微生物显微镜和显微技术 -文档资料

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显微技术

显微技术显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。

显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

而在食品微生物检验中最常用的还是普通光学显微镜。

一、普通光学显微镜的结构和基本原理：1.结构：光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。

光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等。

（图３－１）标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。

焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。

油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。

目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。

聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。

聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光阑可以调节入射光束的大小。

显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。

一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。

有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。

图３－１光学显微镜结构图2.原理：显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。

所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。

要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。

显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

二、普通显微镜的使用方法1、低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

微生物显微技术的发展及应用

微生物显微技术的发展及应用化生系生物技术11 麦柳明学号：2011111778微生物显微技术主要包括标本的制作技术、显微镜技术、显微摄影技术以厦摄影后的图像处理技术等四个方面。

(一)微生物显微技术的历史回顾1676年，列文虎克利用自制的单式显微镜首次发现了细菌，这标志着人类开始了微生物学领域的研究；同时也标志着微生物显微技术的诞生。

伽利略发明了望远镜后，人们受到启发，将它倒过来制成了第一台复式显微镜。

l850年，在显微摄影技术极低困难重重的情况下，科赫拍摄了至今还能清晰辨认的细菌照片，这一成果被视为显微摄影史上的奇迹之一；他于l877年第一个制作了可以永久保存的、用美蓝染色的干细菌膜标本。

l934年，马顿制造了第一架电子显微镜；1 941年，马德等发表了第一批细菌细胞的电镜照片。

电镜的发明以及引入了计算机技术标志着显微技术进入了新的历史发展阶段，它不仅使微生物研究进入了分子水平，以至电子水平，进而促使微生物显微技术向着快速、准确和自动化方向发展。

(二)微生物显微技术的发展现状概述新技术、新理论的不断引进逐步充实和完善了微生物显微技术，其发展主要表现在以下四个方面：1、标本制作技术(即切片技术)及其设备：近代物理学、化学和生物学等学科的发展为标本制作技术奠定了坚实的理论和技术基础，使切片技术逐渐成熟形成了体系。

生物种类(动物、植物和微生物)的切片技术主要包括整体标本制作、超薄切片制作和冷冻切片技术等。

切片技术改进的一个突出例子是x射线显微分析超薄冰冻切片上的可扩散元素。

在元素浓度低(如lOOnm 厚的切片中)，X射线显微分析只能在直径为l OOnm 范围内进行；在元素浓度高(如在厚度为1—2 m的无机包含物切片中)，X射线显微分析可在直径小至25am范围内进行；在元素浓度高，具有良好的冰冻干燥设备，并采用严格的冰冻切片技术，x射线显微分析可在直径小于25nm范围内进行，从而在不同试验条件和不同超微结构水平上研究细胞化学成分。

微生物纯培养和显微技术

电子束光刻（EBL）：利用电子束在样品表面进行光刻，用于制备纳米级结构。
● 扫描隧道显微镜（STM）：利用隧道效应，通过扫描样品表面，获取样品表面的形貌和结构信息。 ● 原子力显微镜（AFM）：利用原子力显微镜探针与样品表面的相互作用，通过扫描样品表面，获取样品表面的形貌和结构
谢过程。
纯培养的应用：在医学、生物学、食品工业等领域都有广
泛的应用。
纯培养的方法：包括稀释法、平板划线法、液体培养法等。
培养基制备：制备适合微生物生长的培养基
培养：在适宜的温度、湿度和光照条件下培养微生
物
分离：将不同种类的微生物分离开来，如使用划线
法、涂布法等
取样：从环境中采集微生物样品
电子探针（EPMA）：利用电子束激发样品表面，通过分析电子信号获得样品的化学成分和结构信息。
电子能谱仪（ESCA）：利用电子束激发样品表面，通过分析电子信号获得样品的化学成分和电子结构信息。
电子束诱导电流（EBIC）：利用电子束激发样品表面，通过分析电流信号获得样品的电学性质和结构信息。
缺点：需要较高的技术水平和设备，操作难度较大
优点：可以观察到微观世界的动态变化，如细胞分裂、生长、死亡等
缺点：需要较长的时间进行观察，需要耐心和细心
显微镜的种类和原理
光学显微镜的种类：普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、偏光显微镜等
光学显微镜的原理：利用光的折射和反射原理，通过透镜将微小物体放大
观察微生物生长：通过光学显微镜可以观察到微生物的生长过程、生长速度等特征。
观察微生物繁殖：通过光学显微镜可以观察到微生物的繁殖方式、繁殖速度等特征。
观察微生物形态：电子显微镜可以清晰地观察到微生物的形态、大小和结构，为微生物分类和鉴定提供依据。

