ICC-免疫细胞化学染色
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组化染色质量控制标准 作业指导书
免疫组化染色质量控制标准作业指导书免疫细胞学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科，它是在免疫学理论基础上利用抗原与抗体的特异性反应，在细胞或组织中定位抗原或抗体。
免疫组化技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目的。
随着免疫组织化学技术在临床病理研究与诊断中的广泛应用，因其反应步骤多，影响因素复杂，质量控制已被越来越多的病理技术专家重视。
20xx年全国病理学技术进展和应用研讨会上提出将质控应用到免疫组化技术上。
本文对免疫组化技术的标准化质控进行了探索，现介绍如下。
1、标本的固定为了更好地保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，必须对标本进行固定。
标本固定的好坏是影响病理诊断的关键，同样也影响免疫组化的结果，所以固定是质控的首要也是关键步骤。
影响标本固定主要因素有以下几点。
①标本离体后固定不及时：一般离体标本要求15min内必须固定，最好是在手术室由专业的护士将离体的标本用清水冲洗干净后立即放入质量浓度40g/L中性甲醛内，固定液的用量为标本体积的5～10倍。
而目前本院手术室做不到这一点，这就要求病理技术员在接到标本后要及时固定，不能延误时间。
但是在手术室和路上延误的时间不能控制。
因此，呼吁临床医生应和病理科联合起来，将标本固定地点放在手术室，以使标本及时固定，减少因固定不及时而出现的诊断困难。
②标本固定的时间：40g/L中性甲醛渗透速度一般是2mm/h，随着时间延长速度会逐渐减慢，增加浓度反而会降低渗透速度。
一般手术标本用40g/L 中性甲醛固定的时间以12～24h为佳，最长不要超过72h；如穿刺标本可用AFF液固定2～4h。
有研究显示，用40g/L中性甲醛固定1周后的标本，其组织抗原几乎不能被检出[1]。
但是，日常工作中常常会遇到有人催发病理报告的情况，他们希望病理科的报告最好像检验科那样早晨送下午就能拿到。
这种情况下只有缩短制片程序，包括固定时间，这种操作只会增加病理诊断的风险，埋下误诊的隐患。
免疫组织化学染色技术
03 免疫组织化学染色技术的 操作流程
样本的收集与处理
01Βιβλιοθήκη 0203样本类型
免疫组织化学染色技术可 应用于各种组织样本，如 石蜡切片、冰冻切片、细 胞涂片和组织块等。
样本处理
在染色前，需要对样本进 行适当的固定、脱水、包 埋和切片等处理，以确保 抗原的完整性和活性。
样本标记
在切片过程中，需对组织 进行标记，以便后续的定 位和观察。
04 免疫组织化学染色技术的 优化与改进
抗体选择与优化
总结词
抗体选择是免疫组织化学染色技术的关键步骤，直接影响到染色结果的特异性和敏感性。
详细描述
在选择抗体时，应考虑抗体的来源和生产过程，以确保其质量和可靠性。同时，应选择针对目标抗原具有高亲和 力的抗体，以提高染色结果的特异性。此外，可通过实验验证抗体的最佳工作浓度，以实现最佳的染色效果。
染色结果的检测与评估
染色结果的检测与评估是免疫组织化学染色技术的最后步 骤，也是最为关键的一步。检测方法包括显微镜观察、图 像分析等。评估染色结果时，需要综合考虑染色强度、阳 性细胞的数量和分布等因素，以得出准确的结论。
染色结果的检测与评估对于病理诊断、肿瘤研究等领域具 有重要意义。通过免疫组织化学染色技术，可以检测组织 中特定蛋白质的表达情况，从而为疾病的诊断和治疗提供 有力支持。
抗原修复与阻断
抗原修复
通过加热或化学方法使抗原从组织中 暴露出来，以便抗体能够与其结合。
阻断
为了防止非特异性染色，需要用阻断 剂对组织进行阻断，以消除内源性过 氧化物酶和生物素等物质的干扰。
抗体孵育与洗涤
抗体选择
根据研究目的选择特异性抗体，确保其能够与目 标抗原特异性结合。
抗体孵育
免疫细胞成像ICCIF实验流程指南-ThermoFisherScientific
免疫细胞成像 ICC/IF 实验流程指南帮您获取最优质的出版级细胞图像目录概述 (1)实验流程概览 (2)细胞准备 (4)固定/透化/封闭 (5)免疫标记 (8)多色检测 & 复染 (12)信号优化 (20)相关资源 (22)2概述免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)是一种常用的实验技术，它通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
研究样本通常是培养的细胞系、原代细胞，或者从病人和动物身上获得的悬浮细胞，包括细胞爬片、血液涂片、拭子和抽取物等。
传统的ICC技术使用显色法检测，酶结合抗体将显色底物在反应位点转化为有色沉淀。
然而，随着免疫荧光标记(Immuno uorescence, IF)的出现，越来越受到广泛的应用，在很多情况下，常常把ICC/IF(免疫细胞化学/免疫荧光)放在一起使用。
在我们的官网和本手册中，ICC通常也用于描述IF。
在ICC/IF分析中，细胞抗原可以用荧光直接标记的一抗(直接法检测)或二抗及酶偶联物等(间接法检测)来显示。
通过结合不同荧光标记抗体，多重ICC/IF还可以同时检测同一样品中的多种抗原。
Invitrogen™ Molecular Probes™ 荧光试剂作为备受全球科学家认可的品牌，专注荧光标记及检测领域40多年，可提供经过长期验证过的各种荧光染料及相关试剂，帮您获得可靠的高品质出版级实验结果图像。
