液相教程之液相色谱柱应用基础
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NEW
pH 2 8 2
pH 8 1
pH 12
©2008 Waters Corporation 28
特殊应用的色谱柱简介
¡ 糖及其它碳水化合物的分析 — 离子交换柱(钙基/Ca) o 用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析 o 柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要 求用户另置超纯水系统 — 氨基类型柱 o 分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10,用途较 为广泛，主要用于食品中糖的分析 — 反相类型柱 — 硅胶类型柱 — 体积排除(凝胶/GPC)类型柱
©2008 Waters Corporation 23
将高pH 柱稳定性推向新极限
要使柱效降低一半, 需将色谱柱曝露在 0.02N NaOH (pH 12.3)和 50℃下的小时数
0 XBridge™ C8 XBridge™ C18 XBridge™ Phenyl XBridge™ Shield RP18 XTerra® MS C18 Symmetry® C18 10 20 30 40 50
为何杂化颗粒柱可增加在高pH下的柱寿命？
Surface modified Silica Particles XTerra® Hybrid Particles
普通硅胶柱
基于杂化颗粒的Xterra 柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
• 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速 度明显减缓 • 柱寿命大大延长
3
C18 填料的合成(2)
键合相(配体)：C18
端基封口基团
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
残留硅羟基
硅胶基质
©2008 Waters Corporation
4
对色谱柱填料的了解(一)
¡ 键合相化学 —影响化合物的分离度：α —不同键合相对不同种类的化合物分离不同 —可能导致色谱的分离机理不同 —如：C18、C8、CN
©2008 Waters Corporation 22
XBridge:第二代杂化填料的合成
美国专利号 6,686,035 B2
硅胶基体中插入的桥式乙基
EtO CH2 CH2 OEt O Si Si O Si EtO
O
OEt Si O Et O
O Si OEt O
4
O Et
EtO
Si
Si EtO OEt EtO
Fra Baidu bibliotek
©2008 Waters Corporation
9
对色谱柱填料的了解(二)
¡ 填料的端基封口 —封口残余硅羟基 —减少不可逆吸附或拖尾 —增加碳含量（0.1% - 1%）
©2008 Waters Corporation
10
残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
©2008 Waters Corporation
18
对色谱柱填料的了解(七)
¡ 填料的pH稳定性
— 硅胶填料 pH：2-8 — 聚合物填料 pH：2-12 — 杂化硅胶填料 pH：2-12
硅 胶 的 溶解 曲 线
¡ pH值小于2时键合相水解 ¡ pH值大于8时硅胶溶解
1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH
©2008 Waters Corporation
30
特殊应用的色谱柱简介
¡ 生命科学专用柱(2) — 糖蛋白的寡聚糖分析及纯化 o 离子交换柱(酸性)，Glyco-Pak DEAE o 分配柱(中性)，Glyco-Pak N (7.8×300mm) o Carbohydrate Analysis — 儿茶酚胺分析柱 o Resolve C18 (传统方法)、Symmetry C8 — 氨基酸分析柱 o 离子交换柱 o 反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法
©2008 Waters Corporation
29
特殊应用的色谱柱简介
¡ 生命科学专用柱(1) — 蛋白，多肽的分析和提纯 o Protein-Pak系列凝胶柱 o Protein-Pak系列离子交换柱 • 弱阴离子/ DEAE 弱阳离子/ CM • 强阴离子/ Q o 疏水回受柱 o 亲合色谱柱 o 反相柱 — DNA分析，同蛋白分析相近，但有些专用柱 强阳离子/ SP
挑战性流动相: 0.02N NaOH pH 12.3 , 50°C 测试时的流动相: 50/50 (v/v) 乙腈/水 , 50°C 标准测试物: 苯癸酮
©2008 Waters Corporation 24
将高pH 柱稳定性推向新极限
能否使用高 pH磷酸缓冲系统(pH 12)??
¡ 磷酸拥有三个 pKa: pK1 =2.15, pK2=7.2, pK3 =12.3 ¡ 磷酸缓冲盐系统具有超低的紫外吸收, 对从事非LC/MS分析的科学 家具有很大吸引力 ¡ 持续有科学家寻求在以上三个pH范围均可稳定使用的分离柱 ¡ “如果你能提供具有以上能力的色谱柱, 我肯定会购买它!” — 从许多色谱学者得到的反馈 ¡ X-Bridge 系列柱是目前唯一提供这一可能的色谱柱!
