 FITC 非常相似，可以用 FITC 的参数设置检测 DCF。
活性氧的检测方法
展。直到 1969 年 McCord 和 Fridovich[ 1] 发现 了清 除 超氧 化物 自由 基的 超氧 物 岐化 酶 ( SOD) 并研究其生物学作用, 提出了氧毒性 的超氧化物自由基学说后 , 人们才开始逐步 认识到自由 基在生物 体内存在 的危害 , 同 时 , 由于分子生物学的迅猛发展, 研究短寿 命的自由基的方法有所突破, 带动自由基生 物学的发展 , 使自由基生物学这门学科渗透 到医学、 植物生理学、 病理学等许多学科中, 显示出其极大的发展前景。 生物学、 医学最先研究活性氧的方法, 有脉冲射解 、 快速停流 、 顺磁共振和自旋 搜集技术 [
[ 3] .
第2期
陈惠萍等:
活性氧的检测方法
15
SOD 作用的底物 , 故原则上许多检 测 SOD 的方 法, 如化 学 发光、 NBT ( 氮 蓝四 唑 ) 还 原、 细胞色素、 连苯三酚、 肾上腺素都可以用 来检测生物系统的 O2. , 但干扰因素很多, 实 际应 用时困难不 少[ 4~ 6] 。 1976 年 Elest ner 等 提出用羟胺氧化反应来检测生物材料 的 O 2. 。此法灵敏 度高, 专一性好 , 药 剂价 廉。能同时检测大量样品。但叶绿素等色 素含量严重影响比色测定。王爱国等 为 了消除这些干扰 , 对实验步骤进行了改进, 并在分离时以乙醚取代正丁醇 , 检测了四季 豆幼苗叶片 叶绿体在光 暗下衰老 过程 O2 产生速率, 其结果与 McRac 等
1
、 水稻
[ 17]
、 眉豆
[ 18]
等植物上观察到
的现象类似。 4
1
O2 的检测 早在 1930 年 , M ulliken 通过 分子轨道
的计算就已 预言单 线态氧的 存在, 但 直至 1963 年 Khan 和 Kasa 发现 可以 用 NaOCl 和 H 2 O2 反应来产 生单线态氧才 使该领域 研究 得以迅速发展。用于1 O 2 检测的 方法 有化学发光法、 猝灭剂抑制法、 在2 H 2 O 中延 长寿命法、 产物分析法等几种方法 。其 1 中最直接的检 测方法是观察 O2 的化学发 光, 这种方法需要聚集较大量的1 O2 才能检 测出来。使用1 O 2 猝灭剂抑制 1 O2 参与的反 应, 最常使用的是类胡萝卜素, 它以物理方 式或猝灭 1O 2 而自 身并不发生任 何化学反 应。此外还有叔胺、 维生素 E 、 氮化合物、 四 甲基 乙烯、 2, 5
活性氧检测试验方案
活性氧检测试验方案活性氧检测是一种用于评估物质或生物体中产生的活性氧（ROS）水平的方法。
ROS是一类极具活性的氧化物质，可在正常细胞代谢中产生，并参与多种生理过程。
然而，当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力时，就会导致氧化应激，对细胞和组织造成损害，并与一系列疾病的发生和发展相关。
为了测量活性氧的水平，可以使用一系列的试剂和方法。
以下是一个可能的活性氧检测实验方案：实验材料：1.活体组织样本（例如细胞培养物、小鼠肝脏组织等）2.PBS缓冲液3.DCFDA（二氟荧光二乙酸盐）染料溶液4.活性氧产生剂（例如H2O2）5.抗氧化剂（例如维生素C）6.血红素（免疫染色用）实验步骤：1.准备工作：a.将DCFDA溶液按照说明书的要求稀释到适当的浓度。
b.用PBS缓冲液洗涤和预处理样本，去除可能影响实验结果的其他物质。
2.观察基础水平：a.取一小部分样本，不加任何试剂，放入显微镜观察台下。
b.使用适当的增强型荧光显微镜观察样本的荧光强度和分布。
3.活性氧产生实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的活性氧产生剂（例如H2O2），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
4.抗氧化剂实验：a.取适量的样本放入显微镜观察台下。
