结核病实验室诊断技术2017.10.13

• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
分枝杆菌培养适用标本
• 痰液：脓性、干酪痰、褐色血痰、或含少量新鲜血液的 血痰、黏液痰为合格标本
• 脑积液 • 胸腹水、滑膜液 • 支气管灌洗液 • 坏死组织、穿刺物 • 尿液 • 大便
分支杆菌的菌落形态（MTB）（L-J）
分支杆菌在罗氏培养基中的形态（NTM）
分支杆菌在MGIT960培养物的形态 （MTB)
结果报告-比例法
计算耐药百分比：
含药培养基上生长的菌落数 • 耐药百分比= -------------------------- ----------- × 100%
对照培养基上生长的菌落数
• 若耐药百分比大于或等于1%，则认为受试菌对该抗结 核药物耐药 （R）
结核分枝杆菌药敏试验的方法（基于表型）
• 焦磷酸测序法： 仪器昂贵 要求样本菌株纯度高-纯菌种
• PCR-反向点杂交法: 仪器相对便宜 可对同一样本混合菌株同时鉴定 目前可鉴定的菌种17-24种
结核分枝杆菌药敏试验-菌种鉴定
临床数据
1. 2016年湖南省胸科医院分枝杆菌分离情况
方法
菌株数
MTBC
NTM
MGIT 960法
4856
4415 90.9% 441 9.1%
物的鉴定 优点：快速，15分钟出结果；敏感度99%，特异性98.9% 结果解释：阳性-结核分枝杆菌复合群，注意可能存在非结
核分枝杆菌，阴性-部分MPB64基因缺失MTB菌株及非 结核分枝杆菌。
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
基于结核分枝杆菌特异分泌蛋白 MPB64抗原的快速检测鉴定技 术
结核分枝杆菌药敏试验-菌种鉴定（基因检 测）
结核分枝杆菌药敏试验-MGIT960法
特点：全自动、全封闭； 快速、样本量 大； 联合 （SIRE）药敏，可进行 PZA药敏试验；结果仪器 自动判读。
结核分枝杆菌药敏试验-MGIT960法
结核分枝杆菌快检测系统 （BACTEC960系统）
结核分枝杆菌药敏试验-固体培养基
• 纯培养、生长活跃的结核菌作为测试 (2 – 4 周). 如果生 长不充分 (少于20 菌落, 1+), 不能很好的解释DST结果
传感器
无荧光或弱荧光
阳性培养
O2 O2
O2
O2
O2 CO2
FFOF2
F F
F
F FFO2 F
强荧光
分枝杆菌分离培养-MGIT960法
优点
• 快速 4-15天培养阳性 • 灵敏 培养阳性率高于L-J法 • 简便 操作简便、自动化检测
缺点
• 无法观察菌落形态 • 污染率略高于罗氏培养 • 仪器与试剂价格较贵 • 无法区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌
• 研究表明：任何一个单一的抗原检测患者的 抗体反应是针对许多结核分枝杆菌抗原的
免免疫学诊断方法-体液免疫（抗体）
免疫学诊断方法-体液免疫（抗原）
• SFDA批准的只有两种试剂 • 杭州创新和济南杏恩 • 快速检测结核抗原MPT64（标本：培养物） • 金标法
3. DST自身问题
DST临界值的确定； DST的标准化不同； DST技术的差异 DST药品质量及培养基中药物稳定性
免疫学诊断方法-体液免疫（抗体）
• 结核患者免疫功能不同而导致对结核分枝杆菌抗原识别 的差异
• 结核患者对抗原的识别差异存在阶段特异性（结核菌潜 伏感染期、结核病非活动期、活动不排菌期等）
4
9
新金分枝杆菌
3
10
外来分枝杆菌
3
11
三重分枝杆菌
3
12
马赛分枝杆菌
2
13
亚洲分枝杆菌
2
14
堪萨斯分枝杆菌
2
25.23 24.62 18.62 18.62 2.70
1.5 1.5 1.2 0.9 0.9 0.9 0.6 0.6 0.6
结核分枝杆菌药敏试验-基于固体罗氏培养 基础上的方法
1.绝对浓度法（中国防痨协会推荐）： Meisnner， 1963