©2008 Waters Corporation
5
键合相色谱柱
¡ 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、 胺基等基团联在基质上，作为固定相 ¡ 优点∶
— 固定相稳定，不易流失 — 应用广泛，可使用多种溶剂 — 消除硅羟基的不良影响
¡ 缺点∶
— pH值不能小于2(键合相水解) — 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
©2008 Waters Corporation
31
色谱柱使用与保养
©2008 Waters Corporation
色谱柱的连接
+
EtO EtO Si EtO
OEt CH2 Si OEt CH2 OEt
OEt
n
Polyethoxysilane (BPEOS)
Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788
Tetraethoxysilane Bis(triethoxysilyl)ethane (TEOS) (BTEE)
— 分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合
¡ 从柱体积及柱结构上分：
— 内径：2.1mm以下(微径柱)、 3.9mm ~ 7.8mm(分析柱)、 7.9mm ~ 50mm（制备柱） — 长度：5cm ~ 60cm
¡ 从柱体材料上分∶
— 不锈钢（普通/可换柱芯） — 玻璃 — 聚合物（径向加压）、PEEK
©2008 Waters Corporation
C%
19 17 15 12 12 11 11 10 7
k'苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
©2008 Waters Corporation
13
对色谱柱填料的了解(四)
¡ 平均颗粒度，颗粒度分布
— 颗粒度 o 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) — 颗粒分布 o 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) — 颗粒形状 o 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 o 无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀 谱带扩展
©2008 Waters Corporation
14
硅胶颗粒的形状
¡ 不规则形状 (Irregular)
— 大硅胶颗粒研磨，筛分 — 颗粒尺寸和表面积限制
¡ 球形（Spherical）
— 目前流行的分析填料 — 更好的性能，重现性
©2008 Waters Corporation
15
对色谱柱填料的了解(五)
不同色谱填料的选择性差异
©2008 Waters Corporation
8
选择性差异来源
¡ 填料的品牌-不同硅胶颗粒基质
o 密度，表面积，孔径 o 纯度(残留硅羟基活性不同)
¡ 键合相的种类:C18,C8, Shield RP18… ¡ 不同 C18配体键合水平
o 单键键合,双键键合,三键键合 o 配体覆盖率(疏水性不同)
©2008 Waters Corporation
25
对色谱柱填料的了解(八)
¡ 填料的热稳定性 —普通硅胶填料 柱温:≤60℃ —聚合物填料(高温GPC) 柱温:≤150℃ —杂化硅胶填料(XTerra) 柱温:≤90℃
©2008 Waters Corporation
26
液相色谱柱的分类
¡ 从柱子类型上分：
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
©2008 Waters Corporation 20
第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
四乙氧基硅烷 (TEOS)
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
©2008 Waters Corporation 21
©2008 Waters Corporation
12
不同色谱柱的含碳量
色谱柱
Symmetry C18 Zorbax ODS LiChrosorb RP-18 Symmetry C8 Resolve C-18 Ultrasphere ODS Partisil ODS-3 µBondpak C-18 Nova-Pak C-18
©2008 Waters Corporation
2
C18 填料的合成(1)
传统硅胶颗粒基质
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
硅羟基
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
©2008 Waters Corporation
¡ 平均孔径/孔体积 ¡ 孔径/孔体积分布 —大的孔径可分析高分子 量的分子
©2008 Waters Corporation
16
硅胶的孔结构
§孔占据大于99%的填料表面
被测物分子 量( MW) < 3,000 3,000 – 10,000 >10,000 非常大 推荐使用的 填料孔径 60 -130 Å (6 -13 nm) 125-200 Å (12.5-20 nm) 300 – 1,000 Å (30 -100 nm) 无孔填料
