第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法习题及答案
第三章细胞生物学研究方法习题一、选择题1 正常细胞培养的培养基中长需加入血清，主要是因为血清中含有（C ）A. 氨基酸B. 核酸C.生长因子D.维生素2 冷冻蚀刻技术主要用于（A ）。
A.电子显微镜B. 光学显微镜C.原子力显微镜D.激光共聚焦显微镜3 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（A ）A. 细胞融合B. 核移植C. 病毒转化D. 基因转移4 关于光镜的使用，下列哪项有误？（C ）A. 观察标本时，应双眼同时睁开、双手并用B. 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作C. 使用油镜时，需要在标本上滴上香柏油，将聚光器降至最低，光圈全部开放。
5 为了实现细胞内某种蛋白质的亚细胞精细定位，可对该蛋白进行标记，下面哪种标记可行（C）A. GFP标记B. 免疫荧光标记C. 免疫电镜技术D. 荧光染料直接染色6 为了提高雌性乳牛出生的比例，可在体外将携带X染色体和Y染色体的镜子分离开，进行人工授精。
最好的分离方法使（A ）A. 流式细胞分选术B. 离心技术C. 细胞电泳D. 层析7 为了观察病毒，可通过何种方法进行观察（B ）A. 相差显微镜观察B. 负染色后用电镜观察C. 激光共聚焦显微镜观察D.以上都错8 以下哪些技术一般不用于分离活细胞？（CD ）（可多选）A. 流式细胞技术B. 细胞电泳C. 超速离心D.差速离心9 某研究生为了研究一特定膜蛋白的胞质结构域的功能，需要制备和分离外翻的细胞膜泡，为了获得无污染的外翻膜泡，下列选项中，哪些是他在实验中有可能使用到的?（BD ）（可多选）A. SDSB. 凝集素C.流式细胞仪D. 柱层析10 绿色荧光蛋白GFP（Green Fluorescent Protein）基因与目的基因融合后，转入细胞后可以（ABD ）（可多选）A. 检测融合蛋白在细胞中的准确定位B. 检测目的基因所编码的蛋白在细胞中的含量C. 检测目的基因所编码的蛋白在细胞中的分子结构D. 检测目的蛋白质在细胞中的表达量E. 以上答案都不对二、填空题1 流式细胞仪可以定量测定细胞中的DNA，RNA或某种特异蛋白的含量及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量。
细胞生物学研究方法
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公司名称
举例：过氧化物酶 peroxidase ,(POX) 1.原理
血细胞中的POX能分解H2O2而释放出新生态氧，后者 可使联苯胺氧化成联苯胺蓝沉淀于细胞质酶活力处。 2.正常阳性细胞: ①. 中性粒细胞呈均匀颗粒状蓝黑色阳性。 ②. 嗜酸性粒细胞呈均匀粗大颗粒状蓝色阳性。 ③. 单核细胞呈弥散细颗粒状蓝色阳性。
› 转染（transfection）：将带有外源性基因的克隆载体或表达载体导入真核细胞的过程。
› 在表达载体启动子的驱动下，外源基因将获得过表达（over-expression），从而实现 上调细胞中的目的基因表达。
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公司名称
（一）外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要 方式
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› 应用：用于显示特定蛋白质的细胞内的定位，间接研究蛋 白之间的相互作用。
› 原理：当荧光工体与荧光受体分子彼此接近而供体的发射 光谱与受体的激发光谱重叠时就会通过偶极子相互作用， 实现了能量向邻近的受体分子转移，一种非辐射能量跃迁， 通过荧光显微镜可以观察到这种改变。
› 特点：①受、供体的激发光要足够分得开；②供体的发光 光谱与受体的激发光谱要重叠。
› 缺点：只能说明两个蛋白之间有相互作用的结构基础，并不标示这两 个蛋白在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞中确实存在，需 要用免疫共沉淀进行验证。
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公司名称
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› （三）吞噬体展示可筛选存在相互作用的蛋白质 › 被筛选蛋白cDNA与噬菌体的衣壳蛋白DNA构建成融合基因，使被筛
›
光或改变本身荧光的发射波长与强度，从
而
›
通过荧光检测可以显示该离子的量。
细胞生物学第三章细胞生物学研究方法知识讲解
利用放射性标记技术研究生物大分子 在细胞内的合成动态
步骤
– 适宜的放射性前体分子标记机体或细胞 – 常规制片 – 暗室敷乳胶(核子乳胶3-10m) – 暗盒暴光或自显影 – 显影、定影、观察
与显微自显影区别
敷胶要单层晶体 暴光时间长
定量细胞化学分析技术
细胞显微分光光度术(Microspectrophotometry) 利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收， 测定这些物质(如核酸与蛋白质等)在细胞 内的含量 包括： 紫外光显微分光光度测定法 可见光显微分光光度测定法 BACK
0.2 m
电子显微镜技术(Electro microscopy)
0.2nm
扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope)
3nm, 0.7nm
扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope)
（侧0.1-0.2，纵0.001nm）
BACK
光学显微镜技术
自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基 绿、吖啶橙)
优点：
– 多种成分定位 – 只有激发荧光可成像，敏感度高 – 染色简便 – 标本呈彩色图像 – 固定细胞和活细胞
数字成像显微技术
图像后期处理，提高信/噪比、放大信号 摄像机和计算机 原理：摄取同一区域多幅图像，信号经
计算机放大、假信号减弱或消除
BACK
扫描遂道显微镜原理
量子力学中的隧道效应，即在低电压下，二电 极之间具很大阻抗，阻止电流通过(势叠)
当二电极间近到一定距离时，电极间产生了电 流(隧道电流)，且Iexp(-2Kd)，d为针尖与样品 间距离，K为常数，d转化为I的函数而被测定
扫描探针与样品接触或达到很近距离时，即产 生彼此间相互作用力，并在计算机显示出来，从 而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等
第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术)
显微镜技术
显微镜的成像原理
无论是何种显微镜，镜像的形成都需要3个基本要素：照 明系统；被观察的样品；聚焦和成像的透镜系统。
光源 聚光镜 样品 物镜
光源 透镜
射线扫描器
聚 光 镜
样品
目镜
电视屏观 察图像
直接成像
荧光屏观察 图像
光学显微技术
在细胞生物学的领域中，光学显微镜作为研究细胞显微
结构的重要工具和手段是应用最早也是最广的一种。光学显 微镜是利用可见光作光源，通过一组玻璃透镜包括目镜、物 镜、聚光镜放大被观察物体，提高分辨率的仪器。分辨率指： 人眼在25厘米的明视距离处分辨物体结构最小间距的能力。
载物台的上方：
光源
长焦距聚光器 载物台的下方： 物镜 应用：直接对培养的 细胞进行观察
荧光显微镜
原理:
荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线， 并发射出比原来吸收波长更长的光。
紫外光 可见光 红外光
λ short
long
基本构造：
A 光源 B 二向色镜：反射短波光线，透过长波光线 C 一组滤光片：得到纯的激发光和发射光
透射电镜生物标本制备过程 (自学）
(1)取材
(2)固定:防止产生结构改变。 戊二醛：在蛋白质分子之间形成共价键, 将它们交联在一起。 四氧化锇：除与蛋白共价结合外,还对脂类有良好的固定效果。 (3)脱水：标本必须置于高真空中进行电镜观察,所以电镜生物标本 不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切片耐受高真空、 电子轰击，应在切片前将标本进行包埋,常用环氧树脂。 (5)切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm厚薄片。约为细 胞的1/200厚度。 (6)染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成，它们散射电子能力 弱,在电镜下几乎不存在明暗反差,需加大生物样品反差,进行染 色。重金属浸染。
细胞生物学细胞生物学研究方法
Methodology of Cell Biology
Cells are (relatively) small and complex. How do we study them?