b.添加一定浓度的抗氧化剂（例如维生素C），混匀。
c.立即在显微镜观察荧光信号的变化。
d.记录荧光信号的强度和分布。
5.数据分析：a.使用图像分析软件测量荧光信号的平均强度和荧光染色的面积。
b.对每个样本的数据进行统计分析，如平均值、标准误差等。
c.使用统计学方法（如t检验或方差分析）比较不同处理组之间的差异。
总结：通过以上步骤，可以获得活性氧的水平，评估其在不同条件（如活性氧产生剂和抗氧化剂的存在与否）下的变化。
这个实验方案可以用于研究活性氧在细胞和组织中的作用，以及评估抗氧化剂的功效。
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法
活性氧的检测方法有多种，常用的方法有以下几种：
1. 化学反应法：通过活性氧与某些化学试剂（如氧化还原剂、荧光探针等）发生反应，生成有颜色或荧光的产物，再利用光谱仪或荧光光谱仪测定其吸光度或荧光强度，从而间接测定活性氧的含量。
2. 电化学法：利用电化学方法，如电极或电化学传感器，测定活性氧的产生量或消耗量，从而反映活性氧的含量。
3. 生物学方法：利用活性氧对生物体的影响进行测定，如细胞毒性实验、DNA 损伤实验等。
4. 光生光化学方法：利用活性氧对某些光敏染料或光敏细胞的氧化反应，通过测定产生的光信号，来定量测定活性氧的含量。
5. 磁共振法：通过核磁共振技术，利用活性氧与某些标记剂（如自由基捕获剂）的相互作用，从而测定活性氧的含量。
需要注意的是，不同的活性氧种类具有不同的化学性质和反应特点，因此选择合适的检测方法需要根据具体的活性氧种类和实验需求进行选择。
利用荧光探针探测细胞中的活性氧物质和自由基研究
利用荧光探针探测细胞中的活性氧物质和自由基研究细胞是生命的基本单位，细胞内的许多代谢程序都和氧相关。
但是，过量的氧会产生一些有害物质，如超氧离子和过氧化氢等，它们被称为活性氧物质和自由基。
过多的活性氧物质会损伤细胞的膜、DNA和酶等结构和功能，因此对于维持细胞正常代谢活动和防止细胞氧化伤害的研究非常重要。
近年来，荧光探针技术的应用越来越广泛。
荧光探针是一种通过荧光检测的手段来测定某种化学过程或生物过程的物质。
荧光探针通过与活性氧物质或自由基特有的反应结合，可以有效地测量细胞内的活性氧物质和自由基的含量和分布，是研究细胞氧化伤害的有力工具。
荧光探针常用的类型有三种，分别是实体荧光分子、荧光素探针和荧光蛋白探针。
实体荧光分子比较简单易得，但使用中有一定的局限性。
荧光素探针识别度较高、对活性氧物质和自由基具有很好的特异性。
荧光蛋白探针则是一种基于生物合成的荧光探针，通过蛋白质的结构和功能的改变来产生荧光信号。
利用荧光探针技术可以测量很多活性氧物质和自由基的含量和分布，常见的有超氧离子、一氧化氮、过氧化氢、硝酸盐和羟基自由基等。
其中，羟基自由基的类别较多，如流式细胞术中常用的DCFH-DA和DHE等。
DCFH-DA是一种非极性化合物。
在细胞内，它会被细胞内酯化酶水解成DCFH，被氧化后生成荧光产物 2',7'-二氯荧光素（DCF），从而测量细胞内活性氧物质的水平。
而DHE则可以通过荧光产物ethidium bromide（EBr）先后加上再用流式细胞仪扫描获得到的荧光后，可以得出有关细胞内自由基的信息。
除此之外，荧光探针还可以排除细胞内其他对荧光信号的干扰，如荧光素P的反应可以被氧气和其他自由基和活性氧消耗掉，从而可以增强测量的准确性。
总之，利用荧光探针探测细胞内的活性氧物质和自由基研究，为我们更好地了解生命活动提供了有效的手段。
在未来的科学研究中，荧光探针技术也将发挥更重要的作用。
活性氧测定的基本原理与方法
活性氧测定的基本原理与方法活性氧测定是指测定细胞或生物体中活性氧分子的浓度，活性氧是一类具有高度活性的氧分子，包括一氧化氮（NO）、超氧化物自由基（O2-）、羟基自由基（•OH）和过氧化物自由基（ROO•）等。
活性氧在生物体内的生成与清除是维持生物体正常代谢的重要环节，但过多的活性氧会对细胞结构和功能产生损害，甚至引发疾病。