生物显微技术的研究及应用

生物显微技术的研究及应用在当今科技发展的时代，各种高科技设备和技术应用不断涌现。

而其中，生物学领域所涉及的显微技术就是一种十分重要的技术。

生物显微技术的应用领域非常广泛，从医学、生命科学到环境科学都有着重要的应用。

在本文中，我们将会探讨生物显微技术的研究及其应用。

一、生物显微技术的发展生物显微技术的起源可以追溯到公元前1600年左右的时候，当时的古埃及医生就使用放大镜来观察红血球。

而到了17世纪初，荷兰科学家安东·范·李文虎克发明了一种高性能显微镜，从此开始了显微技术的快速发展。

在19世纪，生物显微学渐渐被人们所熟知，并且开始被广泛应用于医学领域。

20世纪初期，生物显微技术经过几十年的发展，推陈出新，取得了重大进展。

除了普通荧光显微镜、共聚焦显微镜等传统显微镜外，出现了许多高级显微镜，如STED、SIM等。

这些高级显微镜不仅在空间分辨率上有了很大的突破，而且能够在吸收谱、荧光谱、周迴光谱等方面进行分析和检测。

这种深层次的研究和应用，对生物领域中的科学研究和技术发展起到了重要的推动作用。

二、生物显微技术的应用领域1.医学领域生物显微技术在医学领域中有着广泛的应用，医学工作者可以利用显微镜分析和研究生物样本，以帮助诊断疾病。

在医学诊断中，常见的生物样本包括血液、尿液、组织等。

通过生物显微技术对这些生物样本的分析，可以快速、准确地诊断出一系列疾病。

例如，在肿瘤相关的研究中，生物显微技术被广泛运用。

科学家们可以利用高性能显微镜观察肿瘤的详细构成，以了解肿瘤形成的机制，并发展新的治疗方法。

此外，生物显微技术还可以被应用于显微外科手术，通过显微镜引导医生进行手术操作，极大地提高了手术的准确性和成功率。

2.生命科学领域在生命科学领域中，生物显微技术可以被用来研究生物发育、基因表达等生物过程。

科学家们可以在显微镜下观察到细胞分裂、蛋白质交互作用、基因调控等生物过程中的微观结构和变化，通过这些观察和分析，科学家们可以深入了解生物过程的机理，发现新的生物机制，并进一步深化生命科学领域的理解。

微生物显微镜和显微技术课件(稻谷书苑)

（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。
详细课资
32
光学显微样品制备－－染色观察
用途：微生物的细致形态和结构染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定
详细课资
33
1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
活菌
简单染色
鉴别染色
详细课资
革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色
美蓝染色
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光学显微镜样品制备－－活体观察
特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察
（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。
（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。
22
2、扫描电子显微镜
大肠杆菌扫描电镜图
扫描电子显微镜
工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。
主要用于：样品表面结构
详细课资
23
扫描电子显微镜原理
详细课资
24
详细课资
25
负染色法观察的鞭毛
详细课资
38
投影法
在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体形状、高度。
详细课资
39
用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒
投影法观察的噬菌体
详细课资
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超薄切片法

微生物制片显微观察及检测技术

革兰氏染色图解
革兰氏染色试剂
步骤1：用蒸馏水滴瓶滴一小滴蒸馏水于洁净的载玻片上
步骤2：用无菌操作法取少许培养物于蒸馏水滴上
步骤3：用接种环将培养物涂布成一薄层
步骤4：风干
步骤5：在酒精灯火焰外层尽快的来回通过3-4次固定
步骤6：结晶紫染色1分钟
步骤7：用蒸馏轻轻冲洗玻片
步骤8：革兰氏碘液染色1分钟，再用蒸馏水轻轻冲洗
低倍镜操作方法
1.两眼从侧面注视低倍物镜对准通光孔，使用粗调焦螺旋将镜筒自上而下的调节，避免物镜镜头接触到玻片而损坏镜头和压破玻片。当物镜镜头与载物台的玻片相距2～3mm时停止； 2.左眼注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗调焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止； 3. 再用微调焦螺旋调至清晰。注意：粗调调焦螺旋只用于上调载物台，如观察显微镜时，用粗调节器调节，有压碎载玻片、损坏物镜的危险。因此，用细调焦螺旋调节视野使其更清晰
微生物检测技术介绍
检测技术的重要性
一、微生物检验技术介绍
微生物检测
传统筛选系统免疫凝集/免疫沉淀实验 Mini VIDAS筛选系统实时荧光定量PCR 革兰氏染色镜鉴按照标准进行传统的生化反应鉴定 API试剂条菌鉴定国际金标准
微生物鉴定
半自动细菌鉴定仪（ATB Expression）
(二)细菌的革兰氏染色步骤
涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脱色→水洗→复染→水洗 →干燥→观察
1 ．取培养物分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。 2．用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3．加碘液媒染1min后水洗。 4 ．斜置载玻片，滴加 95 ％乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20~30s，随即水洗。 5．用蕃红染液复染1min，水洗。 6．用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。