第三章 细胞生物学研究方法
第一节 显微技术 • 一、光学显微镜
• 二、电子显微镜
• 三、显微操作技术 第二节 细胞分离与细胞培养 第三节 细胞及其组分的分析方法 第四节 细胞生物学研究常用的模式生物
antibodies for immunocytochemistry
Immunofluorescence staining for Golgi (blue) actin (green) histones (red)
颜色†
吸收 光谱 (nm)
发射 光谱 (nm)
Alexa Fluor 蓝色 350 — 405 紫色 — 430 绿色 — 488 蓝绿色 — 500 绿色 — 514 绿色 — 532 绿色 — 546 黄色 — 555 黄绿色 — 568 橙色 — 594 橙红色 — 610 红色 — 633 红色 — 647 红色 — 660 红色 — 680 红色 — 700 红色 — 750 红色
4. 绿色荧光蛋白
Fluorescence microscopy exploits special molecules called fluorophores（荧光团）
Fluorescent dyes/fluorophores absorb light (energy) of a specific color (wavelength)
收特定波长的短波光线，并发射 出比原来吸收波长更长的光。
照明方式通常为落射式
第三章细胞生物学技术
构造上，相差显微镜不同于光镜之处：
1、环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，使透过聚光器 的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
2、相位板（annular phaseplate）在 物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将 直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。
Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and therefore brightness, is decreased.
暗视野显微镜光学显微镜受照射光波长的限制在可见光下其分辨极限只有02m即使在紫外光下最大分辨率也只有01要观察更精细的结构只有借助分辨率更高的电子显微镜
第三章 细胞生物学研究方法
Chapter 3 Techniques in Cell Biology
第一节 显微技术
细胞生物学的建立和发展得益于光学显 微镜的发明； 电子显微镜的发明使对细胞结构和功能 的研究达到了新的水平。
Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gastrulastage Drosophila embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-of-focus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the embryo.
第三章 细胞生物学的研究方法练习题及答案
第三章细胞生物学的研究方法名词解释1.分辨率( resolution)2.细胞培养( cell culture)3.原代培养( primary cult)4.传代培养( secondary culture)5.细胞系( cell lin)6.等电聚焦电泳( isoelectric focusing)7.cDNA克隆( CDNA cloning)8.非细胞体系( cell free system)9.蛋白质组学( proteomics)10.核酸原位杂交技术( in situ hybridization,ISH)11.放射性自显影技术( autoradiography)12.显微结构( microscopic structure)13.超微结构( ultramicroscopic structure)14.单细胞测序技术( single cell sequencing)15.转基因小鼠( (transgenic mouse)二、单项选择题1.离心法是分离细胞器及细胞组分的重要手段,下面描述错误的是A.差速离心法只能将大小显著不同的成分分开B.平衡沉降法分离取决于细胞成分的大小和形状C.利用免疫磁珠,无需高速离心,即可将膜性细胞器分离出来D.速度沉降可以使tRNA与其他成分分开E.超速离心法可以根据生物大分子的沉降系数较精确的测定其分子量2.检测特异DNA分子的方法是A.噬菌体展示B.ISHC. Western blotD. Southern blotE. ChlP3.苏丹染料可以显示的细胞中成分是A.蛋白质B. DNAC. RNAD.糖E.脂肪4.扫描隧道显微镜的侧分辨率约为A.2μmB.0.2μmC. 0.2nmD.2nmE.2Å5.目前广泛应用的高效基因敲除技术是A.cDNA克隆B. RNAiC.CRISPR/Cas9D. ChIPE.转基因6.可得到完整的细胞三维结构图像的显微镜是A.透射电子显微镜B.荧光显微镜C.暗视野显微镜D.相差显微镜E.共聚焦激光扫描显微镜7.关于免疫沉淀技术的错误描述是A.用耦联在磁珠上的目的蛋白抗体将目的蛋白及其相互作用的蛋白沉淀出来B.可通过SDS=PAGE或生物质谱对沉淀出来的蛋白进行鉴定C.属于体内实验方法,能得到细胞内蛋白相互作用的动态结果D.细胞内本来没有相互作用的蛋白质在破碎细胞时可能发生凝聚,产生假阳性E.简便易行8.无需染色、标记,即可直接用于观察活细胞状态的显微镜是A.扫描电子显微镜B.透射电子显微镜C.普通光学显微镜D.倒置相差显微镜E.荧光显微镜9.关于RNAi的基本原理,错误的描述是A. Dicer酶将外源性双链RNA切割成短 SIRNAB. SIRNA参与形成RNA诱导沉默复合物C.每个RISC都包含一个 SIRNA和一个 DicerD.激活RISC需要依赖ATP将小分子RNA解双链E.激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上10.制作透射电子显微镜超薄切片时,下列不必要的是A.固定B.包埋C.切片D.金属投影E.染色11.能够在溶液中对生物大分子进行高分辨率结构测定的技术是A.X射线晶体衍射技术B.核磁共振技术C.扫描电子显微镜D.冷冻电镜E.共聚焦激光扫描显微镜12.透射电子显微镜借助一定的技术手段可获取细胞亚显微结构的三维图像,下面手段不可行的是A.金属投影B.金属复型C.金属染色D.冰冻断裂E.冰冻蚀刻技术高13.与化学合成的 SIRNA相比,利用慢病毒构建的短发卡 shrna载体所具有的显著优势是A.更特异地阻断特定基因表达B.效率更高C.可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达D.操作更简便E.有正反互补的短干扰RNA序列14.关于冷冻电子显微镜技术的错误描述是A.对溶液中生物分子进行高分辨率结构测定B.需要比较大量的样品C.结构解析主要是指单颗粒三维重构技术D.不需要样品结晶E.快速冷冻可以使蛋白质保持其天然结构状态15.能够从组织切片中精确分离单一细胞的方法是A.免疫磁珠法B.荧光激活细胞分选仪C. Percoll精细密度梯度离心D.细胞克隆E.激光捕获显微切割技术16.有关原子力显微镜的错误描述是A.在扫描隧道显微镜基础之上发展起来的B.不需要所检测的样品具有导电性C.可对单个分子进行操控D.