35微生物药物的发酵生产技术.pptx
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微生物发酵PPT(培养技术)
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分批培养的优势： 操作简便, 周期短,染菌的机会减少和生产过程、产 品质量较易掌握,并且分批发酵在优势条件下对数 生长期会以最大生长率生长。 分批培养的局限： （1）培养过程中存在基质抑制问题, 生长受到限制, 包含有底物限制和毒素限制两种,如果对基质浓度 敏感或是对毒素累积敏感的产物,采用分批培养不 合适,产率较低。 （2）进行分批操作时,每次工作前都要进行设备、 材料、培养基等对仪器、设备及控制元件的技术要求较高, 从 而增加投资成本。 （2）连续培养是开放系统,并且发酵周期长, 有极大 的可能性造成菌体染菌,这也是生产成败的关键问题。 （3）在长期的发酵过程中,微生物容易发生变异, 菌 株退化问题也限制了大型连续培养生产,生产慢的高 产菌株很可能逐渐被生长快的低产变异菌株取代,从 而降低生产效率。 （4）丝状真菌菌体容易附着在器壁上生长以及在发 酵液内结团, 给连续发酵操作带来困难。
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谢谢大家！
The end
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其它重要技术
1 膜分离与发酵的耦合 膜生物反应器可以分为两类：第一类用膜保留培养物, 使 之悬浮于生物反应器中,不会因微滤或透析作用使细胞流 失。因而水流和培养物在反应系统中的持留时间各异。 第二类把生物催化剂固定在膜表面上或网格中或夹持在 两张膜的中间, 因此, 生物催化剂是不能运动的。 膜技术的优点：避免菌体丢失；排除有害代谢物,避免或 减轻产物的反馈抑制,从而使高密度细胞培养成为可能； 可以提高发酵中有机酸的产率, 乙醇、丙酮、丁醇发酵的 反馈抑制, 在基因工程菌的培养、超氧歧化酶生产、单克 隆抗体生产等方面都能达到较高的产率。
另外,不断的补料稀释, 对降低发酵液的粘度, 改善
流变学性质, 强化好氧发酵的供氧,也是十分有利的。
微生物发酵制药29页PPT
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26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
微生物发酵制药
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
Thank you
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
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28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
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29、在一切能够接受法律支配的人类 的状态 中，哪 里没有 法律， 那里就 没有自 由。— —洛克
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30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
微生物发酵制药
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
Thank you
微生物制药(发酵工程技术概论) ppt课件
依博素对类风湿性关节炎有明显的抗炎镇痛活性。
医学资源
14
受体拮抗剂举例2
丙谷胺（蒙胃顿）
作用机理：为胃泌素受体拮抗剂，有抑制胃酸和胃蛋白 酶分泌的作用。
功 能：于十二指肠溃疡，尤适用于慢性胃酸过多所致 的溃疡、胃炎。
医学资源
15
微生物产生的免疫调节剂
免疫反应：机体防御机制，自稳机制；
作用于蛋白质生物合 链霉素、苦霉素、红霉素 成体系 作用于核酸与核酸合 放线菌素 、安莎类抗生素 、利福 成体系 霉素SV、利福平、利福定利福酰胺
作用于能量代谢体系 如癣可宁，缬霉素，短杆菌素S等
医学资源 7
抗肿瘤抗生素
500 余种。主要有蒽环类、丝裂烷类、博莱霉素类、 色霉素类，放线菌素类，烯炔类抗生素。 目前，阿霉素、丝裂霉素、博莱霉素（争光霉素）、 放线菌素 D （更生霉素）、红比霉素（正定霉素）、 平阳霉素等已成为肿瘤治疗中常用的药物。
医学资源
5
二 微生物来源药物的种类与用途
微生物 产生的 活性物 质
抗感染 的抗生 素
AA， 维生素 酶 核酸
抗肿瘤 抗生素
酶抑制 剂
受体拮 抗剂
免疫调 节剂及 其他
医学资源
6
抗微生物感染的抗生素
作用机制 举例
抑制细胞壁生物合成 β－内酰胺类抗生素 ，如青霉素，头孢菌
素等
作用于细胞膜
多粘菌素，短杆菌肽S等
医学资源
10
H5N1神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒是一个鉴定禽流感 病毒H5N1神经氨酸酶抑制剂的试剂盒。 禽流感病毒在其外壳上有两种糖蛋白：
H—血凝素Hemagglutinin，
医学资源
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受体拮抗剂举例2
丙谷胺（蒙胃顿）
