凝胶色谱、亲和色谱(研究进展及案例)

婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量的测定


2、亲和色谱
文章名：《亲和色谱应用于天然活性成分筛选的研究进展》 作者：冯颖淑1，童珊珊2，徐希明2等 作者单位：1中国药科大学 2江苏大学 发表期刊：《中国中药杂志》 发表时间：2015年

亲和色谱法( affinity chromatography) 是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱 方法。 早在 1910 年，德国药理学家 Starken-stein 将蔗糖酶抗体吸附在高岭土上，研究了抗 体和抗原的相互作用，为亲和色谱的萌芽。 1924 年，俄罗斯学者 Engelhardt提出了“固定化配体原理”，作为分离生物活性物质 的方法，为亲和色谱分离方法的根本。 1970 年，Cuatrecases 提出了“空间间隔臂”概念和方法，成功解决了配位体的立体 可接受性问题。 1972 年，德国学者Wulff 提出分子印迹色谱方法，进一步扩展了亲和色谱的应用，使 得亲和色谱开始用于药物筛选研究。 1978 年瑞典学者 Ohlson 提出以大孔微粒硅胶作为载体的高效液相亲和色谱方法，使 得亲和色谱的发展跨入了一个新的时代。



手性拆分
德国莱比锡城大学的 Belder小组将纤维素-三（3，5－二甲基苯基氨基甲酸酯）包覆的 5μm全多孔SiO2手性固定相填充于微流控芯片的通道中，第一次利用填充的微流控芯片 （柱长58.4mm）实现了几种手性药物的快速拆分，对力莫敌提取物在 5s内就可完成拆 分。


分析检测
澳大利亚悉尼大学的 Handelsman小组采用1,2-二甲基咪唑-5-磺酰氯作为雌激素衍生化 试剂，建立了一种利用LC-MS/MS同时测定血清中衍生化的雌二醇(E2)和未衍生化的睾 酮(T)、二氢睾酮(DHT)的高灵敏检测方法。


金属有机骨架化合物（MOFs）因具有比表面积大、结构多样性、孔道尺寸可调、骨架 可修饰、热稳定性和化学稳定性良好等优点而广泛应用于分离分析等领域。西班牙 Balearic Islands大学的 Palomino课题组利用注射器设计了一种针管式自动磁性 （MOFs） 分散固相微萃取装置。


固定相


蛋白质组学
美国 Wisconsin-Madison大学的Ge小组耦合离子交换色谱/疏水色谱/反相色谱(IEC-HICRPC)3种色谱分离方法，构建了三维液相色谱(3D LC)用于整体蛋白质的分离，并证明 3D LC(IEC-HIC-RPC)技术优于传统的 2D LC(IEC-RPC)。
二、凝胶、亲和色谱案例分析
凝胶、亲和色谱
主讲人：
College of Food Science,SCAU
修德
博学
求实 创新
目录
近期中国色谱研究进展

中国色谱研究进展

中国色谱最新动态
凝胶、亲和色谱案例分析

凝胶过滤色谱 亲和色谱
一、近期中国色谱研究进展

文章名：《近年中国色谱研究进展》 作者：张祥民1、张丽华2、张玉奎2（2003年院士）


（日本TOSOH公司生产的TSK-2000SWXL粒度5μm，孔径125，可以测量分子量5,000～150,000。）

实验方法
准确称取含有大约相当于10 mg蛋白质的样品，样品溶在盛有流动相溶液的10 mL容量瓶 中，超声处理30 min。从以上样品中转移1.5 mL于10mL离心管中，加入10 μL β-硫基乙 醇，摇动混合约10 s，让样品在室温下放置至少2 h，用0.45μm微孔滤膜过滤至液相色谱 进样瓶中，然后注射进液相色谱。根据标样峰面积和浓度建立标准曲线，从而计算样品 中α-乳白蛋白含量。