生物显微技术总结范文

随着科学技术的不断发展，生物显微技术在生物学、医学、环境科学等领域的研究中发挥着越来越重要的作用。

生物显微技术是通过显微镜观察和研究生物体微观结构的方法，它为我们揭示了生物体的奥秘，为人类健康和生物科学的发展提供了有力的技术支持。

以下是生物显微技术的总结。

一、生物显微技术的基本原理生物显微技术的基本原理是利用光学原理，通过放大微小物体，使其在视觉范围内被观察。

显微镜由光源、物镜、目镜和载物台等部分组成。

光源发出的光线经过物镜放大，再通过目镜观察，从而实现对微小物体的观察。

二、生物显微技术的分类1. 光学显微镜：光学显微镜是生物显微技术中最常用的显微镜，分为普通光学显微镜、荧光显微镜、相差显微镜等。

普通光学显微镜主要用于观察生物体的显微结构，荧光显微镜和相差显微镜则可以观察生物体的亚显微结构和动态变化。

2. 电子显微镜：电子显微镜利用电子束代替光束，具有更高的分辨率。

电子显微镜分为透射电子显微镜和扫描电子显微镜。

透射电子显微镜主要用于观察生物体的超微结构，扫描电子显微镜则可以观察生物体的表面形态。

3. 激光共聚焦显微镜：激光共聚焦显微镜利用激光聚焦和光学切片技术，实现对生物体的三维成像。

它具有较高的分辨率和空间分辨率，广泛应用于细胞生物学、分子生物学等领域。

4. 多模态显微镜：多模态显微镜将多种成像技术结合，如光学显微镜、电子显微镜、荧光显微镜等，实现对生物体的多方面研究。

三、生物显微技术的应用1. 生物学研究：生物显微技术广泛应用于生物学领域，如细胞结构、细胞功能、细胞代谢等方面的研究。

2. 医学诊断：生物显微技术可用于疾病的诊断，如肿瘤、感染等疾病的细胞学检查。

3. 环境科学：生物显微技术可用于环境监测，如微生物群落结构、生态系统的稳定性等方面的研究。

4. 生物工程：生物显微技术可应用于生物工程领域，如细胞培养、基因编辑、蛋白质工程等。

四、生物显微技术的发展趋势1. 高分辨率：随着显微镜分辨率的提高，生物显微技术将更加深入地揭示生物体的微观结构。

微生物大小的测定及显微镜直接计数法

微生物学实验报告题目：微生物大小的测定及显微镜直接计数法姓名：学号：年级班级：组别：同组者：时间：【目的要求】1．学习并掌握使用显微镜测微尺测定微生物大小的方法。

2．了解血球计数板的构造、明确其计数原理。

3．学习并掌握使用血球计数板测定微生物细胞或孢子数量的方法。

【基本原理】l．测微尺的构造：显微镜测微尺是由目镜测微尺和镜台接物测微尺组成目镜测微尺是一块圆形玻璃片，其中有精确的等分刻度，在5mm 刻尺上分50 份。

目镜测微尺每格实际代表的长度随使用接目镜和接物镜的放大倍数而改变，因此在使用前必须用镜台测微尺进行标定。

镜台测微尺为一专用的载玻片，中央有精确等分线将长为1mm 的直线等分成100 个小格，每格长10μm，专用于校正目镜测微尺。

2.球菌用直径表示大小；杆菌用宽和长来表示图一：测微尺的校正3．显微直接计数法：将小量待测样品悬浮液置于计菌器上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。

菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫·霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板或Hawksley计数板。

三种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。

而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。

血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。

中间较宽的平台，被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。

计数区的刻度有两种：一种是计数区（大方格）分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。

计数区由400个小方格组成。

每个大方格边长为1mm，其面积为lmm2，盖上盖玻片后，盖载玻片间的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3。

使用血球计数板计数时，通常测定五个中方格的微生物数量，求其平均值，再乘以25或16，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1毫升菌液中微生物的数量。

实验一-光学显微镜的使用与微生物观察

实验一光学显微镜的使用与微生物观察第一节普通光学显微镜的使用一、实验目的1、了解普通光学显微镜的基本构造和工作原理。

2、学习并掌握普通光学显微镜，重点是油镜的使用技术和维护知识。

3、在油镜下观察微生物的几种基本形态。

二、基本原理（一）普通光学显微镜的构造普通光学显微镜由机械系统和光学系统两部分组成（图1-1）。

1、机械系统机械系统包括镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、调节器等。

（1）镜座：它是显微镜的基座，可使显微镜平稳地放置在平台上。

（2）镜臂：用以支持镜筒，也是移动显微镜时手握的部位。

（3）镜筒：它是连接接目镜（简称目镜）和接物镜（简称物镜）的金属圆筒。

镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。

镜筒长度一般固定，通常是160mm。

有些显微镜的镜筒长度可以调节。

（4）物镜转换器：它是一个用于安装物镜的圆盘，位于镜筒下端，其上装有3～5个不同放大倍数的物镜。

为了使用方便，物镜一般按由低倍到高倍的顺序安装。

转动物镜转换器可以选用合适的物镜。

转换物镜时，必须用手旋转圆盘，切勿用手推动物镜，以免松脱物镜而招致损坏。

（5）载物台：载物台又称镜台，是放置标本的地方，呈方形或圆形。

载物台上装有压片夹，可以固定被检标本；有标本移动器，转动螺旋可以使标本前后和左右移动。

有些标本移动器上刻有标尺，可指示标本的位置，便于重复观察。

（6）调节器：调节器又称调焦装置，由粗调螺旋和细调螺旋组成，用于调节物镜与标本间的距离，使物像更清晰。

粗调螺旋转动一圈可使镜筒升降约10mm，细调螺旋转动一圈可使镜筒升降约0.1mm。

图1-1 普通光学显微镜的构造1. 镜座2. 镜臂3. 镜筒4. 转换器5. 载物台6. 压片夹7. 标本移动器8. 粗调螺旋9. 细调螺旋10. 目镜11. 物镜12. 虹彩光阑（光圈） 13. 聚光器 14. 反光镜2、光学系统光学系统包括目镜、物镜、聚光器、反光镜等。

（1）目镜：它的功能是把物镜放大的物像再次放大。

第二章--微生物的纯培养和显微技术

第二节显微镜和显微技术
一、显微镜的种类及其原理二、显微观察样品的制备三、显微镜下的微生物
几个基本概念：
一、显微镜的种类及原理
1.普通光学显微镜（复式显微镜）
机械装置: 镜座、支架、载物台、调焦螺旋等光学系统: 物镜、目镜、聚光镜等
使用油镜时加镜油的目的: (1)增加照明亮度 (2)增加显微镜的分辨率
细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可激发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一
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荧光显微镜观察
5、透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM)
原理：用一束电子作为它的能源，电子的波长很短，能够检测极细微的物体，如病毒和分子。
应用：通过细胞超薄切片，观察细胞内部的详细结构如细胞膜、细胞核等。（可放大几万倍）
6、扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM)
原理：类似于电视或电传真照片。即利用电子“探针”，在样品表面进行“扫描”，激发样品表面放出二次电子，二次电子由探测器收集，并转变为光信号。
光学显微镜
光学理论依据
德国理学家Ernst Abbe，在19世纪70年代建立的在Abbe的公式中，两物体之间的最小可分辨距离被称为最小距离（d）
最小距离=0.5/nsin= 0.5/NA
分辨率（R) ∝ 1/d
分辨率(最小可分辨距离)=0.5λ∕ n sinθ = λ∕2NA
波长与分辨率
高压蒸汽灭菌锅
2、接种操作
接种工具：白金or镍铬合金接种针/环