分辨率比扫描隧道显微镜高E.显示样品表面微细结构的三维特征17.用物理的方法裂解细胞产生的微粒体,主要来自的细胞器是A.过氧化物酶体B.高尔基复合体C.线粒体D.溶酶体E.内质网18.一般情况下,细胞裂解液中不能含有的成分是A.渗透压维持剂B.蛋白酶C.阴离子去垢剂SDSD.非离子型去垢剂 Triton X-100E.兼性离子型去垢剂 CHAPS19.生物医学研究中,最常用于个体水平基因操作特别是基因敲除的模式动物是A.小鼠B.果蝇C.秀丽隐杆线虫D.斑马鱼E.爪蟾20.操作简单、特异性强,能够在多细胞悬液中分离特定细胞的方法是A.免疫磁珠法B.荧光激活细胞分选仪C. Percoll精细密度梯度离心D.利用细胞贴壁生长和悬浮生长的特性进行细胞培养E.激光捕获显微切割技术21.细胞培养时所用的培养基中不包含A.血清B.氨基酸C.二氧化碳D.维生素E.微量元素22.考察细胞侵袭和转移能力变化的方法是A.嵌套小室( transwell法)B.软琼脂集落形成实验C.细胞生长曲线绘制D.流式细胞仪的DNA倍体分析E.细胞活力检测(MTT法)23.常用于细胞DNA和RNA抽提的试剂是A.渗透压维持剂B.蛋白酶抑制剂C.异硫氰酸胍D.阴离子去垢剂E.兼性离子型去垢剂24.将细胞匀浆以100000g超速离心,上清液部分含有A.线粒体B.溶酶体C.细胞核D. RNAE.微粒体25.超分辨显微技术可使光学显微镜的分辨率达到A.2μmB.50nmC.0.2nmD.2nmE.2Å26.对体外非细胞体系进行蛋白翻译,不需要的成分或结构是A.已知序列的mRNAB. IRNAC.核糖体D. ATPE.RNA聚合酶I(PolⅡ)27.一般来说,分离纯化蛋白质最有效的方法是A.亲和层析B.阴离子交换层析C.阳离子交换D.凝胶滤过层析E.疏水性层析28.能揭示蛋白质精确三维结构的方法是A.扫描电子显微镜B.柱层析C.X射线晶体衍射技术D. SDS-PAGEE.共聚焦激光扫描显微镜29.用凝胶滤过层析分离蛋白,最先流出的蛋白的分子量为A 500kDa B.200k Da C.100kDaA.50kDa E.10kda030.从细胞中分离染色质,抽提液中不能含有A.DNA酶B.RNA酶C.异硫氰酸胍D.氯仿E.蛋白酶K31.二硫苏糖醇(DTT)在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的作用是A.与蛋白质疏水区结合B.使蛋白质带负电荷C.使蛋白质中的二硫键断裂D.使蛋白质分子折叠E.控制凝胶孔的大小32.电子显微镜观察生物标本的分辨率约为A. 2μmB.0.2μmC.0.2nmD.2nmE.2Å33.SDS在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的作用是A.与蛋白质亲水区结合B.控制凝胶孔的大小C.使蛋白质中的二硫键断裂D.使蛋白质分子折叠E.使蛋白质带负电荷34.高通量测序技术可与其他基因组水平研究技术相联合,但不包括A.Protein-sepB. RNA-seqC. ChIP-seqD.CLIP-seqE.Methyl-seq35.关于核酸电泳的错误描述是A.是核酸分离鉴定的主要方法B.样品不需事先处理就可直接进行电泳C.核酸在碱性条件下向阳极移动D.可直接判定核酸的纯度、完整性及片段大小E.琼脂糖凝胶电泳分辨率高于丙烯酰胺凝胶电泳36.下列关于生物芯片技术的错误叙述是A.由生物学、微电子学、物理学和计算机科学等多学科交叉融合而成B.主要包括基因芯片和蛋白质芯片C.基因芯片中,荧光素直接标记待检测的mRNA分子D.可用于筛选候选基因E.可通过蛋白质-蛋白质间的相互作用对靶蛋白分子进行高通量检测37.关于免疫细胞化学技术,错误的描述是A.利用抗原抗体特异性结合的原理来研究细胞中生物大分子的定位B.利用荧光染料标记的抗体可以对细胞中的特定分子进行定位C.将荧光物质或酶类直接标记一级抗体可以提高检测灵敏度D.利用胶体金标记抗体,可在电镜下观察特定分子的分布情况E.可对器官、组织、细胞中的生物分子进行定性、定位研究38. Western blot不可以用于检测蛋白质的A.含量B.大小C.三维结构D.磷酸化E.泛素化39.放射性自显影技术是用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质,下列属于强放射性同位素的是A.131IB.35SC.3HD.32PE.14C40.可用于观察细胞表面三维结构的显微镜是A.扫描电子显微镜B.透射电子显微镜C.暗视野显微镜D.相差显微镜E.荧光显微镜41.关于绿色荧光蛋白(GFP)的错误描述是A.是研究蛋白质亚细胞定位的报告分子B.是从水母中分离的一种构象很稳定的蛋白质C.在蓝色光源的激发下,可发射出绿色荧光D.GFP基因可以很容易地导入到多种类型的细胞中表达E.与目的基因融合后,所表达的融合蛋白的定位是由GFP决定的42.关于 Northern印迹分析的错误描述是A.可检测组织或细胞中特定的mRNAB.可使用放射性物质标记的寡核苷酸为探针C.不能有效地检测小 mirna分子D.能够定量检测mRNA的变化E.能够提供基因不同转录本的转录长度信息43.双向电泳显现的未知差异蛋白质条带或点,常常需要进一步鉴定,最精确的判定方法是A.免疫沉淀B.亲和层析C.质谱D.高压液相层析E.Western blot44.研究蛋白质与核酸相互作用的技术是A.酵母双杂交B.染色质免疫沉淀C.噬菌体展示D.基因芯片E.免疫沉淀45.使基因表达下调的常用技术是A.cDNA克隆B. RNAiC.同源重组D. ChlpE.转基因46.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是A.疏水性B.分子量大小C.所带正电荷多少D.所带负电荷多少E.形状特点47.有关扫描电子显微镜的错误描述是A.可以直接观察标本表面的三维形态B.分辨率比透射电镜高C.通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像D.样品需经固定、干燥并用重金属膜覆盖E.多用于细胞整体的观察48.将蛋白质进行分级分离并最终进行纯化,常需要综合运用多种分离手段才能够完成,但A.盐析B.有机溶剂沉淀C.亲和层析D.高压液相层析E.双向电泳49.能够将特定基因插入到基因组的技术是A.cDNA克隆B. RNAiC.酵母双杂交D.ChIPE.CRISPR/Cas950.最早制造出第一台显微镜并用它观察到细菌的科学家是A. L. HoekB.R. HookC. M. J SchleidenD.R.VirchowE.A.van Leeuwenhoek51.与普通PCR不同的是,荧光实时定量PCR在反应体系中需加入A.模板DNAB.耐热的DNA聚合酶C.dNTPD.荧光染料E.引物52.关于超分辨显微技术的错误叙述是A.利用380~740nm可见光B.具有非接触、无损伤的特点C.可观测细胞内部结构的特点D.难以进行内部深层三维结构成像E.可以观测活的组织或细胞53.以脂质体为载体,将外源性基因导入真核细胞的过程称A.转化B.转导C.转染D.感染E.转位54.检测特异蛋白质分子的方法是A. PCRB.FISHC. Southern blotD. Northern blotE. Western blot55.关于 CRISPR/Cas9基因编辑技术的错误描述是A.Cas有核酸酶活性B.Cas是 CRISPR连接蛋白C.CRISPR序列转录产生两个非编码RNA分子D.Cas蛋白能够将异二聚体RNA剪切加工成为成熟RNA分子E.Cas识别靶DNA位点的特异性完全由向导序列所决定56.