选择色谱柱
α-乳白蛋白的相对分子质量为14200 u，而凝胶色谱柱TSK-2000SWXL分离样品的相对分 子质量范围为5000~150000 u，因此选择此色谱柱是比较合适的。组成蛋白质的氨基酸在 210~280 nm范围内都有不同程度的吸收，但只有色氨酸在280 nm有足够高的吸收，而α乳白蛋白含有丰富的色氨酸，因此选择280 nm作为DAD的检测波长，能获得较好的灵敏 度。
多孔整体材料作为一种新型分离介质，由于其具有制备简便、通透性好、性能稳定和 易于修饰等特点而被誉为第四代色谱分离介质。邹汉法课题组发展了一种基于光引发 巯基－丙烯酸酯点击聚合反应的新方法，并成功制备了具有高分离性能的有机－硅胶 杂化整体柱。与巯基－烯和巯基－甲基丙烯酸酯点击聚合反应相似，光引发的巯基－ 丙烯酸酯点击聚合反应不仅反应效率较高，速度快，而且反应条件非常温和。 加拿大卡尔加里大学的Thurbide小组将316不锈钢粉末（粒径44~149μm）填充于316不 锈钢毛细管柱内作为支持体，将水泵入色谱柱中，建立了以水为固定相，CO2为流动相， 与火焰离子化检测器联用的超临界流体色谱分离体系（SFC-FID）。
涉及毛细管电 泳（CE）、 气象色谱 （GC）高效 液相色谱 （HPLC）论 文增长态势
2、最新动态


样品前处理
膜蛋白的疏水性强、溶解性差和丰度低，对它的分离分析是蛋白质组学中的一大难题。 复旦大学的刘宝红教授课题组采用壳聚糖改性的介孔泡沫石墨烯(MGF-CS)作为纳米反 应器，从有机溶剂中高效富集疏水性膜蛋白并进行原位酶解。将该技术应用于实际样 品中膜蛋白的分析鉴定，采用二维液相色谱－质谱方法(2D-LC-MS)可鉴定 931种膜蛋 白，而通常采用的水溶液中酶解法仅能鉴定 73种膜蛋白。结果表明多功能的MGF-CS 对蛋白质组学中膜蛋白的分析鉴定具有重要的应用价值。 分子印迹技术是采用人工合成方法制备对目标分子有特异性识别材料的技术。由于蛋 白质体积大、结构复杂、易于变性，完整蛋白质模板分子难以获得且价格昂贵，因此 限制了蛋白质分子印迹材料的发展。中国科学院大连化学物理研究所张丽华研究员课 题组提出了一种蛋白质抗原决定基分子印迹磁性纳米材料的制备新方法。抗原决定基 印迹是以目标蛋白质上一段特异性多肽为模板分子进行印迹。由于模板肽段与目标蛋 白质间存在极强的特异性，形成的印迹位点对模板肽段及目标蛋白质均具有特异性识 别能力。
定量分析可靠
灵敏度高、稳定性好

凝胶过滤色谱：根据蛋白质相对分子质量大小进行分离，紫外吸收检测。能检测出 婴儿配方乳粉中非变性和在加工过程中变性的α-乳白蛋白总量，操作简单，准确度 高。 流动相：6 mol/L盐酸胍溶液，加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、EDTA，调pH=6.0，用 0.45 μm滤膜过滤。 色谱条件：色谱柱TSK-2000SWXL凝胶色谱柱(7.8mm×300 mm)；柱温30 ℃；流动 相流速0.5mol/L；检测波长280 nm。
1、凝胶过滤色谱（凝胶色谱分为凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱）

文章名：《凝胶过滤色谱法测定婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白》 作者：贾云虹，宋晓青，杨 凯


作者单位：河北省三元食品有限公司
发表期刊：《食品科技》 发表时间：2015年
源自文库
《食品科技》（Food Science and Technology）1975年创刊，北京市粮食科学研究所主办，1996-2011 年连续5届中文核心期刊。

背景
牛乳 80%酪蛋白+20%乳清蛋白 母乳 60%乳清蛋白
α-乳白蛋白浓度1.0~1.5 g/L，占清蛋白的 α-乳白蛋白是母乳清蛋白的主要成分，在 20% 成熟母乳中(30 d后)的浓度为(2.44±0.64) g/L

α-乳白蛋白中富含色氨酸，色氨酸是人体必需氨基酸之一。食用α-乳白蛋白和食用酪 蛋白的结果相比，大脑中的色氨酸含量比例高达48%，且减弱了中性氨基酸和色氨 酸在穿过血脑屏障时的竞争。这些依据表明，在婴儿配方乳粉中加入富含色氨酸的 α-乳白蛋白，使其接近母乳中α-乳白蛋白的含量比例，是非常必要的。
文章名：《壳聚糖螯合凝胶层析法纯化血液超氧化物歧化酶》 作者：王保，全平娟 ，张永州等 作者单位：河南大学，中科院生物物理研究所，兰州大学 发表期刊：《食品与生物技术学报》 发表时间：2014年


