第九章 核酸等温扩增技术
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• 快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性．避免 了温度循环而造成的时间损失．核酸扩增在l h内均可 完成。
• 高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异 性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进 行核酸扩增。故其特异性极高。
• 高灵敏度，对于病毒扩增模板可ຫໍສະໝຸດ Baidu几个拷贝，比PCR 高出数量级的差异。
LAMP引物设计
• 主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个 不同的位点设计4种引物。
• FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和 F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补， F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。
LAMP的缺点
•由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最 好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能 进行长链DNA的扩增。 •由于灵敏度高。极易污染而产生假阳性结果。 故要特别注意严谨操作。 •在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均 逊色于传统的PCR方法。 •引物设计复杂。
第九章 核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术的定义及特点
• 核酸等温扩增技术是一类分子生物 学技术的总称，它们能在某一特定 的温度下扩增特定的DNA或者RNA。
• 与PCR技术相比核酸等温扩增对仪 器的要求大大简化，反应时间大大 缩短，更能满足快速简便的需求。
核酸等温扩增技术的分类
– 环介导等温扩增技术（LAMP） – 依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA） – 滚环扩增技术（RCA） – 单引物等温扩增技术（SPIA） – 依赖于解旋酶的等温扩增技术（HAD） – 链替代扩增技术（SDA） – 快速等温检测放大技术（RIDA） – 切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEMA）
• B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由 B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间 温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状 态。因此，DNA在此温度下合成是可能 的。利用4种特异引物依靠一种高活性链 置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成 在不停地自我循环。
依赖于核酸序列的扩增
• 依赖于核酸序列的扩增（nucleic-acid sequence-based amplification, NASBA)是一项 以RNA为模板的快速等温扩增技术。
• 由加拿大Can-gene公司1991年首先发明。 • 主要用于RNA检测，具有高度敏感性和特异
产物检测的原理
• 电泳分析 • 荧光检测 • 浑浊度检测
LAMP扩增产物电泳分析
肉眼观察LAMP结果
DNA与SYBR Green结合现示绿色
肉眼观察显白色沉淀
LAMP的优点
• 操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，产 物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。 对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就 可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
LAMP的特点
• LAMP克服了传统PCR反应需要通过反 复热变性获得单链模板的缺点，避免了 反复升降温的过程，实现了恒温条件下 的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和 扩增效率。
• 15-60min内可扩增出109-1010倍靶序列拷 贝，得到500ug/ml的目的DNA。具有简 单、快速、特异性强的特点。
扩增分两个阶段
• 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的 互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解 离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与 模板F2c结合。在链置换型DNA聚合酶的作用下向 前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP 上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配 对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与 B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结 构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身 为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该 结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段
• 是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP 与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离 出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’ 末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行 DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条 新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂 交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一 倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB， 它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成， 周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎 环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA 为扩增靶序列的交替反向重复序列。
环介导等温扩增技术（LAMP）
• 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是2000年日本 研究人员Notomi等发明的一种新型体外等温 扩增特异性核酸片段的技术。
• 该技术主要利用两对特殊设计的引物和具有 链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板 两端引物结合处循环出现环状单链结构，从 而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结 合，并进行链置换扩增反应。
LAMP技术的原理
