原核生物的基因表达与操作.pptx

➢ 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
大肠杆菌表达载体
启动子
核糖体结合位点 转录终止子
3.2 有功能的启动子的分离
一般程序：
➢ 1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌 的染色体DNA
➢ 2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无 启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使插入的 片断恰好紧邻报告基因的上游位置
➢ 3. 随后把此重组混合物转离功能的启动子
➢ 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒 载体的单克隆位点上；
➢ 将DNA重组分子，转化给宿主细胞（GalE＋、 GalT ＋、GalK－），避免内源半乳糖激酶的干扰；
➢ 将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中 性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化 子（重组子产生红色的菌落）。
基因组成 ➢ 受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须
与色氨酸结合才有活性 ➢ 3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与
阻遏蛋白的结合，提高转录活性。
Tac启动子
➢ 是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动 子，其启动能力比Lac和trp都强；
➢ 受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代 半乳糖苷）的诱导 。
(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组 成 ➢ 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控 ➢ 受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半 乳糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导 ➢ LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物
大肠杆菌的trp启动子
➢ 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 ➢ 由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构
3.3.3 提高蛋白的表达量
1、选择合适载体，提高翻译水平 ➢ 强启动子----提高转录水平 ➢ 核糖体结合位点（ATG---SD） ➢ 避免产物降解 ：分泌/融合表达
➢ 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体 系统。
➢ 来源于pBR322
检测启动子强弱的原理：
➢ 半乳糖激酶能够从ATP分 子上转移一个磷酸集团 给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸 化作用，形成半乳糖-1-磷酸。
➢ 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳 糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因 （galK）表达的半乳糖激酶的产量。
➢ 报告基因（reporter gene）：特指那些编码 产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元 （半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光 素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰 转移酶基因等）。
➢ 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是 否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织； 也可用来同任何一种目的启动子连接，因此 其表达活性可作为检测启动子功能的依据。
➢ Lac(乳糖启动子) ➢ Trp(色氨酸启动子) ➢ Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) ➢ PL (λ噬菌体的左向启动子) ➢ T7噬菌体启动子
通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止
大肠杆菌的Lac启动子
➢ 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 ➢ 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因
➢ 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；
➢ 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；
➢ 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；
➢ 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。
➢ 含Lac启动子的表达载体，如pOP203-13。 ➢ 含trp启动子的表达载体，如pDR720。 ➢ 含tac启动子的表达载体，如pKK223-3。 ➢ 含PL启动子的表达载体，如pPL-λ。 ➢ 分泌蛋白表达载体
➢ 融合型表达载体：----融合蛋白
➢ 非融合型表达载体：---天然完整蛋白
➢ 分泌型表达载体：----产物可跨膜分 泌至胞周间隙
大肠杆菌中表达体系的不足：
➢ 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。
➢ 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。
➢ 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。
分离有功能启动子的两个实例：
➢ 用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子 ➢ 用pK01筛选启动子
用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子
使用四环素（Tetr）作报告基因分离功能启动子 ➢ 1. 构建质粒pBRH3B和pBRH1 ➢ 2. 筛选启动子
用pK01筛选启动子
使பைடு நூலகம்galK（半乳糖激酶基因）作报告基因 分离功能启动子
3 原核生物的基因表达
与操作
3.1 原核生物的基因表达 3.2 有功能的启动子的分离 3.3 可调控强启动子驱动的基因表达 3.4 原核生物表达产物的分离纯化
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系优越性：
3.3 可调控强启动子驱动的基因表达
内容：
3.3.1 可调控的启动子 3.3.2 常用原核表达载体 3.3.3 提高蛋白的表达量 3.3.6 非融合蛋白的表达 3.3.7 融合蛋白的表达及纯化 3.3.9 增强蛋白质的稳定性 3.3.10 DNA整合入宿主染色体中 3.3.11 加强分泌
3.3.1 可调控的启动子
λ噬菌体的左向启动子PL
➢ 来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启 动子高约11倍；
➢ 受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30℃) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高 温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。
3.3.2 常用原核表达载体