/probes1实验流程概览12 23454产品名称规格货号简介CultureWell ™ Multiwell Chambered Coverslip 1 set C24776成像用玻片、盖玻片、多孔垫片，及相关辅助小工具，每种都有更多品类CoverWell ™ Incubation Chamber Gasket 25 gaskets C18150Press-to-Seal ™ Silicone Isolator with Adhesive 1 set P24740Secure-Seal ™ Spacer 8 wells 1 set S24737Coverglass Removal Tool1 each C37010Coverslip Mini-Rack for 8 coverslips 玻片架1 eachC14784细胞准备健康的细胞是后续实验的基础，至关重要。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC）定义：免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
免疫组化原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
免疫组化检测标本1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片；2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。
免疫组化操作步骤①石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。
2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1 h，80%酒精1 h，95%酒精1 h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各1 h3、透明：1:1无水乙醇二甲苯溶液30 min，二甲苯溶液中10 min（组织块透明即可）。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色(Immunohistochemical Staining,IHC)是一种常见的组织学检测方法，用于确定细胞或组织中特定蛋白质的表达或位置。
这种技术实际上是将抗原源合成出抗体，利用免疫相互作用(两抗体一抗原)在细胞内或细胞外测定有无抗原物质。
这种技术有许多种变式，其中一种叫做实时双标定量免疫组织化学染色(RQ-IHC)，可以用来检测癌细胞内外的抗原表达。
染色十分具体：首先，切取患者的取样以供检测，然后将组织片放在真空显微镜的底部，将抗体滴在表面上并使其完全覆盖，然后将片子放置在一定温度的溶液中培养，以促成抗体和抗原之间的结合。
最后，借助细胞标记小分子，将抗原特异性滴在含抗体片上，以实现染色。
此外，还可以使用磁珠，是特殊磁性微球，将抗体带入抗原，从而改善抗体和抗原的结合，从而提高染色的特异性。
IHC 染色为临床检测提供了重要佐证，在临床组织活检及肿瘤监测中有着重要的作用。
它可以帮助医生的诊断和行医判断，帮助选择治疗方法，更好地控制肿瘤的发展，最大限度地减小病人的痛苦。
IHC 染色在其他方面也有重要应用，尤其是在器官移植和临床药物开发中，它能够有效提高细胞和组织质量，并帮助研究者准确地检测细胞和组织中蛋白质的表达。
通过IHC 染色，可以帮助我们准确了解细胞组织的结构和异常状态，从而改善对各种疾病的辅助检测、诊断和治疗。
这一技术为临床医生提供了坚实的诊断成果，给患者带来了良好的治疗效果。
免疫组化技术简介
06
04
02
07
失 败
05
技 术
03
基 本
01
原
要
原
质
因
结
点
操
理
基
量
果
作
本
控
判
流
概
制
读
程
念
CONTENTS
目 录
质量控制
试剂的质量控制
➢ 抗体特异性、敏感性测试 ，抗体最佳稀释度的选择 ，稀释剂 ，抗体孵育温度、
时间。
仪器的质量控制
➢ 相关技术设备、仪器和器具定期校对、消毒。
操作过程质量控制
形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
➢ 注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的30
倍为宜；③必须选择对组织渗透力强，同时又不致使组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
➢ 固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学
基本概念
抗原（Antigen, Ag）
➢ 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细
胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物 质。
抗体（Antibody, Ab）
➢ 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与
相应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
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免疫组化全攻略
免疫组化全攻略：新手必读从技术上讲，IHC的原理很简单。