微生物实验报告---普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色

普通光学显微镜的使用及简单染色、革兰氏染色郑小煜201100140069生命科学学院生科3班同组者:赵莉、高瑞、刘梦迪2012年10月10日一、实验目的和要求1、学习显微镜的使用方法。

微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌单染色。

2、学习3、初步认识细菌的显微形态特征。

4、学习并掌握细菌革兰氏染色，了解革兰氏染色在细菌分类鉴定中的重要性。

二、实验原理1、细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对他们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而更能清楚的观察到其形态和结构。

2、油镜:油镜的放大倍数可达100倍，焦距很短，直径很小，但所需的光照度却很大。

为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃折射率相仿的镜油(通常用香柏油)。

且油镜分辨率很高，可达0.2微米左右。

3、通常采用碱性染料进行简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及酸性溶液中通常带负电荷，而染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色;当细胞处于碱性条件下所带正电荷增加时，可采用碱性染料染色。

4、革兰氏染色革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G?)和革兰氏阴性(G?)两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。

首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。

然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。

之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。

革兰氏阳性细菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。

而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂染色后又变为复染剂颜色。

微生物的纯培养和显微技术

6.二元培养物
只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物，这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。
选择培养基分离法
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105
106
107
高氏培养基土豆培养基牛肉膏培养基
7.微生物保藏技术
微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护微生物资源的一项重要基础工作。
(1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。
（2）保藏方法 ①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷藏。
②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。
③真空冷冻干燥法保藏
④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。
日本大阪发酵研究所(IFO)
斜面低温保藏法－－常用保藏法
• 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。
培养平板（culture plate，也称平板或平皿）：溶化的培养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。
（1）涂布平板法（Spread plate method）适于大多数好氧微生物。
（2）稀释倒平皿法（Pour plate method）

生物显微技术

1.生物显微技术:介绍光学显微镜和电子显微镜的基本理论知识和样品制备技术的一门专业基础课。

2.显微镜(microscope)是一种借助物理方法产生物体放大影象的仪器。

最早发明于16世纪晚期，至今已有400多年的历史。

3.公元前1世纪：通过球形透明物体去观察微小物体时可以使其放大成像。

4.3000多年前，欧洲腓尼基人发明了人造玻璃。

5.约在四百年前:眼镜片工匠们开始磨制放大镜。

当时的放大镜的放大倍数只有3—5x （单式显微镜）6.单式显微镜的缺点:焦距又与放大倍数成反比，而焦距与透镜直径成正比，也就是说，焦距越短，放大倍数越大，而透镜直径又越小。

7.列文虎克和他的显微镜（约1680，300倍左右，直径为2-4毫米、单式显微镜）,一生中制作了200多台显微镜和500多个镜头.他是第一个看到活细胞的人，8.1590年代荷兰眼镜制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一台复式显微镜，尽管其放大倍数不超过10倍，但具有划时代的意义。

9.复式显微镜在性能上明显优于单式显微镜:一是它的放大率可以做得很高，可以把几个放大倍数较小的凸透镜组合起来获得很高的放大率。

二是制造工艺较简单，不必磨制一个个极小的透镜10.伽利略可能是最早把复式显微镜用于科学研究的人。

制造于17世纪晚期.他用显微镜研究了昆虫，观察了昆虫的运动器官、感觉器官和复眼。

11.列文虎克的显微镜：光源系统:显微系统:由载物台、物镜,调焦螺旋、镜筒、目镜组成.物镜:一个复合物镜调焦螺旋:这个设计与伽利略显微镜一样目镜:复合目镜在当时也是一种很先进的设计缺点：存在很大的球面像差和色差, 成像质量糟12.十八世纪中使用最广泛的显微镜:卡夫(Cuff)显微镜光学性能：45——100倍.它有很严重的色差和球面像差.它的分辨率极低,只有10微米透射观察、落射观察、活体观察13.历史上最豪华的显微镜:英王GeorgeIII的银显微镜:14.发明消色差物镜的van Deijl, Amici和Lister.制造出高质量的光学玻璃的卡尔.蔡司(Carl Zeiss)和德国肖特（Schott ）.设计制造了高度消色差物镜和高分辨率的阿贝物镜的阿贝(Abbe)等等.在十九世纪中叶还出现了显微摄影dd的学生显微镜(1864)采用了当时最先进的齿轮调焦装置,这个显微镜的镜臂上多出了一个在前几个世纪的显微镜上都看不到的东西----聚光镜.16.历史上最精美的显微镜----Wenham的显微镜. （1882）当时最为精巧先进的齿轮传动系统和齿轮调焦系统,聚光系统还有成像系统.它的物镜和目镜的质量在当时都是最高的.这个显微镜的最突出的特点是它的齿轮传动装置.这个显微镜的镜座,镜臂,载物台都可以旋转.17.1886年，德国人Ernst Abbe 发明复消差显微镜，并改进了油浸物镜，至此普通光学显微镜技术基本成熟。