细胞内离子有着重要的生理功能,其中能够起信号转导和促进膜融合作用的离子是A.钠B.钾C.钙D.铜E.铁57.高压液相层析的反向层析柱常常被用来分离小分子蛋白,其进行分离原理是根据蛋白的A.疏水性B.分子量大C.所带正电荷多少D.所带负电荷多少E.形状特点58.可用于研究DNA与蛋白质相互作用,并能捕捉基因表达调控的瞬时事件的方法是A. ChipB. EMSAC.酵母单杂交系统D. CLIPE.噬菌体展示59.单分子荧光成像是活细胞体系中单分子研究的核心技术,其在细胞生物学研究中的应用A.蛋白质结构的解析B.配体与受体的结合C.蛋白质的聚合和解聚D.mRNA的动力学行为E.病毒的示踪60.关于紫外交联免疫沉淀技术的错误叙述是A.能检测整个细胞内与特定RNA结合蛋白结合的RNA分子B.分辨率可达单个碱基水平C.常与高通量测序技术联合应用D.254nm紫外线照射交联对细胞没有损伤E.能够在全基因组水平揭示RNA与RNA结合蛋白相互作用多项选择题1.从实体组织中分离活细胞的第一步是制备游离的细胞悬液,关于常用的酶解方法的正确描述是A.EDTA和EGTA能够增加胰蛋白酶的活性B.胰蛋白酶、胶原酶消除细胞间的连接和细胞外基质C.分离体系所用的溶液必须是等渗的D.分离体系应保持低温,以降低细胞的代谢活动E.所用的试剂、器皿需要过滤除菌或高压灭菌2.关于染色质免疫沉淀技术的正确描述是A.是一种体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法B.仅限于低通量的研究C.能够捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件D.分离得到的DNA可直接测序获得基因序列信息E.比电泳迁移率变动分析更能反映基因表达调控的真实情况3.关于核酸抽提的正确叙述是A.异硫氰酸胍可使膜脂、蛋白变性B.氯仿可去除细胞内的脂类C.在纯化过程中加入对应的核酸酶可选择性地保留DNA或RNA分子D.通过离心沉淀的方式可获得保留在水相中的核酸分子E.蛋白酶K能使DNA酶和RNA酶失活,不能添加在抽提液中4.酶细胞化学反应的基本原理是将酶与其底物共同孵育,使产物与显色剂反应,生成物一般包括A.荧光分子B.细胞色素C.有色沉淀D.高电子密度沉淀E.有色可溶性化合物5.单细胞测序技术取得突破的主要原因包括A.全基因组及转录组扩增的效率大幅度提高B.高通量测序技术的使用C.高效微流体技术分离单细胞技术的应用D.高精密的荧光活化细胞分选技术的应用E.激光显微切割技术的应用6.可用于活细胞内分子示踪的技术是A.离子探针技术B.绿色荧光蛋白示踪C.荧光共振能量转移D.单分子示踪E.印迹杂交7.基因芯片技术可应用于A.细胞的基因表达谱测定B.筛选与基因相互作用的蛋白质C.基因多态性分析D.基因突变分析E.筛选候选基因8.基因表达定量分析技术包括A.印迹杂交技术B.原位杂交技术C.嵌套小室( transwell法)D.荧光实时定量PCR技术E.基因克隆技术9.关于蛋白质组学的正确描述是A.是基因组学研究进入功能基因组时代的主要标志B.双向电泳和质谱技术是蛋白质组学研究的基本技术C.双向电泳能有效分离高分子量及微量蛋白D.质谱法能够实现高通量分析E.蛋白质的质谱测序通常借助串联质谱10.研究或利用蛋白质与蛋白质相互作用的技术包括A.酵母双杂交B.蛋白质芯C.噬菌体展示D.紫外交联免疫沉淀技术E.免疫沉淀参考答案名词解释1.分辨率(resolution):指显微镜或人眼能够区分相近两点的最小距离。
《细胞生物学》考研习题解析(第三章 细胞生物学研究方法和技术)
第三章细胞生物学研究方法和技术一、名词解释荧光漂白恢复技术：即fluorescence photobleaching recovery，FPR或fluorescence recovery after photobleaching，FRAP。
首先利用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，然后利用高能量的激光束照射被被标记的特定区域，使该区域标记分子的荧光发生不可逆淬灭而被漂白。
因非照射区域荧光标记分子的移动，使得漂白区域逐渐恢复荧光。
该技术可用于研究蛋白质的运动。
酵母双杂交技术：该技术用于研究蛋白质之间的相互作用。
放射自显影技术：利用放射性同位素（如3H、14C等）的电离辐射对乳胶（含AgBr 活AgCl）的感光作用，研究样本中放射性化合物在机体、组织和器官、细胞中的分布、定位、运动等生物学活动。
二、选择题1. 正常细胞培养的培养基中常需要加入血清，主要是因为血清中含有（）。
A 氨基酸；B 核酸；C 生长因子；D 维生素。
【答案及解析】C。
加入血清主要是为培养基增加生长因子。
2. 冰冻蚀刻技术主要用于（）。
A 电子显微镜；B 光学显微镜；C 原子力显微镜；D 激光共聚焦显微镜。
【答案及解析】A。
冰冻蚀刻技术属于电镜制样技术之一，另外还有超薄切片技术、负染色技术、电镜三维重构与低温电镜技术、扫描电镜技术等。
3. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪种技术构建的？（）A 细胞融合；B 核移植；C 病毒转化；D 基因转移。
【答案及解析】A。
4. 关于光镜的使用下列哪项有误？（）A 观察标本时，应双眼同时睁开，双手并用；B 按照从低倍镜到高倍镜到油镜的顺序进行操作；C 使用油镜时，需要在标本上滴香柏油，将聚光器降至最低，光圈关至最小；D 使用油镜时，不可一边在目镜中观察，一边下降镜筒或上升载物台。
【答案及解析】C。
三、填空题1. 体外培养的细胞，不论原代还是传代细胞一般不保持体内原有的细胞形态。
细胞生物学名词解释及思考题
名词解释：第三章细胞生物学研究方法非细胞体系：来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系。
原位杂交：将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。
原位分析：在保持细胞结构的基础上，某些化学物质（显色剂）和细胞内某种成分发生化学反应，在细胞局部范围内形成有色沉淀物，从而对细胞化学成分进行定性或定位。
用于对某些细胞成分进行定性和定位研究。
放射自显影技术：利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。
第四章细胞质膜脂质体：脂质体是一种人工膜。
在水中，搅动后磷脂形成脂双层分子的球形脂质体，直径25~1000nm不等。
人工脂质体可用于：转基因、制备药物和研究生物膜的特性。
脂筏：在以甘油磷脂为主体的生物膜上，胆固醇、鞘磷脂等形成有序的脂相，如同漂浮在脂双分子层上的“脂筏”一样载着执行某些特定生物学功能的各种膜蛋白。
膜骨架：膜骨架是指细胞质膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网架结构，它参与维持细胞质膜的形状并协助质膜完成多种生理功能。
生物膜：质膜和内膜总称为生物膜。
细胞质膜是指围绕在细胞最外层，由脂质和蛋白质组成的生物膜，所以又称细胞膜。
围绕各种细胞器的膜，称为细胞内膜。
生物膜是细胞进行生命活动的重要物质基础。
第五章物质的跨膜运输水孔：即水通道，是内在膜蛋白的一个家族，在各种特异性组织细胞中提供了水分子快速跨膜运动的通道。
对水有高度特异性，只容许水而不容许离子或其他小分子溶质通过。
P-型离子泵：其原理与钠钾泵相似，每分解一个A TP分子，泵出2个Ca2+。
位于肌质网上的钙离子泵占肌质网膜蛋白质的90%。