首先固定样品，以保留细胞完整性，之后与封闭液共同孵育，避免抗体的非特异结合。
随后将样品先后与一抗和二抗孵育，并通过显微镜分析观察信号。
然而，这并不意味着实验很好做。
如何设计一个成功的IHC/ICC实验，请看免疫组化全攻略。
在上世纪30年代，免疫组织化学（Immunohistochemistry，简称IHC）的原理就已经为人所知，但直到1942年，第一个IHC研究成果才正式发表。
这也被誉为免疫荧光技术的里程碑。
哈佛大学医学院的Albert Coons在《免疫学杂志》上发表文章，利用FITC标记的抗体来鉴定感染组织中的肺炎球菌抗原。
自那以后，组织固定方法、检测标记和显微镜都在不断改进，让免疫组化成为诊断和研究中的一个必备工具。
在病理科，利用特异的肿瘤标志物，医生通过IHC诊断肿瘤是良性还是恶性，确定肿瘤的分期和分级，并确定细胞类型和转移的来源，以便找到原发肿瘤的位置。
同样，IHC也能用于药物开发，通过检测疾病靶点的上调或下调来判断药物疗效。
免疫组化指的是根据抗体与抗原特异结合的原理来检测组织切片中的抗原（如蛋白）。
immuno的词根来自操作中所使用的抗体，而histo意味着组织。
另一种类似的技术是免疫细胞化学（Immunocytochemistry，简称ICC）。
这两个词大家经常混着用，看着好像差不多，但实际上还是有点区别。
这里顺便说说。
IHCvs. ICC对于IHC，组织是来自患者或动物，经过冷冻或石蜡包埋。
将这些组织制成约4μm厚的切片，封片后再处理。
通过这种方法，研究人员可观察细胞组分的定位，同时维持周围组织的原先结构。
对于ICC，大部分细胞外基质及其他基质组分被去除，只剩下整个细胞来染色。
ICC的来源可以是细胞悬液，来自患者或动物（如血涂片、拭子等），或在实验室中进行的组织培养细胞系。
除了生物学来源，IHC和ICC在样品处理的程度上也有所不同。
免疫组化(IHC)标准化
免疫组化（IHC）标准化云南省第三人民医院病理科徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。
虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。
免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。
所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。
20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。
当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。
1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。
（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。
对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。
需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。
病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。
由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。
常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。
由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。
应避免使用含重金属的固定剂。
10%中性缓冲福尔马林配制方法：40%甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠 6.5g蒸馏水900ml固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。
免疫细胞成像ICCIF试验流程指引
免疫细胞成像 ICC/IF 实验流程指南帮您获取最优质的出版级细胞图像目录概述 (1)实验流程概览 (2)细胞准备 (4)固定/透化/封闭 (5)免疫标记 (8)多色检测 & 复染 (12)信号优化 (20)相关资源 (22)2概述免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC)是一种常用的实验技术，它通过使用抗原抗体特异性结合反应，提供了一种半定量的方法来分析靶抗原的相对丰度、构象和亚细胞定位。
研究样本通常是培养的细胞系、原代细胞，或者从病人和动物身上获得的悬浮细胞，包括细胞爬片、血液涂片、拭子和抽取物等。
传统的ICC技术使用显色法检测，酶结合抗体将显色底物在反应位点转化为有色沉淀。
然而，随着免疫荧光标记(Immuno uorescence, IF)的出现，越来越受到广泛的应用，在很多情况下，常常把ICC/IF(免疫细胞化学/免疫荧光)放在一起使用。
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在ICC/IF分析中，细胞抗原可以用荧光直接标记的一抗(直接法检测)或二抗及酶偶联物等(间接法检测)来显示。
通过结合不同荧光标记抗体，多重ICC/IF还可以同时检测同一样品中的多种抗原。