作用机理：为胃泌素受体拮抗剂，有抑制胃酸和胃蛋白 酶分泌的作用。
功 能：于十二指肠溃疡，尤适用于慢性胃酸过多所致 的溃疡、胃炎。
医学资源
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微生物产生的免疫调节剂
免疫反应：机体防御机制，自稳机制；
作用于蛋白质生物合 链霉素、苦霉素、红霉素 成体系 作用于核酸与核酸合 放线菌素 、安莎类抗生素 、利福 成体系 霉素SV、利福平、利福定利福酰胺
作用于能量代谢体系 如癣可宁，缬霉素，短杆菌素S等
医学资源 7
抗肿瘤抗生素
500 余种。主要有蒽环类、丝裂烷类、博莱霉素类、 色霉素类，放线菌素类，烯炔类抗生素。 目前，阿霉素、丝裂霉素、博莱霉素（争光霉素）、 放线菌素 D （更生霉素）、红比霉素（正定霉素）、 平阳霉素等已成为肿瘤治疗中常用的药物。
医学资源
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二 微生物来源药物的种类与用途
微生物 产生的 活性物 质
抗感染 的抗生 素
AA， 维生素 酶 核酸
抗肿瘤 抗生素
酶抑制 剂
受体拮 抗剂
免疫调 节剂及 其他
医学资源
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抗微生物感染的抗生素
作用机制 举例
抑制细胞壁生物合成 β－内酰胺类抗生素 ，如青霉素，头孢菌
素等
作用于细胞膜
多粘菌素，短杆菌肽S等
医学资源
10
H5N1神经氨酸酶抑制剂鉴定试剂盒是一个鉴定禽流感 病毒H5N1神经氨酸酶抑制剂的试剂盒。 禽流感病毒在其外壳上有两种糖蛋白：
H—血凝素Hemagglutinin，
微生物发酵技术 PPT课件
• (4) 改变菌体的生化代谢而影响生长。 • 部分前体物有毒性，部分是由于溶解度 小。 • (二) 可以解除或减弱分解产物阻遏 • 部分合成酶受到易利用的碳或氮源的 阻遏，例如葡萄糖的分解代谢产物引起的 阻遏。 • (三) 可以使发酵过程最佳化
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二 补料的方式和控制 (一) 补料方式 连续流加、不连续流加(多周期流加)。 (二) 补料控制 1 有反馈控制 反馈控制系统：传感器、控制器和驱 动器。 • 直接方法：以限制性营养物浓度作为反 馈参数； • 间接方法：以溶氧、pH、呼吸商、排气 中的CO2及代谢产物浓度等为参数。
•
间接方法的例子：以CO2和pH为控制参 数。 • 2 无反馈控制 • 经验补料法。
第十一节 泡沫的影响及控制
• 泡沫(机械泡沫和流态泡沫)的危害： • 1 装料系数减小； • 2 增加染菌机率。 • 消泡方法：
• 1 机械消泡； • 2 消泡剂消泡。
• 1 泡沫保持恒定的水平； • 2 早期稳定下降，以后 恒定； • 蛋白质的消耗。 • 3 前期稍微降低，后又 回升；
• 一 温度对发酵的影响 • 1 影响各种酶反应的速率和蛋白质的性 质； • 菌体生长所需温度与产物合成温度不 一致(如青霉素)；温度不同还可能影响产 物合成的方向(如金霉素和四环素)。 • 2 影响发酵液的物理性质。(粘度、氧和 基质的溶解与传递、分解和吸收)
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二 影响发酵温度变化的因素 产热的因素： 1 生物热(Q生物) 与培养基成分和培养阶段有关。 2 搅拌热(Q搅拌) 散热的因素： 1 蒸发热(Q蒸发) 2 辐射热(Q辐射)
• (2) 摄氧率的变化 • 随菌浓增加，摄氧率不断增加，溶氧浓 度下降，菌浓至临界，溶氧至最低。 • (3) pH • 先下降后下升：利用葡萄糖产生酸，而 后再被利用。 • 先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架， 剩下氨，而后氨又被利用。 • 限制性因素的出现，使菌体由生长向生 产转化。
微生物药物的发酵工艺详解演示文稿
工业微生物大都为好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。
工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同 时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。
反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递 速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。
类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐
微生物药物的发酵工艺 详解演示文稿
第1页，共96页。
（优选）微生物药物的 发酵工艺
第2页，共96页。
（一）微生物药物工业生产菌种
工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但 要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追 求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽 可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。
第12页，共96页。
发酵生长曲线
平台期
对数期
衰亡期