V-型离子泵：存在于各类小泡膜上，水解A TP产生能量，但不发生自磷酸化，位于溶酶体膜、植物液泡膜上。
F-型离子泵：H+ 顺浓度梯度运动，利用质子动力势合成A TP，也叫A TP合酶，位于细菌质膜，线粒体内膜和叶绿体的类囊体膜上。
第三章 细胞生物学研究方法
第三章细胞生物学研究方法一．名词解释1.福尔根反应：特异显示DNA分布的反应。
酸水解可除去RNA，仅保留DNA，冰出去DNA 上嘌呤脱氧核糖核苷键上的嘌呤，使脱氧核糖的醛基暴露。
所暴露的自由醛基与西夫试剂反应呈紫红色。
2.负染色：用重金属盐(如磷钨酸钠、醋酸铀等)对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。
染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的，反衬出样品中的生物大分子及其复合物的形态。
3.原位杂交：用标记的核酸探针通过分子杂交确定特意核苷酸序列在染色体上火细胞中的位置的方法。
4.原代培养：直接从动物体内获取细胞进行首次培养，称原代培养。
5.传代培养：原代培养的细胞在一个容器中增殖到一定的密度后，将细胞分散到多个容器中继续培养的方式称传代培养。
6.细胞株：从原代培养细胞群中筛选出的具有特定性质或标志的细胞群，一般可顺利地传40-50代次，它保持染色体二倍体的数量及接触抑制行为。
7．细胞系：从肿瘤组织培养建立的细胞群或培养过程中发生突变或转化的细胞，使其获得“不死性”特征，从而无限增殖，从正常组织或胚胎组织也可以建立细胞系，这是一个含有多个细胞谱系的混杂细胞群体。
8.探针：带有放射性同位素、生物素或其他活性物质标记的某种特定的DNA或RNA片段，用于核酸分子杂交技术以检出标本中待测核酸分子。
9.超薄切片：是一种主要的透射电子显微镜制样技术，利用超薄切片机将样品切成40-50nm 左右，穿透很弱的电子束才能透过。
其主要步骤为：固定、脱水、包埋、切片、染色。
二．填空1、细胞生物学常用的光镜有相差显微镜、微分干涉显微镜、和荧光显微镜。
2、利用超速离心机对细胞组分进行分级分离的常用方法有差速离心和密度梯度离心。
3、单克隆抗体技术是将B淋巴细胞与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
4、对电镜观察的生物样品有_要求样品很薄和保持样品的精细结构5、贴壁生长的细胞具有三个特点：单侧生长、形态多变、接触抑制。
细胞生物学-3细胞生物学研究方法
02
Charged Plates
Fluorescence Activated Cell Sorting
添加标题
1
添加标题
2
+
添加标题
3
Single cells sorted into test tubes
添加标题
4
FALS Sensor
添加标题
5
Fluorescence detector
应用：胶体金粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽聚合物等结合，因而在基础研究和临床试验中成为非常有用的工具。
免疫胶体金标定(Immunogold labeling)
利用了胶体金颗粒具有高电子密度的特性，在蛋白质与金粒子结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒。因此，可以观察蛋白质的分布区域。
基本原理： 氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶状溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。 胶体金标记：实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程。
吸附机理：因胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸值被各种不同颜色的胶体金颗粒。
细胞培养
在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。
人的细胞培养
细胞系: 原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，有无限的传代能力。 细胞株: 通过原代培养或经过细胞克隆与选择而建立的、具有特异的性质或标记的细胞系，但是它们具有有限的传代能力。
细胞生物学题库第3章(含答案)
《细胞生物学》题库第三章细胞生物学研究方法一、名词解释1．Resolution2. fluorescence3. Fluorescence microscope4. Phase contrast microscope5. autoradiography6. scanning electron microscopy，SEM7. scanning transmission electron microscopy，STEM8. high-voltage electron microscopy，HVEM9. negative stainning10. shadow casting11. scanning tunneling microscope，STM12.enzyme cytochemistry13. immunofluorescence14. immunoelectron microscopy15. chromosome sorting16. microspectrophotometry17. microfluorometry18. nuclear magnetic resonance，NMR19. cell engineering20. primary culture21. callus，culli22. cell fusion23. monoclonal antibody technique24. micromanipulation25. differential centrifugation26. isodensity centrifugation27. chromatography28. gel filtration chromatography29. affinity chromatography30. gene engineering31. gene cloning32. gene knockout33.karyoplast34.cytoplast35.cell culture36.贴壁生长37.contact inhibition38.mass culture39.clonal culture40. primary culture41.subculture42.单层细胞培养：43.转鼓培养44.primary cell45.subculture cell46.cell strain47.cell line49.clone50.explant二、填空题1. 物质经过紫外线照射后发出荧光的现象可分为两种情况，第一种是，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光；第二种是，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光。
细胞生物学-第3章-细胞生物学研究方法(翟中和第四版)
基础上，添加 “环状光阑”和
“相差板”，将光程差或相位差， 转换成振幅差。 • 这是在构造上，相差显微镜不同于 普通光学显微镜两个特殊之处。
体外培养MDCK 细胞在普通（明视场）光学显微镜（A） 和相 差显微镜（B）下拍摄图像效果的比较