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/probes1实验流程概览12 23454产品名称规格货号简介CultureWell ™ Multiwell Chambered Coverslip 1 set C24776成像用玻片、盖玻片、多孔垫片，及相关辅助小工具，每种都有更多品类CoverWell ™ Incubation Chamber Gasket 25 gaskets C18150Press-to-Seal ™ Silicone Isolator with Adhesive 1 set P24740Secure-Seal ™ Spacer 8 wells 1 set S24737Coverglass Removal Tool1 each C37010Coverslip Mini-Rack for 8 coverslips 玻片架1 eachC14784细胞准备健康的细胞是后续实验的基础，至关重要。
ICC-免疫细胞化学染色
ICC-免疫细胞化学染色
原代培养海马细胞神经元的鉴定
将大鼠海马神经元细胞终浓度（2*106个/ml）接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中，每孔2.5ml，培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定。
步骤如下：
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍，冷丙酮固定10min。
2.PBS冲洗3遍，3%H2O2（30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合）封闭内源性过氧化物酶，室温下10min。
3.PBS冲洗3遍，0.3%Triton破膜（溶解细胞膜，细胞核膜细胞器膜上的脂质）15min，PBS洗3遍。
4.10%羊血清封闭，室温10min，吸弃上清（不洗）。
一抗37℃反应1h（20μL的NSE+1ml稀释液），设空白对照，以PBS代替一抗
5.PBS洗3*5min，二抗（羊抗兔）室温下18min，PBS洗3*5min，SABC复合物37℃，18min。
（二抗标记的FITC在紫外光激发下显色）
6.PBS洗3*5min，DBA显色（5min）。
镜下观察，自来水终止。
DBA稀释度（1:50），苏木素复染（3min），95%乙醇脱水，二甲苯透明20min，中性树胶封固，风干，镜下观察。
注：PBS用0.01M的（配置成0.1M的，用时稀释）。
免疫组化(IHC)标准化
免疫组化（IHC）标准化云南省第三人民医院病理科徐开军免疫组化（IHC）是病理诊断的主要辅助手段之一。
虽然免疫组化在各个实验室已经常规开展，但是由于各个实验室选择的抗体试剂厂家、抗原修复方法、检测系统等不同，免疫组化实验技术操作方法亦不相同，染色结果会出现各种差异。
免疫组化染色技术操作步骤看似简单，但步骤较多且环环相扣，而且许多因素影响着免疫组化的结果，包括技术人员是否熟练掌握整个实验的操作程序、抗体的特异性、检测方法的敏感性、组织标本的固定、抗原的修复及修复液的PH值等众多因素。
所以，完成一张满意的免疫组化切片并非那么简单。
20世纪末，非生物素型聚合物（Polymer）检测系统的出现，可以有效地防止内源性生物素的干扰，而且灵敏度高，操作便捷，已被免疫组化实验室广泛应用。
当前，免疫组化技术标准化的讨论是建立在由福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片并使用非生物素型聚合物检测方法的基础上而展开的。
1、免疫组化染色前的处理：组织的固定、取材、脱水、包埋、切片与展片、烤片、脱蜡。
（1）组织的固定：固定的目的是防止组织、细胞自溶与腐败，凝固或沉淀组织、细胞内物质，以保持组织和细胞固有形态和结构。
对免疫组化而言更重要是保存组织、细胞内的抗原，防止抗原破坏和弥散。
需高度重视的是手术或穿刺离体组织必须马上放于标本袋固定，固定后应与病理申请单及时送交病理科。
病理医生有责任与手术送检科室进行必要的配合与沟通，避免手术后的病理标本随意丢放。
由于免疫组化的固定剂种类较多，性能各异，不同抗原其稳定性各不相同，因此，要了解不同固定剂的特征。
常采用甲醛、戊二醛、Bouin、B5等固定液。
由于中性缓冲福尔马林渗透力强、组织收缩小，能使大多数抗原物质保存较好，提高免疫组织化学检测的阳性率，因此推荐作为病理标本的首选固定液。
应避免使用含重金属的固定剂。
10%中性缓冲福尔马林配制方法：40%甲醛100ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠 6.5g蒸馏水900ml固定液的量一般为组织块总体积的5-10倍，小标本固定时间为4-6小时，大标本为18-24小时。
ICC
IF/ICC Q & A 免疫细胞(组织)化学实验中如何选择固定剂？ 固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙 酮等。
它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类 物质，因此产生通透效应。
另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲 醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从 而维持在原位上。
这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶 剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的 抗原性。