LAMP主要是利用4种不同的特异性引物识 别靶基因的6个特定区域，在等温条件进行 扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步 完成，所有靶基因序列的检测可只通过扩增 产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利 用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利 用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应 用浊度仪检测沉淀浊度来判定。
• F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3 区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
• BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由 B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互 补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。
• 高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异 性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进 行核酸扩增。故其特异性极高。
• 高灵敏度，对于病毒扩增模板可ຫໍສະໝຸດ Baidu几个拷贝，比PCR 高出数量级的差异。
LAMP引物设计
• 主要是针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个 不同的位点设计4种引物。
• FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和 F1C区域组成，F2区与靶基因3’端的F2c区域互补， F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列相同。
LAMP的缺点
•由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最 好在300 bp以内。>500 bp则较难扩增。故不能 进行长链DNA的扩增。 •由于灵敏度高。极易污染而产生假阳性结果。 故要特别注意严谨操作。 •在产物的回收鉴定、克隆、单链分离方面均 逊色于传统的PCR方法。 •引物设计复杂。
第九章 核酸等温扩增技术
核酸等温扩增技术的定义及特点
• 核酸等温扩增技术是一类分子生物 学技术的总称，它们能在某一特定 的温度下扩增特定的DNA或者RNA。
• 与PCR技术相比核酸等温扩增对仪 器的要求大大简化，反应时间大大 缩短，更能满足快速简便的需求。
核酸等温扩增技术的分类
– 环介导等温扩增技术（LAMP） – 依赖于核酸序列的扩增技术（NASBA） – 滚环扩增技术（RCA） – 单引物等温扩增技术（SPIA） – 依赖于解旋酶的等温扩增技术（HAD） – 链替代扩增技术（SDA） – 快速等温检测放大技术（RIDA） – 切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEMA）
• B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由 B3区域组成，和靶基因的B3c区域互补。
扩增原理
• 60—65℃是双链DNA复性及延伸的中间 温度，DNA在65℃左右处于动态平衡状 态。因此，DNA在此温度下合成是可能 的。利用4种特异引物依靠一种高活性链 置换DNA聚合酶。使得链置换DNA合成 在不停地自我循环。
依赖于核酸序列的扩增
• 依赖于核酸序列的扩增（nucleic-acid sequence-based amplification, NASBA)是一项 以RNA为模板的快速等温扩增技术。
• 由加拿大Can-gene公司1991年首先发明。 • 主要用于RNA检测，具有高度敏感性和特异
产物检测的原理
• 电泳分析 • 荧光检测 • 浑浊度检测
LAMP扩增产物电泳分析
肉眼观察LAMP结果
DNA与SYBR Green结合现示绿色
肉眼观察显白色沉淀
LAMP的优点
• 操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，产 物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。 对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就 可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。
LAMP的特点
• LAMP克服了传统PCR反应需要通过反 复热变性获得单链模板的缺点，避免了 反复升降温的过程，实现了恒温条件下 的连续快速扩增，具有更高的灵敏度和 扩增效率。
• 15-60min内可扩增出109-1010倍靶序列拷 贝，得到500ug/ml的目的DNA。具有简 单、快速、特异性强的特点。
扩增分两个阶段
• 第1阶段为起始阶段，任何一个引物向双链DNA的 互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解 离，变成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与 模板F2c结合。在链置换型DNA聚合酶的作用下向 前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结 合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP 上的F1c与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配 对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与 B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结 构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点．以自身 为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构。该 结构是LAMP基因扩增循环的起始结构。
第2阶段
• 是扩增循环阶段。以茎环状结构为模板，FIP 与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离 出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’ 末端的B1区段为起点，以自身为模板。进行 DNA合成延伸及链置换．形成长短不一的2条 新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂 交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一 倍。在反应体系中添加2条环状引物LF和LB， 它们也分别与茎环状结构结合启动链置换合成， 周而复始。扩增的最后产物是具有不同个数茎 环结构、不同长度DNA的混合物。且产物DNA 为扩增靶序列的交替反向重复序列。
环介导等温扩增技术（LAMP）
• 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是2000年日本 研究人员Notomi等发明的一种新型体外等温 扩增特异性核酸片段的技术。
• 该技术主要利用两对特殊设计的引物和具有 链置换活性的DNA聚合酶，使反应中在模板 两端引物结合处循环出现环状单链结构，从 而保证引物可以在等温条件下顺利与模板结 合，并进行链置换扩增反应。
LAMP技术的原理
LAMP主要是利用4种不同的特异性引物识 别靶基因的6个特定区域，在等温条件进行 扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步 完成，所有靶基因序列的检测可只通过扩增 产物的有、无来判别。有、无扩增反应是利 用荧光定量PCR仪检测反应的荧光强度或利 用核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀反应 用浊度仪检测沉淀浊度来判定。
• F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3 区组成，并与靶基因的F3c区域互补。
• BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由 B1C和B2区域组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互 补，B1C域与靶基因5’端的Blc区域序列相同。