第七章 色谱法概述

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色谱法的基本概念
萃取液 石油醚
流动相 色谱柱 固定相
有巨大表面积的固定床
通过或沿着固定床渗滤的流体 玻璃管
待测物
CaCO3颗粒
色谱法的定义与分类
暗礁-固定相 顺流而下的艇-待测物
与待测物相互作用大小不同 行进速度发生改变
河水-流动相
负载,携带组分前进
差速迁移
色谱法的定义与分类
色谱法的定义 功能:分析、制备 核心:分离 基础:利用物质物理、化学性质不同将物质分开
总体平均来看这一组分的分子 在固定相中停留的时间更长 色谱柱对待分离组分保留能力强
色谱分离的基本理论
4.保留值(保留比, retention ratio, R’)
组分在流动相中出现的几率 表示为在流动相中停留的时间分数 体现组分在色谱柱中保留的程度
nm R nm ns
'
组分的移动速率 F L L F ,u 流动相的移动速率 u tm t s tm t(流动相) m tm t (固定相) s
相同操作条件下某组分i与标准物质s的调整保留值之比
ri,.s
ri,.s
t t
' Ri ' Rs
V V
' Ri ' Rs
ki K i ks K s
• 选择因子(selective factor, α )
衡量固定相选择性的指标 色谱分离中滞留能力大与小的组分的调整保留值之比
' ' t R1 t R2
1) 组分的性质 2) 溶剂的极性 3) 温度
• K在不同色谱机理中的含义不同:
分配色谱中→分配系数 吸附色谱中→吸附平衡常数 离子交换色谱中→交换常数或称选择系数
• 分配系数比表示两组分在给定柱子上的选择性
色谱分离的基本理论
3.保留因子(retention factor, k’)
又称为容量因子、分配比 一定温度和压力下 平衡状态时组分在固定相与流动相中的物质的量之比 用Vs和Vm分别表示色谱柱中固定相和流动相的体积,则:
色谱法中的基本术语
2. 利用峰面积和峰高定量
V/mAu
B
C
A
0 V/mAu t/min
X
Peak Area
0 V/mAu
t/min
X
Y
Hight
t/min
0
定量依据 峰面积/峰高 ∝ 待测物浓度
准确、可靠
色谱法中的基本术语
3. 利用调整保留值和峰宽评价色谱柱分离效能
核心:分离 如何评价分离能力?
33
tm t0 1 R ' tm t s t R 1 k
'
'
?若换做调整 保留时间tR‘
Vs t R t0 (1 k ) t0 (1 K ) Vm
色谱法重要公式
固定色谱条件(Vs和Vm一定、流速一定、温度一定):
tR仅取决于K
6. 其他相关概念 • 相对保留值(relative retention, r)
2
W1/2
h 0.607h
基线-Base line
A
进样-injection
1/2h
0 t0 (V0)
tR'=tR-t0 (VR'= VR- V0) tR (VR)
2 Wb
t/min
色谱法中的基本术语
色谱图解读 1. 利用保留值定性
V/mAu
X
0
V/mAu
t/min
B
C
A
0
t/min
只能作为辅助手段——不可靠、不依赖
32
色谱分离的基本理论
5. K、k、R’三者关系
CmVm R CmVm CsVs
'
1 1 Vs 1 k' 1 K Vm 1 ' F uR u VS 1 K Vm
取决于分配系数K K值相同→组分不能分离 K值不同→组分在柱上移动速度不同
色谱是不同迁移现象的最终产物
Consden
纸色谱
Van Deemter
Golay
Moore
色谱速率理论
毛细管柱气相色谱
凝胶渗透色谱
1958
1964 1965 1975
Giddings
Small
总结和发展了色谱理论,奠定色谱理论基础
新型离子色谱
1981
如今
Jorgenson
毛细管电泳
逆流色谱、超临界流体色谱、亲和色谱、障碍滑雪色谱、……
色谱法的由来、发展和应用
例3. 果蔬中的农残检测
色谱法的由来、发展和应用
例4. 环境监测
色谱法的由来、发展和应用
例5. 生命分析
色谱法的由来、发展和应用
例6. 药物分析
抗菌药物分析
手性药物拆分
色谱法的由来、发展和应用
例7. 中药分析
中药指纹图谱 “丸散膏丹,神仙难辨”