迟滞期
发酵周期
生长期
生产期
次生代谢发酵原理：
当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率 下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢 物。以取得环境竞争优势，保存自身。
第13页，共96页。
影响发酵的相关因素—培养基
在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、 复壮和改良。
第3页，共96页。
工业生产菌株应满足的要求：
✓能够产生较高浓度的目标产物； ✓微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物； ✓产物便于分离提取； ✓能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物 质等； ✓不致病，不产生内毒素； ✓发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态， 即发酵条件较温和； ✓容易进行代谢调控。
试管/茄子瓶斜面 麸皮/米孢子培养物
工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同 时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。
反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递 速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。
类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐
微生物药物的发酵工艺 详解演示文稿
第1页，共96页。
（优选）微生物药物的 发酵工艺
第2页，共96页。
（一）微生物药物工业生产菌种
工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但 要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追 求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽 可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。
第12页，共96页。
发酵生长曲线
平台期
对数期
衰亡期
迟滞期
发酵周期
生长期
生产期
次生代谢发酵原理：
当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率 下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢 物。以取得环境竞争优势，保存自身。
第13页，共96页。
影响发酵的相关因素—培养基
在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、 复壮和改良。
第3页，共96页。
工业生产菌株应满足的要求：
✓能够产生较高浓度的目标产物； ✓微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物； ✓产物便于分离提取； ✓能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物 质等； ✓不致病，不产生内毒素； ✓发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态， 即发酵条件较温和； ✓容易进行代谢调控。
试管/茄子瓶斜面 麸皮/米孢子培养物
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氮玉米浆，酵母和蛋白水解液
无机盐
磷（KH2PO4），硫（硫酸盐） 其他：常量元素和微量元素
其他成分 前体（苯乙酸→青霉素，应注意对细胞的毒性） 促进/诱导剂（硫氰化苄→ 四环素） 消泡剂（植物油脂和动物油脂，聚醚类和硅油类合成消泡剂）
酶制剂等
在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊 需要，再转为天然培养基，以扩大生产。
3、药物生产菌的生长和产物合成
微生物药物是微生物的次级代谢产物，是在微生 物完成快速生长和某些营养被利用殆尽后才开 始产生的。
适宜于次级代谢产物合成的发酵条件是菌体细胞 生长的限制条件，但次级代谢产物的合成水平 又决定于菌体细胞生长状态。
在微生物药物生产发酵中如何调整培养基组成是 影响药物产量的决定性因素。
第二章 微生物制药
一、微生物药物的几个相关基本概念 二、微生物药物的分类 三、微生物药物的应用 四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 五、微生物药物的发酵生产技术 六、微生物药物的分离、精制和鉴别 七、废弃物的综合利用和环境保护
五、微生物药物的发酵生产技术
发酵菌种 种子制备 发酵生产 发酵液预处理 产品提取和精制 成品检验 成品分包装 发酵废液的环保治理
在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用 各种农副产品、工业副产品、废料等。
开发天然培养基时，应考虑：