同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿 越膜结构与胞内抗原结合。
醇类固定的优势在于蛋白变性完全， 对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。
醇类固定的细胞不需 要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考 虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚 甲醛固定。
其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方 法，然后选择较好的一种。
免疫荧光，免疫细胞化学和免疫组织化学实验如何设置对照？ 设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除 非特异性疑问，同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问 题。
（1）阴性对照 阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检 标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。
较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原 的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。
但这 样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针 对一抗的 PBS 对照或来自同一种属动物的血清对照。
（2）阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染 色，这种阳性对照可验证 Protocol，排除实验过程中出现的差 错。
另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。
同 时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如 Flag, Myc, His tag 等。
什么是免疫荧光双标记，怎么进行荧光双标实验？ 免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种 不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。
免疫组织化学染色技术
IHC技术中，绝大多数以间接法为常用。
（2）显色的基本程序 1抗孵育切片或细胞涂片 2抗（酶标抗体）
孵育切片 发色剂显色 （核复染）
（3）酶标抗体法的显色原理及显色剂
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）
HRP + H2O2
HRP ·H2O2
HRP ·H2O2 + DH2
（3）浸蜡
组织块经透明后在熔化的石蜡内浸渍的过程 称浸蜡。 为使石蜡充分渗入组织只，常需经过2-3次石蜡 浸渍。 用于免疫组织化学染色的组织块浸蜡应使用低温 蜡，在60 ºC以下浸透。
（4）包埋
浸蜡后的组织块放入包埋盒中，将熔化的石蜡 到入包埋盒，冷却后取出，修块。
4. 石蜡切片的制作
（1）载玻片涂片的制作
• 免疫组织化学染色的反应原理及显色原理
1. 免疫组织化学染色的反应原理 染色反应的最基本原理是抗原抗体的反应。
通过对针对标本中相应抗原的抗体上标记某 种发色剂或酶类，再通过激发发色剂或使用某种 显色剂，在显微镜下使标本中抗原抗体反应的部 位产生肉眼可观察到的颜色以确定所要检测的抗 原是否存在。
¶ 固定时间：一般根据组织块大小及性质，固定2-24小时。
¶ 固定原理：甲醛通过使蛋白分子发生交联而产生固定作用。
甲醛与蛋白质中的许多氨基酸反应，并能保存脂类和类脂体。
¶ 不利作用：甲醛使组织中蛋白分子发生交联，使所检测的
抗原决定簇被封闭，影响抗原抗体的结合。
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原代培养海马细胞神经元的鉴定
将大鼠海马神经元细胞终浓度（2*106个/ml）接种于铺有盖玻片并经多聚赖氨酸包被好的6孔板中，每孔2.5ml，培养条件同上，培养至第8天，用免疫组化法鉴定。
步骤如下：
1.吸弃培养液用PBS冲洗3遍，冷丙酮固定10min。
2.PBS冲洗3遍，3%H2O2（30%双氧水和纯甲醇按1:9的容积比混合）封闭内源性过氧化物酶，室温下10min。
3.PBS冲洗3遍，0.3%Triton破膜（溶解细胞膜，细胞核膜细胞器膜上的脂质）15min，PBS洗3遍。
4.10%羊血清封闭，室温10min，吸弃上清（不洗）。
一抗37℃反应1h（20μL的NSE+1ml稀释液），设空白对照，以PBS代替一抗
5.PBS洗3*5min，二抗（羊抗兔）室温下18min，PBS洗3*5min，SABC复合物37℃，18min。
（二抗标记的FITC在紫外光激发下显色）
6.PBS洗3*5min，DBA显色（5min）。
镜下观察，自来水终止。
DBA稀释度（1:50），苏木素复染（3min），95%乙醇脱水，二甲苯透明20min，中性树胶封固，风干，镜下观察。
注：PBS用0.01M的（配置成0.1M的，用时稀释）。