©2008 Waters Corporation
6
带有内嵌极性配体的色谱填料
§Waters Symmetry Shield RP18…
O Si CH3 CH3
Polar Group
内嵌极性基团配体
(由一步合成过程而来)
O Si CH3 CH3
传统直链烷基配体
©2008 Waters Corporation 7
液相色谱教程
液相色谱柱 应用基础
©2008 Waters Corporation
高效液相色谱柱简介
¡ 色谱柱是一根填满填料的管子 ¡ 柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽 相同 ¡ 管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类
— 硅胶基质 — 聚合物基质
¡ 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
27
Waters反相色谱柱技术平台
超纯硅胶柱
–Symmetry® –SymmetryShield –SunFire™
NEW
极性、亲水性化合物 专用柱
–Atlantis™ dC18 –Atlantis™ HILIC columns
杂化颗粒柱
–XTerra® –ACQUITY UPLC™ –X-Bridge™
©2008 Waters Corporation
19
Waters全新的柱填料颗粒
优点 无机基质 (C18 –硅胶) 有机基质 (高聚物)
• 机械强度高 • 柱效高 • 保留稳定 • 很宽的pH应用范围 • 无离子型作用 • 化学稳定性好
缺点
• 有限的pH应用范围 • 对碱性分析物拖尾 • 化学不稳定性 • 机械强度不佳 • 柱效低 • 保留行为难以预测
注意：孔径是分布值
Si-OH = 硅羟基（Silanol）
©2008 Waters Corporation 17
对色谱柱填料的了解(六)
¡ 硅胶的活性 —主要影响碱性化合物的保留行为：k' —生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 —是选择性差异的主要来源 ¡ 硅胶的杂质含量 —重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 —是色谱柱质量好坏的重要标志
NovaPak C18
未封口 C18
©2008 Waters Corporation 11
对色谱柱填料的了解(三)
¡ 含碳量
– 含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
¡ 高含碳量
– 有利于不易保留的化合物的分离 – 水解稳定性好，重现性好 – 有利于极性化合物的拖尾改善
¡ 低含碳量
– 有利于分析中性及碱性化合物 – 降低溶剂损耗
pH 2 8 2
pH 8 1
pH 12
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特殊应用的色谱柱简介
¡ 糖及其它碳水化合物的分析 — 离子交换柱(钙基/Ca) o 用于单糖、双糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析 o 柱温~90℃，要求有柱温箱。对流动相(水)的要求较高，要 求用户另置超纯水系统 — 氨基类型柱 o 分析单糖、双糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10,用途较 为广泛，主要用于食品中糖的分析 — 反相类型柱 — 硅胶类型柱 — 体积排除(凝胶/GPC)类型柱
©2008 Waters Corporation 23
将高pH 柱稳定性推向新极限
要使柱效降低一半, 需将色谱柱曝露在 0.02N NaOH (pH 12.3)和 50℃下的小时数
0 XBridge™ C8 XBridge™ C18 XBridge™ Phenyl XBridge™ Shield RP18 XTerra® MS C18 Symmetry® C18 10 20 30 40 50
为何杂化颗粒柱可增加在高pH下的柱寿命？
Surface modified Silica Particles XTerra® Hybrid Particles
普通硅胶柱
基于杂化颗粒的Xterra 柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
• 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速 度明显减缓 • 柱寿命大大延长
3
C18 填料的合成(2)
键合相(配体)：C18
端基封口基团
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
残留硅羟基
硅胶基质
©2008 Waters Corporation
4
对色谱柱填料的了解(一)
¡ 键合相化学 —影响化合物的分离度：α —不同键合相对不同种类的化合物分离不同 —可能导致色谱的分离机理不同 —如：C18、C8、CN
©2008 Waters Corporation 22
XBridge:第二代杂化填料的合成