新选微生物及其工艺的特殊营养需求； 为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件； 原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响； 培养基价格。
（2）影响微生物生长和产物合成的环境因子
工业生产菌株应满足的要求：
能够产生较高浓度的目标产物； 微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物； 产物便于分离提取； 能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维 素物质等； 不致病，不产生内毒素； 发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形 态，即发酵条件较温和； 容易进行代谢调控。
（1）产生菌株的筛选
磷酸盐控制
1）促进初级代谢、抑制次级代谢 2）阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成 3）抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性 4）增加菌体能荷，促进初级代谢
染，斜面长不超过试管2/3。 制备好的斜面菌种要求无污染，外观生长均匀，
孢子或菌体丰满，无杂菌杂色等。
米孢子的制备
质量要求：无污染，孢子数足，发芽率高，生产 能力稳定。
影响米孢子质量的因素：
米的质量——用优质品种、新米； 米的湿度——以灭菌后不结块为准； 营养液成分
营养液 调pH
大米/小米 水洗沥干 分装灭菌 摇匀培养
一般种子罐之间的接种量在5%-10%，种子罐到 发酵罐之间的接种量可以控制在20%-30%。
种子罐的控制内容包括细胞代谢状态、发酵液中 的残糖和氨氮含量、pH变化、细胞的呼吸活性等。
为了菌体细胞进入发酵罐后能很快的适应发酵培 养基条件，应该在最后一级种子罐配料上加入适 当的发酵培养基条件，如pH、消泡剂。
米孢子
斜面孢子或米孢子 孢子悬液
米孢子的制备工艺流程
摇瓶种子的制备
摇瓶种子提供的通常是丰富的营养菌体细胞。 要求无污染、生产力高、菌体浓度高、处于生 长阶段。
要求培养基组成丰富而均衡，
控制液体装瓶量，一般：40-50 ml/250ml， 60-80 ml/500ml，80-100 ml/750ml
2、生产种子的制备
保藏菌种 沙土管
实验室种子制备 二级斜面
冻干管 一级斜面
米孢子
液氮管
母瓶 子瓶
生产现场种子制备
一级 种子罐
发酵罐
二级 三级 种子罐 种子罐
种子制备的一般流程
（1）生产菌种的保藏制备
基本原则： 低营养 干燥 缺氧 低温 密封
（2）实验室种子制备
斜面菌种制备
短期存放 斜面菌种要求丰富的孢子和营养菌体细胞 斜面应软硬适中，光滑，表面无游离水，无污
添加
（3）微生物次级代谢产物发酵生产 的优化和控制
代谢调控 碳源阻遏
能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源对次级代谢产 物生物合成都表现出抑制作用——葡萄糖效应。
氮源调控
缓效氮源可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢 产物的合成；速效氮源能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产 物的合成。
温度 压力和溶氧 剪切力 pH 水活性 基质和产物的浓度
微生物药物发酵生产不同时期对基质的要求
营养
生长期
生产期
碳源 氮源 磷
容易利用并保持一定浓度
足量的有机氮源，或补充 少量无机氮源 必不可少
缓慢利用的碳源或 复合碳源 适量补充无机氮源
限制游离磷酸盐
微量元素 必不可少
适量限制
前体
不需要
（一）微生物药物工业生产菌种
工业生产用菌株不同于实验室研究菌株， 不但要求其产物合成能力能够稳定的表达， 还应追求产量尽可能的高，作为目标产品 的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的 易于提取精制等。因此。在工业生产中， 需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。
1、药物生产菌株
注意生产菌株的产物合成潜能和产物合成 的稳定性。
（1）药物产生菌的营养需求和培养基配制
培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、特 殊生长因子、水等五大类物质。
培养基配制中常用的组分
营养性质
可用组分
碳源
糖类：己糖（葡萄糖），戊糖（木糖），双糖（蔗糖、麦芽糖、 乳糖），多糖（淀粉、糊精、菊糖、纤维素）
醇类：甲醇，乙醇，多元醇
羧酸：醋酸，不饱和脂肪酸
碳氢化合物：甲烷，正丁烷，石蜡油
（3）种子罐种子的制备
种子罐的种子制备以生长营养菌体为目的， 种子罐的级数应随产物的品种及生产规模
而定，也随工艺条件的改变做适当调整。
细菌发酵一般采用二级种子发酵，即经过斜面 菌种、一级摇瓶种子、二级种子罐培养、大罐 发酵的过程。
放线菌常用三级扩大的方法培养种子。
生产现场，一级种子罐用火圈法或压力差法接种， 二、三、四级种子罐用压力差法接种。
直接从国内外的各种非盈利的微生物 菌种保藏中心购买
生产菌株的改良——重组DNA技术和 常规诱变筛选的结合
（2）生产菌株的纯化 不断纯化高产性状的菌株 筛选遗传上稳定的菌株
（3）理化诱变及筛选
细胞的准备 诱变剂的选择 诱变处理的效率 突变株的分离
（4）生产菌株基因重组改良
¤自然繁育系统 ¤原生质体融合 ¤基因工程