35微生物药物的发酵生产技术.pptx

2、生产种子的制备
保藏菌种 沙土管
实验室种子制备 二级斜面
冻干管 一级斜面
米孢子
液氮管
母瓶 子瓶
生产现场种子制备
一级 种子罐
发酵罐
二级 三级 种子罐 种子罐
种子制备的一般流程
（1）生产菌种的保藏制备
基本原则： 低营养 干燥 缺氧 低温 密封
（2）实验室种子制备
斜面菌种制备
短期存放 斜面菌种要求丰富的孢子和营养菌体细胞 斜面应软硬适中，光滑，表面无游离水，无污
工业生产菌株应满足的要求：
能够产生较高浓度的目标产物； 微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物； 产物便于分离提取； 能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维 素物质等； 不致病，不产生内毒素； 发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形 态，即发酵条件较温和； 容易进行代谢调控。
（1）产生菌株的筛选
氮源
无机氮源：铵盐，硝酸盐
有机氮源：尿素，动植物粉类，玉米浆，酵母和蛋白水解液
无机盐
磷（KH2PO4），硫（硫酸盐） 其他：常量元素和微量元素
其他成分 前体（苯乙酸→青霉素，应注意对细胞的毒性） 促进/诱导剂（硫氰化苄→ 四环素） 消泡剂（植物油脂和动物油脂，聚醚类和硅油类合成消泡剂）
酶制剂等
在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊 需要，再转为天然培养基，以扩大生产。
添加
（3）微生物次级代谢产物发酵生产 的优化和控制
代谢调控 碳源阻遏
能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源对次级代谢产 物生物合成都表现出抑制作用——葡萄糖效应。
氮源调控
缓效氮源可以防止和减弱氮代谢物的阻遏作用，有利于次级代谢 产物的合成；速效氮源能促进菌体的生长，却不利于次级代谢产 物的合成。
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生产菌株的改良——重组DNA技术和 常规诱变筛选的结合
（2）生产菌株的纯化 不断纯化高产性状的菌株 筛选遗传上稳定的菌株
（3）理化诱变及筛选
细胞的准备 诱变剂的选择 诱变处理的效率 突变株的分离
（4）生产菌株基因重组改良
¤自然繁育系统 ¤原生质体融合 ¤基因工程
一般种子罐之间的接种量在5%-10%，种子罐到 发酵罐之间的接种量可以控制在20%-30%。
种子罐的控制内容包括细胞代谢状态、发酵液中 的残糖和氨氮含量、pH变化、细胞的呼吸活性等。
为了菌体细胞进入发酵罐后能很快的适应发酵培 养基条件，应该在最后一级种子罐配料上加入适 当的发酵培养基条件，如pH、消泡剂。
（1）药物产生菌的营养需求和培养基配制
培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、特 殊生长因子、水等五大类物质。
培养基配制中常用的组分
营养性质
可用组分
碳源
糖类：己糖（葡萄糖），戊糖（木糖），双糖（蔗糖、麦芽糖、 乳糖），多糖（淀粉、糊精、菊糖、纤维素）
醇类：甲醇，乙醇，多元醇
羧酸：醋酸，不饱和脂肪酸
碳氢化合物：甲烷，正丁烷，石蜡油
（3）种子罐种子的制备
种子罐的种子制备以生长营养菌体为目的， 种子罐的级数应随产物的品种及生产规模
而定，也随工艺条件的改变做适当调整。
细菌发酵一般采用二级种子发酵，即经过斜面 菌种、一级摇瓶种子、二级种子罐培养、大罐 发酵的过程。
放线菌常用三级扩大的方法培养种子。
生产现场，一级种子罐用火圈法或压力差法接种， 二、三、四级种子罐用压力差法接种。
染，斜面长不超过试管2/3。 制备好的斜面菌种要求无污染，外观生长均匀，
孢子或菌体丰满，无杂菌杂色等。
米孢子的制备
质量要求：无污染，孢子数足，发芽率高，生产 能力稳定。
影响米孢子质量的因素：
米的质量——用优质品种、新米； 米的湿度——以灭菌后不结块为准； 营养液成分
营养液 调pH
大米/小米 水洗沥干 分装灭菌 摇匀培养
米孢子
斜面孢子或米孢子 孢子悬液
米孢子的制备工艺流程
摇瓶种子的制备
摇瓶种子提供的通常是丰富的营养菌体细胞。 要求无污染、生产力高、菌体浓度高、处于生 长阶段。
要求培养基组成丰富而均衡，
控制液体装瓶量，一般：40-50 ml/250ml， 60-80 ml/500ml，80-100 ml/750ml
在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用 各种农副产品、工业副产品、废料等。
开发天然培养基时，应考虑：
新选微生物及其工艺的特殊营养需求； 为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件； 原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响； 培养基价格。
（2）影响微生物生长和产物合成的环境因子
3、药物生产菌的生长和产物合成
微生物药物是微生物的次级代谢产物，是在微生 物完成快速生长和某些营养被利用殆尽后才开 始产生的。
适宜于次级代谢产物合成的发酵条件是菌体细胞 生长的限制条件，但次级代谢产物的合成水平 又决定于菌体细胞生长状态。
在微生物药物生产发酵中如何调整培养基组成是 影响药物产量的决定性因素。
第二章 微生物制药
一、微生物药物的几个相关基本概念 二、微生物药物的分类 三、微生物药物的应用 四、药源微生物及微生物药物的筛选技术 五、微生物药物的发酵生产技术 六、微生物药物的分离、精制和鉴别 七、废弃物的综合利用和环境保护
五、微生物药物的发酵生产技术
发酵菌种 种子制备 发酵生产 发酵液预处理 产品提取和精制 成品检验 成品分包装 发酵废液的环保治理
温度 压力和溶氧 剪切力 pH 水活性 基质和产物的浓度
微生物药物发酵生产不同时期对基质的要求
营养
生长期
生产期
碳源 氮源 磷
容易利用并保持一定浓度
足量的有机氮源，或补充 少量无机氮源 必不可少
缓慢利用的碳源或 复合碳源 适量补充无机氮源
限制游离磷酸盐
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微量元素 必不可少
适量限制
前体
不需要
磷酸盐控制
1）促进初级代谢、抑制次级代谢 2）阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成 3）抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性 4）增加菌体能荷，促进初级代谢
（一）微生物药物工业生产菌种
工业生产用菌株不同于实验室研究菌株， 不但要求其产物合成能力能够稳定的表达， 还应追求产量尽可能的高，作为目标产品 的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的 易于提取精制等。因此。在工业生产中， 需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。
1、药物生产菌株
注意生产菌株的产物合成潜能和产物合成 的稳定性。