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
（一）普通复式光学显微镜——样品制备
甲醛
石蜡
5μm
（二）相差显微镜和微分干涉显微镜
相差显微镜
发明： 1934~1935 荷兰物理学家Zernike 设计和发明相差显微 镜，并获得诺贝尔奖。
原理：利用光线干涉的原理把透过标本的可见光的光程差变 成振幅差，表现为明与暗的对比，从而提高了各种结构之间 的对比度，使标本的各种结构变得更清晰。
（Байду номын сангаас）荧光显微镜——基本原理
特点： 1. 利用汞灯或氙灯作为荧光激 发光源，波长较短，分辨 率高于普通显微镜； 2 . 核心部件是滤光片系统及专 用物镜镜头； 3. 滤光片系统由激发滤光片和 阻断滤光片组成。 应用： 对细胞内生物大分子进行 定性、定位研究。
520~560nm的 绿色荧光透过
阻断滤光片
用超速离心技术分离细胞组分
组织匀浆
差速离心
密度梯度离心
分离出各组分
用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物 差速离心：分离密度不同的细胞组分
密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离
二、细胞成分的细胞化学显示方法
• 显色剂与细胞组分中特殊基团的结合 • 通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断蛋白质、 核酸、多糖和脂质在细胞中的分布和相对含量
福尔根反应 Feulgen stain
第三章 细胞生物学研究方法
越强。 15. 用 Triton 等去垢剂可以抽提细胞中的微管、微丝等蛋白质结构。 16. 相差显微镜可以用来观察活细胞和未染色的标本。
18. 当前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位最有力的工具是： A. 暗视野显微镜 B．荧光显微镜 C．倒置相差显微镜 D．普通光学显微镜
19. 关于相差显微镜下列说法错误的是： A. 基本原理是以样品密度差别为基础，将光程差转换成振幅差，形成明暗区别 B．样品不需要染色 C．可以观察活细胞 D．可以对细胞的生物大分子进行定位和定性分析
25. 建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞是通过下列哪项技术构建的： A. 细胞融合 B．核移植 C．病毒转化 D．基因转移
三、判断题
1. 对显微镜来说，最重要的性能参数是放大倍数。 2. 普通光镜的应用原理是：不同的染料对某种细胞组分有特异的吸附，形成足够的反差或
产生不同波长的光谱以区分细胞组分。 3. 亚显微结构即超微结构。 4. 经冷冻蚀刻技术处理后的样品，在电子显微镜下所观察到的图像是样品本身所形成的。 5. 经过流式细胞仪分离出来的细胞不能继续培养。 6. 体外培养的细胞一般均保持体内原有的细胞形态。 7. 透射或扫描电子显微镜不能用于观察活细胞，而相差或倒置显微镜可以用于观察活细胞。 8. 扫描隧道显微镜是具有原子显像力的显微镜。 9. 提高显微镜的分辨率，可通过缩短波长，或给标本染色。 10. 在光学显微镜下观察到的细胞结构称为亚显微结构，在电子显微镜下观察到的结构称为
细胞生物学的研究方法
第三章细胞生物学的研究方法一、填空题1．透射电子显微镜由、、、三部分所组成。
2.在酵母人工染色体制备过程中，要用酶脱去酵母的细胞壁，使之成为、并且用进行观察和计数。
4.观察贴壁生长的培养动物细胞可用，而观察脱去细胞壁的植物细胞，则要用。
5. 物质在紫外光照射下发出的荧光可分为和两种，其中需要将被照射的物质进行染色。
6．用紫外光为光源照射物体比用可见光的分辨率要高，这是因为。
7．通过或形成的细胞叫细胞株。
9.灭活的仙台病毒之所以能够诱导细胞融合，是因为。
10. 相差显微镜与普通显微镜的不同是用替代可变光阑，用代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
11．倒置显微镜与普通显微镜的不同在于其。
12．若用紫外光为光源，光学显微镜的最大分辨率为，透射电子显微镜的最大分辨率为，扫描电镜的分辨率为。
13. 显微镜的分辨本领是指能够能力，用来表示。
14．高压电镜的电压在120kV以上，优点是：、。
16. 细胞培养的突出特点是：可在。
18.贴壁生长的细胞有三个特点：①；②；③。
19. 用细胞培养法来研究生命活动规律的局限性是。
20．超薄切片染色常采用、染色。
21．免疫细胞化学技术是用来定位细胞中的物质。
22．电子显微镜使用的是透镜，而光学显微镜使用的是透镜。
23.电子染色是用来增强电子的散射能力。
24．在光学显微镜下见到的结构称为，在电子显微镜下见到的结构称为。
25．细菌质膜的多功能性主要表现在：具有的呼吸作用，具有的分泌作用，具有的信号传导作用。
27.在同位素追踪技术中，用于研究DNA的同位素标记的前体物是。
28．单克隆抗体技术是将与无限繁殖的肿瘤细胞杂交的技术。
29. 可用技术来研究质膜结构的不对称性。
31.动物细胞培养所用的合成培养基中除含多种、和外，一般还需加入。
32．用荧光显微镜观察细胞时，经吖啶橙染色的细胞中的DNA发荧光，而RNA发荧光。
33．适于观察活细胞的光学显微有、和等。
34．分辨率是指人的肉眼或显微镜在25cm处能够分辨到的相邻两个物体间最近距离的能力。
细胞生物学习题答案
细胞生物学习题答案第三章细胞生物学研究方法一.名词解释：1.细胞株：从原代培养物中接种出来的一群不均一的细胞群（染色体数目不变，不能无限长期传代、繁衍）。
2.细胞系：细胞系一般都是转化细胞，可以无限传代长期繁衍下去，每种细胞系都具有特殊的遗传标志特征，3.接触抑制：当贴壁生成单层细胞且细胞达到一定密度相互接触时，造成细胞表面许多反应受到遮蔽，从而细胞的生长和繁殖受到抑制。
4.电融合技术：将悬浮细胞在低压交流电场中聚集成串珠状细胞群或相互接触的单层培养细胞，加高压电泳冲促使融合的技术。
5.密度梯度离心：离心操作如果在一种连续密度梯度介质中进行，6.差速离心：装有不均一粒子的离心管在离心机中高速旋转时，大小、密度不同的粒子将以各自的沉降速率移向离心管底部7.细胞克隆由单个细胞培养繁殖而成的一群遗传性状完全相同的细胞群体。
二.简答题1.透射电镜、扫描电镜、扫描隧道显微镜的原理2.细胞及细胞器分离提纯方法细胞：采用流式细胞术；细胞器：超速离心术，差速离心术，密度梯度离心术，蔗糖密度梯度离心术，氧化铯密度梯度离心。
3.动物细胞培养方法液体悬浮培养，平板培养，回转玻璃管培养。
4.单克隆抗体技术及优点单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常的淋巴细胞具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞可以在体外长期培养，但不能分泌抗体，将两细胞融合成杂交瘤细胞这样既能合成抗体，又能在体外无限繁殖，优点：永久性产生，特异性强，5.如何利用细胞杂交技术由不纯的抗原制备纯的抗体6.免疫荧光技术及应用7.相差显微镜的原理其基本原理是吧透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构中的对比度，使各种构造变得清晰可见。
