微生物学检测对象的特点12

微生物学检验一、微生物污染的因素有以下几方面：三、方法验证：在化学测试中，药品含量测定方法需要验证，与此相应，微生物检测方法也需要验证，尽管药品的微生物学检测方法在各国药典中均有规定。

但是，不同的检品、不同的仪器或材料及实验环境条件均可能对检验结果产生影响。

例如，当检测药品具有抑菌性时，它们会掩盖无菌药品已受污染的事实或造成低于实际污染水平的菌检结果；选用不适当的培养基，其促菌生长能力不符合要求，也会造成类似的后果。

另外，为了保证药品使用的安全性，有些药品加了一定的防腐剂，当对防腐剂的防腐性能进行验证试验时，微生物的种类、生长的状态、介质的pH等因素又对验证的结果产生影响，此外微生物学检测除具有一般的理化检查的特点与要求外，还有自身特点与要求，为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体检验方法进行验证，微生物检验方法验证的内容包括：微生物检测实验室的设施与设备验证，菌种的使用保存与管理验证，消毒剂的使用及效力验证，培养基、缓冲液和试剂验证及有效期的确认与验证，灭菌方法的验证，药品微生物学检验方法学验证，同化学检验方法验证的原理相似，将药品的微生物学检验方法具体应用于某一品种时，需进行方法验证，摸清微生物学检验方法适用的条件，即通过试验，寻找并确定合适的稀释材料、条件和方法。

在这一工作的基础上，通过验证试验，最终确认检验方法，批准成为正式检验方法。

4.2.4. 菌液组测定所加的试验菌数。

采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

4.2.5.试验组4.2.5.1.平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

4.2.5.2.培养基稀释法（平皿法）：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液分别注入N个平皿中，每个平皿再注入50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。

4.2.5.3薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌落数。

至少要一张膜。

4.2.5.4.离心沉淀集菌法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，如供试液含许多药渣，先以500转/分钟离心3~5分钟，取全部上清液，再以3000转/分离心20分钟，取下面1ml液体，并用稀释剂洗涤管底，将洗涤液与1ml液体一起采用平皿法或薄膜过滤法计数。

4.2.8.结果判断在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。

若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）≥70%。

照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证，使试验组菌回收率大于70%。

4.3. 控制菌检验方法验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的的控制菌检查方法测定。

若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检验方法应进行重新验证。

验证试验也可与供试品的控制菌检查同时进行。

4.3.1.验证用菌株大肠埃希菌（Esherichia coli）【CMCC(B) 44102】、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）【CMCC(B)26003】、乙型付伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）【CMCC(B) 50094】、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）【CMCC (B) 10104】验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

4.3.2.菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型付伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤培养基中，35～37℃培养18～24小时；分别取培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，制成每1ml含菌数10～100cfu 的菌悬液。

4.3.3.阴性菌对照组设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性。

方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。

阴性对照菌不得检出。

4.3.5.结果判断至少应进行3次独立平行试验。

阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。

若试验组检出试验菌，照该供试液制备方法和控制菌检查法进行该供试品控制菌的检查；若试验组未检出试验菌，应采用自然沉降法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。

当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下：◆培养基稀释法：取供试液2ml，每0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。

每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。

计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法计数规则报告菌数；控制菌检查时可加大增菌液的用量。

◆离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分钟离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。

◆薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，按薄膜过滤法测定其菌落数。

◆中和法：选取适宜的中和剂如磺胺类药物加入适当的对氨基苯甲酸，含重金属的药物在培养基内加入巯基化合物如硫乙醇酸钠-半胱氨酸，洗必泰制剂加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），卤素中加入硫代硫酸钠（0.1%）等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性后测定。

五、微生物学检测特点及影响因素微生物学检测对象的特点微生物学检验除具有一般的理化检查的特点与要求外，如准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。

还有自身特点与要求，造成药品微生物限度检验中的困难。

除微生物制剂外，药品微生物限度检查与药品中有效成分的含量测定显著不同，其检查对象具有以下特点：（1）活体易变性：菌体细胞在药品中处于不稳定状态，随存放时间延长死亡，也可在适宜条件下增殖。