研究背景
超氧化物歧化酶简称 SOD，是广泛存在于生物体内的一种可防止氧化损伤和缺失的活 性酶，也是一种应用广泛的药用酶，具有抗衰老、预防辐射及治疗炎症等一系列功能， 已经被广泛应用于食品及医药卫生行业。 1975 年proath首次提出固定化金属螯合亲和层析（IMAC），利用固定在基质上的过渡 态金属离子和蛋白质表面的组氨酸、半胱氨酸、色氨酸等残基的配位作用，来实现对 金属离子有亲和力的蛋白质的吸附和分离。在制备亲和介质时，常用的金属离子有 Cu2+，Zn2+和 Ni2+等， 常用的螯合配基有亚氨基二乙酸 （IDA）， 三羧基甲基乙二胺 （TED），次氨基三乙酸（NTA）等。 固定化螯合亲和色谱常常以凝胶为载体， 如在 SephadexG-75 或者DEAE-superpose 等凝胶上用化学交联方法引入螯合剂 IDA， 再通 过交联固定和亲和配 （Ba2+，Cu2+，Zn2+）。 用该方法制备的凝胶介质生产成本很高， 软基质很易被压缩，不易被放大生产。

α-乳白蛋白检测方法 方法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 反相高效液相色谱 (RP-HPLC) 离子交换液相色谱 (FPLC) 毛细管凝胶电泳 (CGE) 液相色谱-质谱联用 (LC-MS) 优点 普适性最强 快速高效精准、重现性稳 定 快速高效精准 缺点 操作复杂，测定周期长， 重现性差，只能半定量。 只能检测出天然的α-乳白 蛋白 需要预先 把要乳清蛋白与酪蛋白分 离才可以进行 蛋白质容易在石英毛细管 上吸附，影响分离效 率，甚至堵塞毛细管柱 只能检测非变性的α-乳白 蛋白


色谱方法应用于化学领域的论文数量占46%，生物化学与分子生物学领域的占 21%， 食品科学与技术领域的占 5%，材料科学、工程学、微生物学领域的各占 4%，环境科 学、光谱学和药理学领域的各占 3%，上述领域之外的论文比例为 8%。

1990 年至 2010 年，中国科学家所发表的色谱领域论文总数以 28062 篇的数量居世界 第三位( 第一名: 美国，71008 篇; 第二名: 日本，35 035 篇) 。2010 年发表论文 4146 篇，2011 年发表 4574 篇，排名跃居世界第一。






亲和色谱法筛选技术 受体为亲和配基的色谱筛选 酶为亲和配基的色谱筛选 血浆蛋白为亲和配基的色谱筛选 以DNA为亲和配基的色谱筛选 细胞膜色谱筛选 脂筏色谱筛选 分子印迹技术 其他亲和配基（如核酸适配体亲和色谱、免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱等等。）


回归方程和检出限
称取适量α-乳白蛋白标准品，用流动相配制成0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的标准系列，按 照1.3所述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，做标准曲线，得到α乳白蛋白线性回归方程：Y=8407.6X-90.26，线性相关系数：R2=0.9998。以信噪比S/N=3 计算α-乳白蛋白的检测限为2.8 μg/mL，完全能满足婴儿配方乳粉中α-乳白蛋白含量的测 定。


作者单位：1.复旦大学 2.中科院大连化物所
发表期刊：《色谱》 发表时间：2012年 文章名：《近期色谱研究的最新动态和进展》 作者：白泉 作者单位：西北大学 发表期刊：《色谱》 发表时间：2015年
1、中国色谱发展概况

色谱归属于分析化学中的一个 分支，其出现及发展至今已将 近 110 年。色谱技术在生物制 药、蛋白质组学、生物分子的 分离分析方面都发挥着越来越 重要的作用。 20 世纪末至今，是中国色谱学 科全面快速发展的重要时期。 Web of Science 数据库和“中 国期刊全文数据库”和“万方 数据库”的检索数据( 2011 年 9 月25 日检索) 表明，1990 年 至2010 年我国科技工作者在美 国科学情报研究所科学引文索 引收录期刊( 即 SCI 期刊) 和中 国科技期刊上发表色谱相 关 论 文 132604 篇 ( 其 中 SCI 期 刊 论 文27381 篇，中国科 技期刊数据库论文 105223 篇) 。