1.超氧自由基（O2-）测定方法：超氧自由基的测定通常采用还原性品质荧光法。
超氧自由基与荧光染料2,7-二氨基苯基荧光素（DHE）反应生成有荧光属性的产物。
通过测定荧光强度来反映细胞或生物体中超氧自由基的浓度。
2.羟基自由基（•OH）测定方法：羟基自由基的测定通常使用t-Butanol为指示剂，通过和羟基自由基发生反应形成酚类产物，并通过分光光度计测定反应后酚类产物的吸光度来测定羟基自由基的浓度。
3.过氧化氢（H2O2）测定方法：过氧化氢是常见的活性氧物种之一，可以通过酶法或化学法进行测定。
其中酶法常采用过氧化酶（catalase）催化过氧化氢与4-氨基安替比林（4-AAP）反应生成有色产物，并通过分光光度计测定反应后产物的吸光度来测定过氧化氢的浓度。
4.一氧化氮（NO）测定方法：一氧化氮是一种重要的信号分子，在体内具有多种生理功能。
目前常用的一氧化氮测定方法是Griess法。
该方法将一氧化氮转化为一种比较稳定的化合物（例如亚硝酸盐），再通过与N-(1-Naphthyl)ethylenediamine反应生成有色产物，通过分光光度计测定反应后产物的吸光度来测定一氧化氮的浓度。
除了上述方法外，还有许多其他常用的活性氧测定方法，如电子自旋共振（ESR）法、化学发光法、荧光法等。
总之，活性氧测定方法可以根据具体的活性氧物种的特性和试剂的选择进行优化，通过测定与活性氧反应后的产物或信号来反映活性氧的浓度。
这些方法在生物医学研究和临床实践中具有重要的应用价值，可用于研究活性氧在生物体内的生成与清除机制，为研究相关疾病的发生机制和寻找相关的治疗方法提供参考。
活性氧测定各种方法及原理
评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法林金明3 屈 锋 单孝全(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘 要 综述了过氧化氢(H 2O 2)、一重态氧(1O 2)、超氧阴离子自由基(・O -2)以及羟自由基(・OH )等活性氧的测定方法。
侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几种方法的各自特点。
关键词 活性氧,化学发光,自由基,评述 2001211208收稿;2002205205接受本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(N o.20125514)1 活性氧氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到憋气的痛苦甚至死亡。
所以,自从1770年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来,氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。
可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。
特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。
1969年McC ord 与Fridovich 1发现,在生化反应过程中O 2获得一个电子还原生成超氧自由基(O -2),进而经过红血球的分离精制后获得O -2的清除灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase ,S OD )。
这一发现激发了大批的科学研究者致力于O -2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明S OD 在生理学上的意义。
同时由O -2衍生出来的过氧化氢(H 2O 2)、羟自由基(・OH )、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1O 2)也受到了人们的重视。