微生物学实验

革兰氏染色与细胞壁：肽聚糖外膜
外膜蛋白
周质空间
四、实验步骤
1、革兰氏染色 1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染 2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。 3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。 4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如番红，它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色
三、实验原理（革氏染色法）
1、革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+)和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 2、制片（涂片，干燥，固定）→初染（结晶紫、水洗）→媒染（加碘液覆盖涂面）→脱色（95%酒精、水洗，）→复染（蕃红复染、水洗）→干燥 →镜检
一种介壳虫的染色体

5.相差显微镜 6. 偏光显微镜

偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。
7.微分干涉差显微镜
DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
菌种: 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物。试剂：0.05％和0.1 吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液显微镜，玻片等

四、操作步骤 1、菌种活化将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上， 25~28℃培养48 h左右备用。 2、美蓝镜片的观察 1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母菌苔放在染液中，混合均匀。

微生物学[第二章微生物的纯培养和显微镜技术]山东大学期末考试知识点复习

第二章微生物的纯培养和显微镜技术一、要点提示1．由于微生物个体微小，在绝大多数情况下对微生物的研究、利用都是使用其群体，称为培养物。

由于一般情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，因此从混杂的天然微生物群中分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。

采用稀释涂布或平板划线技术在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段，而在分离、转接及培养微生物纯培养时防止被其他微生物污染的无菌操作技术是进行微生物学研究的基础，并广泛地被其他学科和生产实际所利用。

2．通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡、不会因发生变异而丢失重要的生物学性状、不会被其他微生物污染或因自身泄漏而污染环境，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。

传代培养、冷冻真空干燥保藏、低温冰箱保藏及液氮保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。

3．微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的两个最重要的因素。

它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。

无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。

4．在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物和对其进行分类、鉴定的重要依据之一。

二、重点、难点剖析1．无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。

2．分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。

获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2-1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。

此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。

3．保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。

显微镜的使用及微生物显微特征的观察(1)

显微镜的使用及微生物显微特征的观察（1）一、目的要求1、了解显微镜的构造，掌握显微镜的使用方法；2、了解细菌的光学显微特征。

二、基本构造普通光学显微镜构造主要分为三部分:机械部分照明部分光学部分。

1.机械部分（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。

（2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。

（3）镜臂：一端连于镜柱,一端连于镜筒。

（4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装有目镜，下端装有物镜转换器。

（5）物镜转换器：接于棱镜壳的下方，可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜部位，转动转换器，可以调换不同倍数的物镜。

（6）载物台：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔，我们所用的显微镜其镜台上装有玻片标本推进器，推进器左侧有弹簧夹，用以夹持玻片标本，镜台下有推进器调节轮，可使玻片标本作左右、前后方向的移动。

（7）焦距调节轮：是装在镜柱上的大小两种螺旋，可使镜台作上下方向的移动以调节观察焦距。

2．照明部分装在镜台下方，包括反光镜，集光器。

（1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。

（2）集光器位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把光线集中到所要观察的标本上。

①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的强弱。

②光圈：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动它可调节其开孔的大小，以调节光量。

3.光学部分（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。

（2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的为油镜，此外，在不同的镜头上加有一圈不同颜色的线，以区别不同的镜头。