第四章细胞质膜与细胞表面1.成斑现象2.成帽现象3.连接子.4.化学突触.5.脱毒二.问答题：1.人的A、B、O血型如何决定.2.膜功能.3.膜骨架的结构与功能.4.举例说明细胞间如何进行通讯连接.5.间隙连接及其作用.第五章物质的跨膜运输与信号传递一.名词解释：1.Na-K泵.2.载体蛋白.3.通道蛋白4.内吞作用.5.静息电位.6.细胞通讯.7.受体.二.问答题：1.质子泵有哪三种？动物细胞还有那种方式输出质子？2.细胞通讯有那些方式？3.试述细胞信号通路上的信号分子、受体、第二信使、分子开关的各种类型。
细胞生物学的研究方法(1)
编辑课件 光学显微镜和电子显微镜下的细胞3结构
2、分辨率(resolution)
R = 0.61λ/n Sinα n=介质的折射率 ；空气为1. 油为1.5 α=样品对物镜角孔径的半角；sinα的最大值为1 λ=照明光源的波长 0.61是一个恒定的参数；表示成像的点虽被重叠但仍能 被区别的程度
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明
DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope）
利用的偏振光 ;标本可略厚，折射率差别更大
基因注入、核移植、转基因等的显微操作
编辑课件
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（八）、倒置显微镜
倒置显微镜特点: 物镜与照明系统颠倒 观察培养的活细胞 具有相差物镜
1）自发荧光
细胞中有些物质（如叶绿素等）紫外线照射后可 发荧光
2）诱发荧光
一些物质紫外线照射后不能发荧光，但如果用荧 光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发
荧光
编辑课件
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荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）
编辑课件
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2、荧光显微镜和普通显微镜的区别
1）照明方式： 通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上
（四）、暗视野显微镜
暗视野显微镜(dark field microscope) 用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大 在黑暗的背景下呈现明亮的像 反差增大，分辨率提高 观察未经染色的活体或胶体粒子
编辑课件
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（五）、相差显微镜
相差显微镜（phasecontrast microscope）
荷兰人Zernike1932年发明，获1953年诺贝尔物理奖 作用：可观察未经染色的标本和活细胞
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一、章（节、目）授课计划第页GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF二、课时教学内容第页GAGGAGAGGAFFFFAFAF技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。
没有显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。
细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。
当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern 杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。
第一节细胞形态结构的观察方法一、有关显微镜的一些概念（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。
光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）．其中λ为入射光线波长；N =介质折射率；空气中N =1GAGGAGAGGAFFFFAFAFα=物镜镜口角（样品对物镜镜口的张角）。
（2）放大倍数（magnification）：是指眼睛看到像的大小与对应标本大小的比值。
它指的是长度的比值而不是面积的比值。
例：放大倍数为100×，指的是长度是1μm的标本，放大后像的长度是100μm，要是以面积计算，则放大了10,000倍。
显微镜的总放大倍数等于物镜和目镜放大倍数的乘积。
（3）有效放大倍数（effective magnification）：物镜的数值孔径（NA）决定了显微镜有效放大倍数。
有效放大倍数，就是人眼能够分辨的d′与物镜的d间的比值，即不使人眼看到假像的最小放大倍数：GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF显微镜。
这两类显微镜又可根据不同的情况分成若干类型。
三、光学显微镜技术光学显微镜技术至今仍是细胞生物学研究的重要手段。
（一）普通复式光学显微镜技术1. 构成：①照明系统：光源、折光镜、聚光镜GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF教学内容小结（二）相差和微分干涉显微镜技术光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。
相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。
从而提高样品反差，提高了各种结构GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF分辨力0.2nm，放大倍数可达106；用于观察超微结构（小于0.2µm）。
（二）主要电镜制备技术1、超薄切片技术用于电镜观察的样本制备。
通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。
由于电子束的穿透能力有限，为获得高分辨率的图像，切片厚度一般仅为40-50nm，即一个直径为20um的细胞可以切成几百片，故称超薄切片。
这需要样品具备一定的刚性和韧性，而生物样品不具备这些特性，因此需要包埋于特殊的介质中，包埋时会破坏样品的结构，因此在包埋前必须先将样品固定。
（1）固定：保持样品的真实性，细胞内部结构和成分保持在原来位置上通常以锇酸和戊二醛固定样品，低温，防止酶的自溶而破坏样品结构。
GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF主要特点：►具有原子尺度的高分辨本领：侧分辨率0.1-0.2nm，纵分辩率0.001nm►真空、大气、液体条件下工作►非破坏性测量局限性：►扫描隧道显微镜(STM)所观察的样品必须具有一定程度的导电性，对于半导体，观测的效果就差于导体；对于绝缘体则根本无法直接观察。
►在扫描隧道显微镜(STM)的恒电流工作模式下，有时它对样品表面微粒之间的某些沟槽不能够准确探测，与此相关的分辨率较差。
第二节细胞组分的分析方法形态学观察和细胞成分的分析相结合是当代细胞生物学研究中长采用的试验方法。
一、细胞组分分离技术►是分离细胞器及各种大分子基本手段。
GAGGAGAGGAFFFFAFAF►转速10~25kr/min的离心机称为高速离心机。
