糖化酶

我国糖化酶的研究概况

糖化酶是世界上生产量最大应用范围最广的酶类，介绍了糖化酶的结构组成、特性、生产、提取、活力检测以及提高酶活力的研究。主要的内容包括：一、糖化酶的简介

糖化酶是应用历史悠久的酶类，1 500年前，我国已用糖化曲酿酒。本世纪2O年代，法国人卡尔美脱才在越南研究我国小曲，并用于酒精生产。50年代投入工业化生产后，到现在除酒精行业，糖化酶已广泛应用于酿酒、葡萄糖、果葡糖浆、抗菌素、乳酸、有机酸、味精、棉纺厂等各方面，是世界上生产量最大应用范围最广的酶类。

糖化酶是葡萄糖淀粉酶的简称(缩写GA或G)。它是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。其主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解a一1，4糖苷键，切下一个个葡萄糖单元，并像B一淀粉酶一样，使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成B—D一葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a一1，6糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a一1，3连接的碳链，但水解a一1．4糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。

二、糖化酶的结构组成及分类

糖化酶在微生物中的分布很广，在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得，从细菌中也分离到热稳定的糖化酶，人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶。不同来源的淀粉糖化酶其结构和功能有一定的差异，对生淀粉的水解作用的活力也不同，真菌产生的葡萄糖淀粉酶对生淀粉具有较好的分解作用。

糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60 000 到1 000 000间，通常碳水化合物占4％ 18％。但糖化酵母产生的糖化酶碳水化合物高达80％，这些碳水化合物主要是半乳糖、葡萄糖、葡萄糖胺和甘露糖。

三、糖化酶的特性

1、糖化酶的热稳定性

在糖化酶的热稳定性机理及筛选热稳定性糖化酶菌株上。工业上应用的糖化酶都是利用它的热稳定性。一般真菌产生的糖化酶热稳定性比酵母高，细菌产生

的糖化酶耐高温性能优于真菌。在50％的淀粉溶液中，70 ℃下酶完全稳定，而且在10％酒精液中仍很稳定。即使在85℃c下处理l h其酶活性仍保持50％，这种酶不受Ca ，EDTA和α-，β-，γ-环状糊精的影响。

2、糖化酶的pH稳定性

一般糖化酶都具有较窄的pH值适应范围，但最适pH一般为4.5～6.5。不同微生物菌株产生的糖化酶其耐热性、pH稳定性各不相同。真菌、细菌产生的糖化酶由于耐热性较高，巴氏灭活处理不能使酶失活，在啤酒生产中易影响终产品的风味。

3、糖化酶的底物特异性

糖化酶对底物的水解速率不仅取决于酶的分子结构，同时也受到底物结构及大小的影响。许多研究表明，碳链越长，亲和性越大。但是各糖化酶组分对这些生淀粉的作用能力均小于对可溶性淀粉的作用能力，估计作用能力均降低与酶对底物作用的Km值上升有关。同时也表明了糖化酶对底物的亲和力，除了与酶本身的结构有关外，还与寡糖链本身的长度有关。

四、酶的发酵生产

1 糖化酶产酶菌种

主要是霉菌，我国多用红曲霉、黑曲霉以及根霉。根霉以固体发酵为主，红曲霉和黑曲霉多以深层液体发酵生产。

2 生产方法

2.1 黑曲霉固体发酵法

工艺流程：

试管菌种一三角瓶款曲扩大培养一帘子曲种一通风制曲一成品。

2.2 液体深层发酵法

工艺流程：

试管斜面种子一种子扩大培养一发酵一过滤一浓缩一千燥一粗酶剂。

发酵用基质：碳源为玉米粉、甘薯粉等，有机氯源常用玉米浆、豆饼粉和酵母膏等，常用的无机氯源(NH4)2S04、NH4N03和NH3等，无机盐添加MgS04“7H20、KH2PO4等。菌种不同，产生糖化酶的最适pH值也不同，黑曲霉为4．0～5．0，用黑曲霉生产糖化酶一般控制温度30℃～35℃。

五、糖化酶成品的提取工艺

1、成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2种，而固体酶的制备方法又可分为盐析

法、有机溶剂沉淀法和附吸法等，采用一条合理的提取工艺，可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成本。