美国专利号 6,686,035 B2
硅胶基体中插入的桥式乙基
EtO CH2 CH2 OEt O Si Si O Si EtO
O
OEt Si O Et O
O Si OEt O
4
O Et
EtO
Si
Si EtO OEt EtO
Fra Baidu bibliotek
©2008 Waters Corporation
9
对色谱柱填料的了解(二)
¡ 填料的端基封口 —封口残余硅羟基 —减少不可逆吸附或拖尾 —增加碳含量（0.1% - 1%）
©2008 Waters Corporation
10
残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
©2008 Waters Corporation
18
对色谱柱填料的了解(七)
¡ 填料的pH稳定性
— 硅胶填料 pH：2-8 — 聚合物填料 pH：2-12 — 杂化硅胶填料 pH：2-12
硅 胶 的 溶解 曲 线
¡ pH值小于2时键合相水解 ¡ pH值大于8时硅胶溶解
1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH
©2008 Waters Corporation
30
特殊应用的色谱柱简介
¡ 生命科学专用柱(2) — 糖蛋白的寡聚糖分析及纯化 o 离子交换柱(酸性)，Glyco-Pak DEAE o 分配柱(中性)，Glyco-Pak N (7.8×300mm) o Carbohydrate Analysis — 儿茶酚胺分析柱 o Resolve C18 (传统方法)、Symmetry C8 — 氨基酸分析柱 o 离子交换柱 o 反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法
©2008 Waters Corporation
29
特殊应用的色谱柱简介
¡ 生命科学专用柱(1) — 蛋白，多肽的分析和提纯 o Protein-Pak系列凝胶柱 o Protein-Pak系列离子交换柱 • 弱阴离子/ DEAE 弱阳离子/ CM • 强阴离子/ Q o 疏水回受柱 o 亲合色谱柱 o 反相柱 — DNA分析，同蛋白分析相近，但有些专用柱 强阳离子/ SP
挑战性流动相: 0.02N NaOH pH 12.3 , 50°C 测试时的流动相: 50/50 (v/v) 乙腈/水 , 50°C 标准测试物: 苯癸酮
©2008 Waters Corporation 24
将高pH 柱稳定性推向新极限
能否使用高 pH磷酸缓冲系统(pH 12)??
¡ 磷酸拥有三个 pKa: pK1 =2.15, pK2=7.2, pK3 =12.3 ¡ 磷酸缓冲盐系统具有超低的紫外吸收, 对从事非LC/MS分析的科学 家具有很大吸引力 ¡ 持续有科学家寻求在以上三个pH范围均可稳定使用的分离柱 ¡ “如果你能提供具有以上能力的色谱柱, 我肯定会购买它!” — 从许多色谱学者得到的反馈 ¡ X-Bridge 系列柱是目前唯一提供这一可能的色谱柱!
©2008 Waters Corporation
5
键合相色谱柱
¡ 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、 胺基等基团联在基质上，作为固定相 ¡ 优点∶
— 固定相稳定，不易流失 — 应用广泛，可使用多种溶剂 — 消除硅羟基的不良影响
¡ 缺点∶
— pH值不能小于2(键合相水解) — 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同
©2008 Waters Corporation
31
色谱柱使用与保养
©2008 Waters Corporation
色谱柱的连接
+
EtO EtO Si EtO
OEt CH2 Si OEt CH2 OEt
OEt
n
Polyethoxysilane (BPEOS)
Anal. Chem. 2003, 75, 6781-6788
Tetraethoxysilane Bis(triethoxysilyl)ethane (TEOS) (BTEE)
— 分配/吸附，离子交换，凝胶，亲合
¡ 从柱体积及柱结构上分：
— 内径：2.1mm以下(微径柱)、 3.9mm ~ 7.8mm(分析柱)、 7.9mm ~ 50mm（制备柱） — 长度：5cm ~ 60cm
¡ 从柱体材料上分∶
— 不锈钢（普通/可换柱芯） — 玻璃 — 聚合物（径向加压）、PEEK
©2008 Waters Corporation
C%
19 17 15 12 12 11 11 10 7
k'苊 (50/50的乙腈/水)
17 15.7 10.3 12.5 12.4 11.3 12.0 7.9 5.5
©2008 Waters Corporation
13
对色谱柱填料的了解(四)
¡ 平均颗粒度，颗粒度分布
— 颗粒度 o 颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差) — 颗粒分布 o 颗粒分布越宽:柱效低(渗透性差) — 颗粒形状 o 球型:柱效高、重现性好、柱床结构均匀 o 无定型：柱床结构不均匀,流动相线性速度不均匀 谱带扩展
©2008 Waters Corporation
14
硅胶颗粒的形状
¡ 不规则形状 (Irregular)
— 大硅胶颗粒研磨，筛分 — 颗粒尺寸和表面积限制
¡ 球形（Spherical）