►转速>25kr/min，离心力>89Kg者称为超速离心机。
超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500kg。
（一）差速离心 Differential centrifugation ►特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。
GAGGAGAGGAFFFFAFAF►沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。
►可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。
（二）密度梯度离心►用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。
►类型：速度沉降、等密度沉降。
►常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
►分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。
GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF2.等密度沉降 isopycnic sedimentation►用途：分离密度不等的颗粒。
►特点：介质密度高，陡度大，介质最高密度大于被分离组分的最大密度。
力场比速率沉降法大10~100倍，需要高速或超速离心。
►原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。
GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF2、Feulgen反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。
用于显示糖和脱氧核糖核酸3、四氧化锇:与不饱和脂肪酸反应成黑色，脂肪滴4、Millon（米伦）反应：氮汞试剂与组织中的蛋白质侧链上的络氨酸残基反应，形成红色沉淀，（有色复合物）蛋白质5、联苯胺反应：过氧化酶分解H202。
产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。
6、脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。
7、茚三酮反应：显示蛋白质三、特异蛋白抗原的定位与定性细胞内蛋白质定位法：免疫荧光技术和免疫电镜技术蛋白质体外定性法：免疫印迹、放射免疫沉淀、蛋白质芯片和质谱分析（一）免疫荧光技术根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，并标上标记荧光素，对抗原进行定位测定的技术。
GAGGAGAGGAFFFFAFAF快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。
（二）免疫电镜技术能有效提高样品的分辨率，在超微结构水平上研究特异蛋白抗原的定位。
免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术GAGGAGAGGAFFFFAFAF应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等四、细胞内特异核酸序列的定位和定性分子杂交技术：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。
这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
►原位杂交（in situ hybridization）。
用于检测染色体上的特殊DNA序列。
最初是使用放射性DNA探针，后来又发明了免疫探针法。
五、应用放射自显影技术研究生物大分子在细胞内的合成动态►用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
►原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，GAGGAGAGGAFFFFAFAF经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光，对细胞内生物大分子进行定性、定位和半定量研究的一种细胞化学技术。
►一般用14C和3H标记。
常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。
14C半衰期为5730年，3H为12.5年。
六、定量细胞化学分析技术1、流式细胞仪►用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。
►可定量地测定某一细胞中的DNA，RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞的数量。
特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，以及将GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF（二）、植物细胞培养1.原生质体培养：培养脱壁后的细胞，特点：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③适宜条件下可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
2.单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株。
GAGGAGAGGAFFFFAFAF(三)、非细胞体系来源于细胞，而不具有完整的细胞结构，但包含了进行正常生物学反应所需的物质（如供能系统和酶反应体系等）组成的体系即为非细胞体系（cell-free system）。
用途：研究DNA复制、RNA转录、蛋白质合成、高尔基体的膜泡运输机制以及细胞核装配等。
二、细胞工程（一）细胞融合与细胞杂交技术通过培养和介导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交。
►同核融合细胞：基因型相同的细胞融合形成的杂交细胞。
►异核融合细胞：基因型不同的细胞融合形成的杂交细胞。
►自发融合：同种细胞在培养过程中自发合并的现象。
►诱发融合：异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合。
在自然界中细胞自发融合发生的机率很小，一般需要GAGGAGAGGAFFFFAFAFGAGGAGAGGAFFFFAFAF2、化学法：主要包括盐类融合剂、聚乙二醇（PEG）、二甲亚砜（DMSO）、甘油-醋酸酯、油酸盐、脂质、Ca2+配合物等。
其中聚乙二醇法是较常用的化学融合方法。
其原理是PEG分子具有轻微的负极性，与具有正极性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。
3、物理法：电融合法。
其原理是改变原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变，使异种原生质体粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜形成融合体。