基因敲除新技术PPT课件
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cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
6
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
7
二、基因敲除的基本流程
8
（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
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（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
3
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).
条件性基因敲除与敲入ppt课件
2
实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
11
3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
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3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
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在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
分子生物学课件：基因敲除
P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
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3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除2
PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT
博士专题：基因功能研究技术之基因敲 除及基因编辑技术讲课讲稿
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ；权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT
靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因敲除方法专题-郭..55页PPT
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因？
Ø为什么要研究基因？
Ø如何研究？
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆： 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
我室构建：
ALA过表达小鼠，体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠，证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3（Socs3)de 3’UTR.
（博士论文，研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系）
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了： 1、部分待剔除的基因片段，（用于与野生型的该基因 进行交换重组） 2、阳性筛选标志基因（Neor ，neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418（能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因，来自单纯庖疹病毒（HSV），当它 在受体细胞内合成出tk时，可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦，即gangcyclovir（一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡，为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联 会），打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性
基因敲除ppt课件
LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体，获得相应的转基因 小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点 间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
（1）在胚胎干细胞（ES ）中通过置换型载体进 行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因， 并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突 变，同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因，含有HSV - tk (胸苷 激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而 杀死细胞。
外源 基因
整合到染色体 的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等，因而可以 应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA， 导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用，也可以看作是 基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
（2）显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”，此 转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。 （3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。
此外，还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’
CrisperCas技术介绍 ppt课件
•可针对多个基因靶向，对多基因疾病的研究有着重要作用。
Crispr Cas9隐患
•生态系统或被改变
除了农业，研究人员正在考虑CRISPR如何能被或者说应当被用于野外的 生物体。大部分注意力集中在一种被称为基因驱动的方法上，因为它能 迅速将被编辑基因在整个种群中传播。很多研究人员非常担心，改变整 个种群或将其全部清除会对生态系统产生无法预知的灾难性后果：这可 能意味着其他害虫会出现，或者影响食物链上处于较高位置的捕食者。 他们还担心，引导性RNA会随着时间的推移发生突变。随后，这种突变将 席卷整个种群，产生始料未及的影响。
• crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白 在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工 设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切 割。
•基因编辑成为较小型特殊作物和动物的一个可行选择。过去 几年间，研究人员利用该方法对小型猪进行了基因改造，并 且获得了抗病小麦和水稻。他们还在通过基因改造获得没有 角的牛、抵抗疾病的山羊和富含维生素的甜橙等方面取得进 步。
•在干细胞或者受精卵中定向切除致病基因，用预期的DNA模 板片段进行增添和修复。
目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，在II型系统中 pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC 和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥 作用。
Crispr Cas9隐患
•生态系统或被改变
除了农业，研究人员正在考虑CRISPR如何能被或者说应当被用于野外的 生物体。大部分注意力集中在一种被称为基因驱动的方法上，因为它能 迅速将被编辑基因在整个种群中传播。很多研究人员非常担心，改变整 个种群或将其全部清除会对生态系统产生无法预知的灾难性后果：这可 能意味着其他害虫会出现，或者影响食物链上处于较高位置的捕食者。 他们还担心，引导性RNA会随着时间的推移发生突变。随后，这种突变将 席卷整个种群，产生始料未及的影响。
• crRNA（ CRISPR-derived RNA ）通过碱基配对与 tracrRNA （trans-activating RNA ）结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白 在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工 设计这两种 RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA （singleguide RNA ），足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切 割。
•基因编辑成为较小型特殊作物和动物的一个可行选择。过去 几年间，研究人员利用该方法对小型猪进行了基因改造，并 且获得了抗病小麦和水稻。他们还在通过基因改造获得没有 角的牛、抵抗疾病的山羊和富含维生素的甜橙等方面取得进 步。
•在干细胞或者受精卵中定向切除致病基因，用预期的DNA模 板片段进行增添和修复。
目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，在II型系统中 pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC 和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥 作用。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
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（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
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FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
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ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基；
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列；
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
经典方法 ：
自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
饱含希望与失望的技术：
ZFN，被Sigma公司垄断
新的里程碑：
TALEN
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TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
TAL 靶点识别模块
X2
FokI
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TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
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TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对 应识别一个目标碱基
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
12
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
8
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
…… 14 – 18个重复 真核表达
34氨基酸单元
…… 14 – 18个重复
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
9
TALEN 发展过程
10
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
• 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
2
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因 敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达 到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除 3
4
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
5
靶向基因技术
4. TALEN真核表达质粒转入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白
5. 检测突变效率，筛选（ 移码）突变体
X2 X2
Mut
14
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82.
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
• 一篇综述
《Move over ZFN》
13
TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
在线靶点选择设计软件：https:///node/add/talef-off/
15
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元 为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD）
• RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确
• 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
16
具专利保护的克隆构建系统
17
ห้องสมุดไป่ตู้专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
18
具专利保护的克隆构建系统
步骤二：TALEN表达质粒构建
19
真核表达TALEN质粒对
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基；
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列；
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
经典方法 ：
自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
饱含希望与失望的技术：
ZFN，被Sigma公司垄断
新的里程碑：
TALEN
6
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别靶点核 酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。
切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
TAL 靶点识别模块
X2
FokI
11
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
7
TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Di-residue, RVD) 对 应识别一个目标碱基
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
12
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
8
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
…… 14 – 18个重复 真核表达
34氨基酸单元
…… 14 – 18个重复
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
9
TALEN 发展过程
10
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
• 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
2
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因 敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达 到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除 3
4
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
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靶向基因技术
4. TALEN真核表达质粒转入 （卵）细胞，表达TALEN 重组蛋白
5. 检测突变效率，筛选（ 移码）突变体
X2 X2
Mut
14
选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征： 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献：Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82.
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
• 一篇综述
《Move over ZFN》
13
TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
在线靶点选择设计软件：https:///node/add/talef-off/
15
TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元 为34aa模块中的双连 氨基酸（RVD）
• RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系， 即NI识别A，NG识别T， HD识别C，NN识别G， 非常简单明确
• 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列（靶 点），只须按照靶点 序列将相应TAL单元 （14 -18个）串联克 隆即可。
16
具专利保护的克隆构建系统
17
ห้องสมุดไป่ตู้专利保护的克隆构建系统
步骤一：靶点识别单元串联
18
具专利保护的克隆构建系统
步骤二：TALEN表达质粒构建
19
真核表达TALEN质粒对
将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。