近10多年来,活性氧在人体内的作用受到人们极大的关注,报道了大量有关活性氧,特别是超氧自由基和羟自由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病,如癌、动脉硬化、糖尿病、心脑血栓、缺氧再灌注综合症、感染以及衰老效应等相关的研究论文和著作2～8,引起人们对活性氧的普遍兴趣,从而激发了人们更深入地去研究活性氧的各种特性,开发各种相关的抗氧化、抗衰老物质,在医学和分子生物学领域已成为一项广泛引起重视的研究课题。
光反应性活性氧(ROS)测定试验方法
附件5光反应性活性氧(ROS)测定试验方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范围本方法规定了化妆品用化学原料光反应性活性氧(RoS)测定试验的基本要求和方法。
本方法适用于预测化妆品用化学原料的潜在光毒性。
2试验目的预测化妆品用化学原料是否具有潜在光毒性。
3定义下列术语和定义适用于本方法。
3.1光反应性Photoreactivity化学物质由于吸收光子而与另一个分子发生反应的性质。
3.2光毒性Phototoxicity皮肤一次接触化学物质后，继而暴露于紫外线照射下所引发的一种皮肤毒性反应，或者全身应用化学物质后，暴露于紫外线照射下发生的类似反应。
本方法所述光毒性包括光刺激性、光过敏性和光遗传毒性。
3.3辐照度Irradiance照射到某一表面的紫外线或可见光的强度，单位为瓦每平方米(W∕m2)或亳瓦每平方厘米(m∖V∕cm2)o 3.4光照剂量Doseoflight照射到某一表面的紫外线或可见光的量[=强度X时间(秒)],单位为焦耳每平方米(J∕m2)或焦耳每平方厘米(J∕cm2)。
3.5活性氧种类ReactiveOxygenSpecies,ROS活性氧种类，包括单线态氧和超氧阴离子。
3.6单线态氧SingIetOxygen,SO由光辐照化学物质通过11型光化学反应产生的一种自由基。
3.7超氧阴离子SuperoxideAnion,SA由光辐照化学物质通过I型光化学反应产生的一种自由基。
4试验原理一些具有光反应性的化学物质暴露于紫外线时，吸收某一波长光子，诱导发色团激发，激发能量转移到氧分子上，发生光化学反应，产生活性氧（包括单线态氧SO和超氧阴离子SA）,活性氧是光毒性反应中的重要中间物质。
单线态氧和咪哇反应生成的过氧化物中间体对N,N-二甲基-4-亚硝基苯胺（RNo）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。
超氧阴离子与氯化硝基四氮嘎蓝（NBT）反应生成NBT+,其在56Onm波长下具有光吸收。
血液中活性氧含量计算公式
血液中活性氧含量计算公式活性氧是指一类具有较高活性的氧化剂，包括超氧阴离子、羟自由基、过氧化氢等，它们在机体内能够引起细胞损伤和炎症反应。
血液中的活性氧含量是一个重要的生理指标，它反映了机体内氧化应激的程度，对于了解机体抗氧化能力和疾病的发生发展具有重要意义。
血液中活性氧含量的计算公式可以通过测定血液中活性氧的浓度来得到。
一般来说，可以通过检测血液中超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性来间接反映血液中活性氧的含量。
这些酶类物质在机体内起着重要的抗氧化作用，通过测定它们的活性可以推断出血液中活性氧的含量。
具体的计算公式如下：活性氧含量 = SOD活性 + CAT活性 + GPx活性。
其中，SOD活性、CAT活性和GPx活性分别代表超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性。
这些酶类物质在体内具有重要的抗氧化作用，能够清除体内的活性氧，保护细胞免受氧化损伤。
测定血液中活性氧含量的方法可以采用化学发光法、比色法、电化学法等。
其中，化学发光法是一种常用的测定方法，它通过检测血液中活性氧的发光强度来间接反映活性氧的含量。