建立中药质控标准
色谱法的定义与分类
色谱分离的基本理论
色谱分离中决定相邻组分分离好坏的因素
1. 两组分保留值之差
组分在色谱柱内迁移 速率的差异 决定于两组分与固定 相、流动相之间相互 作用的差异
2. 两组分峰宽
反映了组分区带在移 动过程中的扩张程度 很大程度上取决于色 谱的分离条件
色谱分离的基本理论
色谱过程几个常用概念 1.分配平衡 2.分配系数K 3.容量因子k’ 4. 保留比R 5. K、k’、R之间关系 6. 其他相关概念 7. 柱效
按流动相状态
按色谱柱外形
柱色谱 平板色谱 (纸、薄层、薄膜)
色谱法的定义与分类
色谱法的特点 高分离度
高速度 高灵敏度 高容量
高灵活性 条件温和
快速准确分析 作为检测手段 作为制备手段
分离方式众多
非破坏性检测
色谱法中的基本术语
常用基本术语
萃取液 流动相
色谱柱 C B 固定相 A 紫外-分光光度 示差折光 热导 色谱图/色谱流出曲线 „„ 检测器
24
色谱分离的基本理论
1. 分配平衡
25
色谱分离的基本理论
2. 分配系数(partition coefficient, K)
一定温度和压力下 固定相与流动相中溶质分子处于动态平衡 组分在两相间达到分配平衡 该组分在固定相(S)中与在流动相(m)中的浓度之比为常数 此常数称为分配系数,常表示为K
组分在固定相中的浓度 Cs K = 组分在流动相中的浓度 Cm
L 设色谱柱柱长为L,则: n H L一定时: H↘→n↗ →分配平衡的次数↗ →柱效↗
色谱分离的基本理论
4. 理论塔板数n与色谱峰峰宽W的关系-柱效方程
t t t n R 5.54 R 16 R W W1/ 2 L L W H n 16 t R
1)色谱柱由一系列连续、等距的水平塔板组成 2)每层塔板内部组分可在两相间瞬时达分配平衡 3)流动相不连续,每次进入量为一个塔板体积 4)样品和流动相同时加在第1个塔板上 5)样品垂直于前进方向的扩散可忽略 6)分配系数在各塔板上是常数,与组分浓度无关
色谱分离的基本理论
实质
组分在两相间的连续转移过程
如何定量 描述柱效 柱效影 响因素
需要从色谱 理论上解释 能解释这一现象的理论首推塔板理论
色谱分离的基本理论
塔板理论(plate theory)
为研究谱带在柱内的展宽机理设计的一种物理模型
核心 把色谱柱比作一个精馏塔
用精馏塔中塔板的概念描 述组分在两相间分配行为
热力学角度
41
色谱分离的基本理论
1.基本假设
第七章 色谱法概论
1 色谱法的由来、发展和应用 2 色谱法的定义、分类与特点 3 色谱中的常用基本术语 4 5
色谱法基本理论 色谱定量分析方法
CH3 CH3
[O]
[O] CH3 COOH
CH3 + CH3
COOH COOH
CH3 + COOH COOH COOH
分光光度法—总吸光度 酸碱滴定法—总酸度
物质与两相(固定相和流动相)之间相互作用不同
分离机理不同
色谱法的定义与分类
色谱法的分类
吸附色谱:在固定相上吸附能力强弱
分配色谱:在两相中的分配系数不同
按分离的机理
离子交换色谱:对离子交换剂亲和力大小 尺寸排阻色谱:分子大小不同 „„ 按固定相状态 颗粒:气-固 液膜:气-液 液相色谱(同上) 气相色谱 超临界流体色谱(同上)
保证快速分离前提下色谱柱足够长
色谱分离的基本理论
实验证明:分离效果和峰宽度及出峰时间相关
谱带逐步扩张 (band broadening)
组分A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓
39
色谱分离的基本理论
7. 柱效(column efficiency)
反映色谱柱作为一个分离器件的效能 以组分谱带的宽度表征
2 2 2 2
tR一定时:
色谱峰越窄,即W或Wl/2越小→理论塔板数n越大 →理论塔板高度H越小→柱的分离效率越高 理论塔板数 n 和理论塔 板高度H称为柱效指标
色谱分离的基本理论
5. 有效塔板数与有效塔板高度 若扣除死时间影响,用tR’代替tR: 计算出的理论塔板数称为有效塔板数(n有效)
“像光谱中的光线一样,色素混合物的不同组分有规 律地排列在碳酸钙柱上而彼此分离,由此可以进行定 性和定量鉴定。我们称这一制备方法为色谱法。” ——Tseet,《德国植物学报》, 1906.