— 目前流行的分析填料 — 更好的性能，重现性
©2008 Waters Corporation
15
对色谱柱填料的了解(五)
不同色谱填料的选择性差异
©2008 Waters Corporation
8
选择性差异来源
¡ 填料的品牌-不同硅胶颗粒基质
o 密度，表面积，孔径 o 纯度(残留硅羟基活性不同)
¡ 键合相的种类:C18,C8, Shield RP18… ¡ 不同 C18配体键合水平
o 单键键合,双键键合,三键键合 o 配体覆盖率(疏水性不同)
©2008 Waters Corporation
25
对色谱柱填料的了解(八)
¡ 填料的热稳定性 —普通硅胶填料 柱温:≤60℃ —聚合物填料(高温GPC) 柱温:≤150℃ —杂化硅胶填料(XTerra) 柱温:≤90℃
©2008 Waters Corporation
26
液相色谱柱的分类
¡ 从柱子类型上分：
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
©2008 Waters Corporation 20
第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
四乙氧基硅烷 (TEOS)
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
©2008 Waters Corporation 21
©2008 Waters Corporation
12
不同色谱柱的含碳量
色谱柱
Symmetry C18 Zorbax ODS LiChrosorb RP-18 Symmetry C8 Resolve C-18 Ultrasphere ODS Partisil ODS-3 µBondpak C-18 Nova-Pak C-18
©2008 Waters Corporation
2
C18 填料的合成(1)
传统硅胶颗粒基质
合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
硅羟基
Polyethoxysilane (PEOS)
Tetraethoxysilane (TEOS)
©2008 Waters Corporation
¡ 平均孔径/孔体积 ¡ 孔径/孔体积分布 —大的孔径可分析高分子 量的分子
©2008 Waters Corporation
16
硅胶的孔结构
§孔占据大于99%的填料表面
被测物分子 量( MW) < 3,000 3,000 – 10,000 >10,000 非常大 推荐使用的 填料孔径 60 -130 Å (6 -13 nm) 125-200 Å (12.5-20 nm) 300 – 1,000 Å (30 -100 nm) 无孔填料
©2008 Waters Corporation
6
带有内嵌极性配体的色谱填料
§Waters Symmetry Shield RP18…
O Si CH3 CH3
Polar Group
内嵌极性基团配体
(由一步合成过程而来)
O Si CH3 CH3
传统直链烷基配体
©2008 Waters Corporation 7
液相色谱教程
液相色谱柱 应用基础
©2008 Waters Corporation
高效液相色谱柱简介
¡ 色谱柱是一根填满填料的管子 ¡ 柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽 相同 ¡ 管内的填料更是种类繁多,主要分为两大类
— 硅胶基质 — 聚合物基质
¡ 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
27
Waters反相色谱柱技术平台
超纯硅胶柱
–Symmetry® –SymmetryShield –SunFire™
NEW
极性、亲水性化合物 专用柱
–Atlantis™ dC18 –Atlantis™ HILIC columns
杂化颗粒柱
–XTerra® –ACQUITY UPLC™ –X-Bridge™
©2008 Waters Corporation
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Waters全新的柱填料颗粒
优点 无机基质 (C18 –硅胶) 有机基质 (高聚物)
• 机械强度高 • 柱效高 • 保留稳定 • 很宽的pH应用范围 • 无离子型作用 • 化学稳定性好
缺点
• 有限的pH应用范围 • 对碱性分析物拖尾 • 化学不稳定性 • 机械强度不佳 • 柱效低 • 保留行为难以预测
注意：孔径是分布值
Si-OH = 硅羟基（Silanol）
©2008 Waters Corporation 17
对色谱柱填料的了解(六)
¡ 硅胶的活性 —主要影响碱性化合物的保留行为：k' —生产硅胶时处理温度不同，硅胶活性也不同 —是选择性差异的主要来源 ¡ 硅胶的杂质含量 —重金属含量低，硅羟基活性小，拖尾减小 —是色谱柱质量好坏的重要标志
NovaPak C18
未封口 C18
©2008 Waters Corporation 11
对色谱柱填料的了解(三)
¡ 含碳量
– 含碳量越高，k'值越大（固定相传质效应增加）
¡ 高含碳量
– 有利于不易保留的化合物的分离 – 水解稳定性好，重现性好 – 有利于极性化合物的拖尾改善
¡ 低含碳量
– 有利于分析中性及碱性化合物 – 降低溶剂损耗