具体流程如下：

2、目前国内对液体酶产品采用的浓缩方法有2种，一种为依靠热源来蒸发产品中的水分。另一种为利用渗透膜超滤除去产品中的水分。

比较上述2种方法，前者设备投资大、耗能多；而后者投资少、耗能低，且操作简单、清洗方便、维修及更换成本低，产品收率高。渗透膜超滤浓缩方法，絮凝工艺是提取工艺中最关键的一步，直接决定板框过滤等工序的工作与产品的质量。

渗透膜超滤浓缩法流程如下：

六、糖化酶活力测定方法

目前检测糖化酶活力最普遍的方法是用淀粉作底物，通过测定被酶分解产生葡萄糖的含量来定量分析糖化酶的活力。但针对一些特殊情况还有另外一些方

法，如复合糖化酶中作为底物的淀粉同样能被其他类型酶制剂所分解，要是用麦芽糖作底物，相比淀粉底物方法而言，麦芽糖只能被糖化酶专一分解。还有在筛选高活力糖化酶菌株时，采用Starch—PAGE电泳活性染色法，就可既简便、准确、灵敏，又可节约大量试剂。

1、用淀粉底物法测定糖化酶活力

1.1方法原理

糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4葡萄糖苷键生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。

1.2 酶活力定义

lg固体酶粉（或1mL液体酶)于40℃、pH4.6的条件下，l h分解可溶性淀粉，产生lmg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U／g(U／mL)表示。

2、用麦芽糖底物法测定糖化酶活力

2.1 方法原理

糖化酶水解麦芽糖生成D-葡萄糖。生成的葡萄糖可通过与葡萄糖脱氢酶反应而测得，葡萄糖脱氢酶（GlucDH)试剂中加入变构酶可将α-D-葡萄糖转化成β-D-葡萄糖。在GlucDH的作用下，β-D-葡萄糖与NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应生成NADH，后者即等于葡萄糖初始浓度，可用于分光光度法在340nm 测定其数值。

2.2 酶活力定义

麦芽糖20 eeL，pH4．30，反应温度37℃，反应时间30min下，每分钟裂解1 p,mol麦芽糖所需酶量。

3、快速检测糖化酶活力的电泳活性染色方法

根据糖化酶能水解淀粉的性质，采用Starch—PAGE，在分离胶中加入淀粉作为糖化酶的作用底物，电泳结束后，在醋酸钠缓冲液中浸泡适当时间，使糖化酶所在部位胶板中的淀粉被酶解，其余部分的淀粉依然存在，碘液染色后，糖化酶存在的部位是无色透明的，没有被水解的部位被染成蓝色。经实验证明胶板中的淀粉浓度6％，醋酸钠的浸泡时间3 h-4 h，碘染时间1 min为宜。

采用Starch—PAGE电泳活性染色筛选高活力糖化酶菌株，活性染色区带的透明程度与酶液的活力呈正相关性，区带越透明，表明酶活力越高。

七、提高糖化酶活力的研究

几十年来我国科研工作者为提高糖化酶的活力进行了不懈的努力，常规的物理及化学诱变的方法仍然是方便有效的途径。主要成就有：

1、黑曲霉AN一149菌进行自然分离、紫外线和NTG的复合诱变处理，得到了一株高产糖化酶的菌株WG-93，经30L发酵罐试验，酶活力达29 kU／mL（糖化酶生产发酵水平为12 kU／ml)。

2、对生淀粉糖化菌黑曲霉S一1原生质体采用(k1=260 am，入：=266 nm)能量为8 n1J的激光直接照射，得到高酶活力的生粉糖化酶突变株，比出发株酶活力平均提高37．4％，最高突变株酶活力达到74．5 U／L，比出发株提高91％。

3、以黑曲霉523原生质体为对象，经激光、紫外线和亚硝基胍复合诱变，选育出生淀粉糖化酶高产突变株黑曲霉NL一3，其生淀粉酶活力为156 U／mL。

八、糖化酶研究的展望

虽然糖化酶的研究已经达到很高的水平了，但是仍有许多问题尚待进一步探索。如：

糖链在糖化酶活性、稳定性及构象状态中所起的作用，进一步阐明糖化酶的多型性原因及糖化酶的热稳定性机制。

提高糖化酶的活力，利用诱变、DNA重组技术或其他方法获得优良菌株，提高糖化酶基因在受体菌中的表达水平等，进一步优化糖化酶纯化工艺及保存条件；另一方面，诱变筛选耐热糖化酶产生菌或克隆耐热糖化酶基因，将是一个重要方向，因为耐热糖化酶在发酵业的应用将会大大降低能源消耗，从而降低生产成本，将给糖化酶在工业中的应用开辟更为广阔的前景。