比色法则是通过检测血液中的色素变化来测定活性氧的含量，而电化学法则是通过检测血液中的电流变化来测定活性氧的含量。
血液中活性氧含量的计算公式可以帮助我们了解机体内氧化应激的程度，对于预防和治疗氧化应激相关疾病具有重要的意义。
通过测定血液中活性氧的含量，可以及时发现机体内的氧化应激反应，采取相应的干预措施，保护细胞免受氧化损伤，维护人体健康。
除了测定血液中活性氧含量，我们还可以通过其他方法来评估机体内氧化应激的程度。
例如，可以测定血液中抗氧化物质的含量，如维生素C、维生素E、谷胱甘肽等，它们能够中和体内的活性氧，保护细胞免受氧化损伤。
此外，还可以测定血液中氧化应激标志物的含量，如丙二醛、羰基蛋白等，它们是氧化应激反应的产物，能够反映机体内氧化应激的程度。
洗衣服中活性氧的测定原理
洗衣服中活性氧的测定原理活性氧是指具有高度活性的氧化物质，常见的活性氧有过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）、羟自由基（·OH）等。
在洗衣过程中，活性氧可以起到很好的清洁和漂白作用。
活性氧测定的原理主要有数种方法，下面将详细介绍几种常用的测定原理。
一、高锰酸钾法测定活性氧高锰酸钾法是一种常用的测定活性氧的方法。
其原理是活性氧与高锰酸钾（KMnO4）反应，活性氧将KMnO4还原成Mn2+。
利用KMnO4溶液由深紫色逐渐变为浅粉红色的反应，可以确定活性氧的含量。
具体操作：取一定量的洗衣水样品，用高锰酸钾溶液滴定至颜色变为浅粉红色止，记录滴定所用的高锰酸钾溶液体积V1。
同时进行空白试验，记录滴定所用的高锰酸钾溶液体积V0。
则活性氧的浓度可以通过以下公式计算：活性氧浓度=(V1-V0)×C/1000其中C为高锰酸钾的浓度。
二、过氧化氢测定法过氧化氢（H2O2）是洗衣过程中常用的漂白剂，可以有效去除衣物上的污渍。
过氧化氢测定法主要是通过氧化还原反应的原理来测定洗衣水中过氧化氢的含量。
具体操作：取一定量的洗衣水样品，加入氢氧化钠溶液，再加入碘化钾溶液，溶液中的过氧化氢与碘化钾反应生成碘离子，反应终止后加入淀粉溶液，使溶液呈现出深蓝色。
根据生成的碘离子的量可以计算洗衣水中过氧化氢的含量。
三、化学发光法测定活性氧化学发光法也是一种常用的测定活性氧的方法。
其原理是活性氧与荧光物质发生化学反应，产生发光现象。
通过测量样品发光的强度可以确定活性氧的含量。
具体操作：将洗衣水样品与荧光物质（如二甲基亚砜，DIM）混合，活性氧与DIM发生化学反应产生特定的发光，测量发光的强度，通过标准曲线可以确定活性氧的含量。
四、化学吸收光谱法测定活性氧化学吸收光谱法也是一种常用的测定活性氧的方法。
活性氧具有很强的氧化性，在其存在下可以氧化某些有色溶液，使其颜色发生变化。
通过测量变化后的溶液的吸光度，可以确定活性氧的含量。
植物中活性氧的检测方法_祁艳
生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ·技术与方法·２００７年第５期收稿日期：２００７－０３－３０基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０６７１２４４）；植物生理学与生物化学国家重点实验室开放课题资助项目（Ｎｏ．ＰＰＢ０４００６）；河北省自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３０３１８０；Ｎｏ．Ｃ２００５０００２２０）作者简介：祁艳（１９８１－），女，山西人，硕士，研究方向：植物抗病生理通讯作者：王冬梅，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｍｅｉｗａｎｇ６３＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ由于活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）具有很高的反应活性，它们可以与许多不同的化合物发生反应，根据反应生成物或者反应物的变化程度可以间接地对ＲＯＳ进行定量或者定性分析。