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§2 显微镜和显微技术
11.12.2020
1
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2
借助于显微镜观察微生物的方法即显微技术，显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
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显微镜的种类和原理
显微观察样品的制备
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4
一、显微镜的种类和原理
普通光学显微镜暗视野显微镜
(一)、光学显微镜相差显微镜
荧光显微镜
现在的光学显微镜分辨的最小极限达0.2μm。
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普通光学显微镜的几个基本概念
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1、普通光学显微镜
由三部分构成 ①照明系统：包括光源和聚光器； ②光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成； ③机械装置：用于固定材料和观察方便
样品承载
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载玻片
调节电磁透镜的流向
调节电磁透镜的流
向金属网（通常为铜
网）
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二、显微观察样品的制备
（一）光学显微镜制样
活体观察染色
压滴法悬滴法菌丝埋片法
死菌
活菌
简单染色
鉴别染色
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革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色
美蓝染色
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光学显微镜样品制备－－活体观察
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（二）、电子显微镜的制样
样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，制样时一般采用重金属盐染色或喷镀，提高在电镜下的反差。
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※1、透射电镜的样品制备
负染技术投影技术超薄切片技术冰冻蚀刻技术
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负染法
将样品的背景染色以凸现样品，所以称为负染法。
用高速电子束代替光束。放大倍数可达80万倍，分辨的最小极限达0.2纳米。
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1、透射电子显微镜
目前TEM的分辨力可达 0.2nm。
用电子束作光源，用电磁场
作透镜。用于电镜的标本须制成厚度约50nm左右的超薄切片。放大倍数最高可达近百万倍.由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。
主要用于：样品表面结构
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扫描电子显微镜原理
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3、扫描隧道显微镜（STM）
扫11.1描2.2020隧道显微镜拍摄的7个铀原子团
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27
4 原子力显微镜
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11
油镜使用

光镜使用方法
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2、暗视野显微镜
原理：聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。适用范围：生活细菌运动性观察。
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特点:只能看到物体的存在与运动,不能辨清其微细结构。
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高尔基体的 TEM照片(伪彩色)
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2、扫描电子显微镜
大肠杆菌扫描电镜图
扫描电子显微镜
工作原理：电子束扫描，激发样品表面放出二次电子，电子产生多少与标本表面立体形貌有关。电子经探测器收集，经光电倍增管和放大器，产生样品立体图像于荧光屏上。
29
光学显微镜和电子显微镜的特点比较
特点
光学显微镜
电子显微镜
最高放大倍数约1000-1500 10万以上
最佳分辨率 0.2微米
0.5纳米
辐射源
可见光
电子束
辐射源通过的媒介空气
高真空
透镜类型
玻璃
电磁体
反差来源
光吸收的差异或特定波长电子散射
聚焦机械
机械调节透镜位
改变放大倍数的方法置调换物镜或目镜
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光学显微样品制备－－染色观察
用途：微生物的细致形态和结构染色前需要对样品固定. 常用固定方法：酒精火焰加热、化学固定
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1)、简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
2）、革兰氏染色法：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察
特点：避免染色对细胞结构的破坏，用于运动性、摄食特性、生长繁殖过程中形态变化等观察
（1）压滴法：菌悬液滴于载玻片上，加盖玻片，观察。
（2）悬滴法：盖玻片中央加一小滴菌悬液，翻转置于特制的凹载玻片上，观察。
（3）菌丝埋片法：无菌小块玻璃纸铺于平板表面，涂布放线菌或霉菌孢子悬液，培养，取下玻璃纸置于载玻片上，观察菌丝形态。
暗视野显微镜的使用
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14
3、相差显微镜
基本原理:把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。
相差显微镜使用
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适用范围：对透明的活体进行直接观察
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微分干涉差显微镜DIC显微镜下的硅藻形态
一般是采用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质，如磷钨酸的钠盐将样品包围，同时染色剂还会进入观察对象的内部，这样，既能显示外形，又可在一定程度上反映样品的内部结构。
负染法原理
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用途：可以观察细菌细胞、病毒等。
负染色法观察的鞭毛
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4、荧光显微镜
原理：荧光素吸收紫外线并放出部分波长较长的可见光，发荧光的物体会在黑暗背景显现为光亮有色物体
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绿色：铜绿假单胞菌黄色：蜡样芽孢杆菌
绿色：微管红色：微丝蓝色：核
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透射电子显微镜
（二）电子显微镜
扫描电子显微镜
1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。
这是最常用的方法，可以观察细胞或其它样品内部的细微结构。样品固定→脱水→包埋→切片。只有在20—100纳米厚度的切片用透射电子显微镜才能观察，所以一般细菌样品，一个细胞要分割成10片到 50片。
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投影法
在真空条件下，用电子散射能力强的重金属原子来喷镀样品表面，这样在样品和没有喷镀的区域形成了较强的反差，而没有喷镀的部分成了样品的投影，根据投影了解样品的立体形状、高度。
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用途：观察细菌的鞭毛或病毒的颗粒
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投影法观察的噬菌体 40
超薄切片法