CaCO3 玻璃柱
色谱法的由来、发展和应用
色谱法的发展
年代 1906 1931 1938 发明者 石醚 发明的色谱方法或重要应用 萃取物
W0.05h-0.05倍峰高处的峰宽 A和B-色谱峰前沿与后沿和色谱峰顶点至基线垂线之间距离 《中国药典》规定: 对称因子0.95~1.05之间的色谱峰为对称峰 小于0.95为前沿峰,大于1.05为拖尾峰
色谱分离的基本理论
两组分完全分离的条件
两组分的分配系数K必须有差异
区域变宽的速度小于区域分离的速度
物理意义: 溶质在互不相溶两相中达到溶解平衡时,在两相中的浓度之比为常数
色谱分离的基本理论
27
色谱分离的基本理论
• 色谱过程是: 物质在相对运动的两相间分配平衡的过程 • 混合物中两组分分配系数K不等→被流动相携带 移动的速度不等→组分分离
分配系数K不相等是分离的前提
28
色谱分离的基本理论
• K的影响因素—由物质热力学性质决定
CH3 + COOH
COOH COOH
分离 蒸馏、分馏、结晶、沉淀、过滤、萃取、„„ + 检测 分光光度、酸碱滴定、„„ ? 问题1 色谱法
色谱法的由来、发展和应用
色谱法的由来-Tsweet茨维特
萃取液 石油醚
1901年 硕士论文工作中偶然发现现象 1903年 华沙会议上首次做了原理性描述 1906年 文章中首次使用“Chromatography”
α 2.1
α≥1:
' t2 V2' k 2 K 2 ' ' t1 V1 k1 K1
α ↗ →两组分分离得越开→色谱柱对组分的选择性越高 α =1→两组分完全重叠→固定相对待分离组分无选择性
• 拖尾因子(tailing factor, T )
衡量色谱峰对称性
W0.05h A B T 2A 2A
响应信号
记录仪
电信号
色谱法中的基本术语
河水 相同速度 艇A---礁石 ---艇B 相同速度 流动相 组分A-固定相 -组分B 无相互作用 有相互作用
C B
A
V/mAu
B C
1/2 W1/2 = √ 2ln2 1/2 Wb = 2
t0 含义:流动相流经色谱系统所需时间 测量:与固定相无作用的组分的保留时间
分解
间歇地在单个塔板中的分配平衡过程
用分离过程的分解动作说明色谱过程
色谱分离的基本理论
2. 理论塔板高度 (height equivalent to a theoretical plate, H) 每层塔板的高度
3. 理论塔板数 (number of theoretical plates, n) 色谱柱所具有的塔板数,即组分平衡次数
色谱法的由来、发展和应用
石油化工
中药研究
色谱法的应用
可测物质广:几乎所有有机化合物+部分无机化合物
食品安全
行业范围广:几乎覆盖了各个行业的分析检测
药物分析
质量监督 环境监测
生命科学
色谱法的由来、发展和应用
例1. 石油化工厂的炼厂气中主要成分分析
色谱法的由来、发展和应用
例2. 奶粉中三聚氰胺含量测定
组分在固定相中物质的量 k 组分在流动相中物质的量 ns cs Vs Vs K K nm cm Vm Vm b
Vm b ——相比 Vs
反映各种色谱柱型特点的参数
色谱分离的基本理论
溶解
吸附
离子交换
k'值均决定于
二相中组分的相对粒子数 k'值大
固定相中的粒子数比流动相中的粒子数多
Tsweet Kuhn, Lederer
Izmailov, Shraiber Taylor, Uray
用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 色谱分离了a-、b-和g-胡萝卜素。色谱法开始为人们所重视 薄层色谱
1938
1941 1944 1956
离子交换色谱
碳酸钙wk.baidu.com
玻璃柱
Martin, Synge 色谱塔板理论;液-液分配色谱;预言了气相色谱的诞生
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