一批液体制剂若不含防腐剂，它可能是出厂时合格，保存时不合格，最终又可能“合格”。

当保存条件稳定时，其污染量在一定时间内处于动态平衡，总体污染状况可以标准化的条件予以正确评估。

（2）分布不匀性：除产品在生产前期污染外，通常是局部的。

一批产品中不同瓶（盒）中污染状态会出现差异，其污染特别是致病菌通常是少量的。

正确的检验有赖于合理的抽样方法。

（3）多数处于受损坏状态：药品中微生物，受到原料处理、加工等过程的影响，或者药品本身对微生物的抑杀作用，使其受到一定程度的损坏，这些受到损坏的微生物用一般的方法检查，往往会出现假阴性或计数偏低的结果。

（4）生态环境多样复杂：污染菌的来源多样，种类多样，加之药品种类繁多、剂型成分复杂，同一种菌在不同的药剂中所测定的结果各不相同。

微生物学检测的特点以上检查对象的这些特点就造成药品微生物学检验具有以下特点：检查对象的未知性、不确定性、不均匀性、特殊性、影响因素的多样性。

（1）检验对象的未知性：药品的无菌检查与微生物限度检查（控制菌检测）因和大多数理化检测不同，它们往往都是未知的，不知是否有菌或含有检测菌，全凭检测结果判断，难度大。

（2）检查对象的不确定性：药品受外来微生物的污染，这种污染是可无可有；在有中又可多可少；其种类可以多样。

污染的情况依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定，非药品本身所固有，所以微生物限度检验的对象是不确定的。

这一点往往被忽视。

污染对药品而言是一个意外事件。

污染批号中的不合格品是一个随机变量。

（3）检查分布的不均匀性：不均匀性是不确定性的另一种表现形式，在一个批号内产品有的被污染，有的不被污染，分布不匀；在被污染的部分中有的数量极多，有的较少，种类上可以复杂或较单一。

这种不均匀性源于污染源的复杂性，原辅料污染、工艺污染、空间污染和操作人员污染等，构成污染量的多少差异，形成不均匀性。

再者微生物具簇团性，簇团大小、紧密程度是可遗传的，簇团的分散性差异极大，该特点无疑强化了不均匀性。

（4）特殊性：由于以上的特点造成了它与一般的理化检查不同的特殊性，如出分析结果慢、检查操作步骤繁杂等。

（5）影响因素的多样性因此，微生物限度检查必须遵循以下原则：①样品正式检验前必须保持原污染状态。

防止第二次污染和防止污染微生物的繁殖或死亡；②应有适当的供试液制备方法。

供试液的正确制备是保证检验结果准确可靠的前提；③检验方法准确可靠；④检验结果判断无误。

在药品微生物学检验中，不管是微生物限度检查、无菌检查还是药品防腐剂的抑菌效力测定、灭菌法、消毒剂的使用及效力验证、检测结果受多种因素影响，其中菌种制备、培养基、灭菌方法、抑菌的因素等备受关注。

在药检实践中，以下几种因素均可对微生物学检测产生影响：①药品本身的抑菌性或药品中防腐剂的抑菌性；②标准菌种制备与传代（菌种只能用到第六代）、种类及生长状态是否符合规范；③培养基的促菌生长能力；④培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）；⑤消毒或灭菌方法；⑥过滤系统（滤器、滤膜性质、材质）性能；⑦检验方法的正确与否。

以上种种因素等都会影响微生物的检测结果。

众所周知，培养基成分的不同来源，如不同品种的蛋白胨、牛肉膏、牛肉浸液对细菌的生长影响是有差异的；又如细菌总数测定，其中抽样及误差分析均缺少科学数据要求，增加了测定结果的不稳定因素。

在空气洁净度的菌落计数测定中，不同的测定方法其结果差异是很大的。

由于微生物检验方法，不少项目是执行国家标准的法定检验，同一个品种同一批号检测的不同结果，可能引起争议，其后果可想而知，同时也会造成与国际接轨的困难。

因此微生物培养条件是影响供试品菌检计数准确与否的重要因素。

同时应注意影响结果的两个方面：一是培养基本身的性质；二是培养条件。

通俗来说，培养基应具备广谱性，即有助于检品中所存活微生物的生长，因此要通过培养基灵敏度验证试验。