2.比例法（WHO推荐方法） Canetti , 1963
临界药物浓度（单个药物浓度度μg/ml ） ）：SM 4；INH0.2； RFP40；EMB2；PAS1；OFX2；KM30；AMK30；CPM40； TH1321 40 临界菌群比＝耐药菌群数/全菌群数（ 1% ）
菌液浓度10-2mg/ml， 10-4mg/ml，接种量0.01ml
分支杆菌培养方法
• 培养方法：固体培养（改良罗氏培养基（L-J）；液体 培养（MGIT 960）
• 原理： 1.标本经过消化液（ 4%NaOH ）处理杀灭杂菌，分枝杆
菌由于具有对强酸强碱的耐受性仍保留活性，根据在专 用培养基上的生长情况，判断标本中是否含有分枝杆菌 2. Bactec MGIT 960系统原理将荧光物质包埋在7H9液体 培养管的底部，分枝杆菌生长过程中，O2被消耗，底物 产生荧光，仪器通过测定荧光强度，用生长指数来表示 测定结果，培养时间通常需要7~42天。
about 50,000
90
• 1-9 in 1 field
about 100,000
96
• ≥ 10 per field
about 500,000
99.95
指导患者留痰后对涂片显微镜检查结果的影响 [in Indonesia Setting]
Alisjahbana B et al, Int J Tuberc Lung Dis 2005, 9: 814
Patients
- ZN positive - 1st sputum positive - 2nd sputum positive - 3rd sputum positive
Control n = 93
35 % 26 % 31 % 27 %
Instructed n = 81
51 % 46 % 40 % 41 %
痰涂片检查的优点
1.痰涂片检查作为传染性肺结核诊断的准确性高于X线检查 2. 痰涂片检查技术简单、容易标准化 3.痰涂片检查投入设备投入少 4.痰涂片检查成本低廉，易于接受 5.痰涂片检查报告结果的时间短,满足临床诊断需要 6.痰涂片检查及时和准确评价涂阳患者的治疗效果
痰涂片检查的缺点
1.特异性差：无法结核分支杆菌与非结核分枝杆菌 2.无法区别死菌与活菌。 3.敏感性低：直接涂片法5000—10000条菌／ml
结核病实验室诊断技术
湖南省结核病防治所 易松林
2017.10.13
结核病实验室诊断技术
• 分枝杆菌涂片检查 • 分枝杆菌分离培养 • 分枝杆菌分子生物学诊断 • 结核分枝杆菌免疫学诊断
分枝杆菌涂片检查
• 直接涂片检查法
1.试剂：萋苨氏染色法：石炭酸复红染液（8%），盐酸
酒精（5%），美兰染液（%）；荧光染色法：金安O染 液，盐酸酒精，复染液（高锰酸钾） 2.操作流程：标本送检（三份痰标本：晨痰、及时痰、夜 间痰）-涂片（20*30mm卵圆形痰膜）-染色-镜检-报告
• SD BIOLINE AG MPT64
免疫学诊断方法-细胞免疫
γ -干扰素释放试验（IGRA）
T淋巴细胞分为效应T淋巴细胞和记忆T淋巴细胞。记忆 T淋巴细胞在首次感染结核杆菌后长期存在 ,当再次受 到结核杆菌相关抗原刺激后 ，这些记忆T淋巴细胞迅速 增殖成为效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞分泌细胞因子, 如γ-干扰素(IFN-γ)。通过定量检测释放的IFN-γ的 水平或可以有效释放IFN-γ的细胞，可以对结核杆菌感 染情况做出判断。
分支杆菌MGIT培养物的形态（MTB)
分枝杆菌快检测系统（BACTEC960 系统）
特点：全自动、全封闭、快速、样本量 大 原理：分枝杆菌对NaOH的耐受性；分 枝杆菌在液体培养基生长更快，添加了 丰富的营养物质；分枝杆菌生长耗氧， 荧光增强，仪器自动探测荧光的变化。 试剂组成：MGIT培养管、MGIT生长 添加剂、PANTA杂菌抑制剂、SIRE药 敏试剂。 标本适用范围：除血液标本以外的所有 标本