通常采用的方法有化学发光法、紫外－可见吸收分光光度法、荧光染色法及ＤＡＢ组织染色法等，电子显微技术检测法也受到研究者的青睐。
活体中ＲＯＳ的直接检测对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义。
目前能够用于解决该问题的方法比较有限，已报道的有电子顺磁共振技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＰＲ），又称电子自旋共振技术（ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｉｎｒｅｓｏｎａｎｃｅ，ＥＳＲ）。
ＥＰＲ是一种检测自由基的波谱学方法，可以直接检测Ｏ２－·，·ＯＨ等活性氧自由基及参与其形成的过渡金属离子的化学变化［１，２］，因此该法受到植物界工作者的广泛关注。
下面对目前实验室中所用到的检测植物体内ＲＯＳ的方法逐一进行介绍。
１植物体内ＲＯＳ的检测方法１．１化学发光法化学发光法是活性氧检测中常用的实验技术，其原理是化学发光试剂与活性氧反应生成激发态的产物，产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态而放出光子。
常用的化学发光试剂有鲁米诺（ｌｕｍｉｎｏｌ）、光泽精（ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）、甲壳动物荧光素（如海萤荧光素）等。
活性氧测定的基本原理与方法
评述与进展 活性氧测定的基本原理与方法林金明3 屈 锋 单孝全(中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘 要 综述了过氧化氢(H 2O 2)、一重态氧(1O 2)、超氧阴离子自由基(・O -2)以及羟自由基(・OH )等活性氧的测定方法。
侧重介绍活性氧的化学反应法、捕捉法和直接测定法的基本原理和最新的进展情况,并比较了这几种方法的各自特点。
关键词 活性氧,化学发光,自由基,评述 2001211208收稿;2002205205接受本文系中国科学院“百人计划”和国家杰出青年科学基金资助项目(N o.20125514)1 活性氧氧是生命运动过程中不可缺少的一种气体,人们一旦处于缺氧或者供氧不足的环境中,就会感到憋气的痛苦甚至死亡。
所以,自从1770年代初英国人Joseph Priestley 发现氧以来,氧一直被人们认为是一种对人体百益而无一害的气体。
可是,科学技术迅速发展起来的今天,我们知道,不管是空气中的氧还是水中的溶解氧都具有较高的氧化性,与一般的金属铁一样,处于空气中的人体各部位都在不断地受到氧的腐蚀而“生锈”,当然这种腐蚀与铁不同,它体现在人体的细胞水平上。
特别是人体各种器官随着年龄的增大不断地老化更是这种腐蚀“生锈”的直观表现。
1969年McC ord 与Fridovich [1]发现,在生化反应过程中O 2获得一个电子还原生成超氧自由基(O -2),进而经过红血球的分离精制后获得O -2的清除灭活酶,并命名为超氧化物歧化酶(superoxide dismultase ,S OD )。
这一发现激发了大批的科学研究者致力于O -2的生成过程、反应活性、毒性、生理和病理等等各方面的研究,去探索解明S OD 在生理学上的意义。
同时由O -2衍生出来的过氧化氢(H 2O 2)、羟自由基(・OH )、激发态氧(一重态氧或称单线态氧,1O 2)也受到了人们的重视。
近10多年来,活性氧在人体内的作用受到人们极大的关注,报道了大量有关活性氧,特别是超氧自由基和羟自由基与机体细胞的许多功能活动以及各种疾病,如癌、动脉硬化、糖尿病、心脑血栓、缺氧再灌注综合症、感染以及衰老效应等相关的研究论文和著作[2～8],引起人们对活性氧的普遍兴趣,从而激发了人们更深入地去研究活性氧的各种特性,开发各种相关的抗氧化、抗衰老物质,在医学和分子生物学领域已成为一项广泛引起重视的研究课题。