基因敲除新技术PPT课件

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cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件

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MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合,产生一种嵌合重组酶,该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下,从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性,因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
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基因敲除机理 (续)
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
7
二、基因敲除的基本流程
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(1)打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
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(2)转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
3
一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶(37℃)
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).

条件性基因敲除与敲入ppt课件

条件性基因敲除与敲入ppt课件
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实现基因敲除的方法有多种,但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法,让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因,从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells,ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系, 在体外培养时保持了未分化状态,可以传代增殖, 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞,具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点,是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作,之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用; ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下,从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官,以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生,进而 发挥作用,这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
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3.Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除,需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中,为了明确某一组织或器官的功能, 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除,进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天,人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平,而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说,就是在分子水平破坏想要研 究的基因,然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等,进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外,为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系,常向生物体内人为引入某个基因,然后 观察实验动物出现的各种变化,从而推测疾病与基 因的关系,这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。

分子生物学课件:基因敲除

分子生物学课件:基因敲除
P53 gene P53基因没有被替换
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中,可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活,但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识:
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活, 但基因组中引入了一个外源标记的基因(NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进?
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因,一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢?
➢ 如果Tk 基因进入细胞,在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的?
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入,非同源重组
如果基因组序列是:
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是:
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程:
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123

基因敲除2

基因敲除2


PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变,然后合成两个引物,它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时, 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增,结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加,得到已知长度DNA双链 片段。与之相反,在随机整合中,由于只有一个引物且为 单方向,所以扩增的片段拷贝数呈线性比例,片段为单链, 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ,目的基因片段也不包含该基因的启动序列,再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内,将打靶载体转染 进靶细胞,可能出现下面几种情况: 打靶载体不整合入靶细胞基因组,将随传代而丢失; 随机整合,由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码,整 合位点周围亦无启动子,使neor基因的表达受阻; 虽是随机整合,但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达; 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组,则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选,则抗性细胞中将只包含③④,根据基因组DNA 酶切图谱的不一致,用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法,但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记,运用PCR 法进行筛选 时,必须对每个细胞克隆分别进行扩增,因此较为费时费 力,工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法,但PNS法要经 过2种药物筛选,有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。

博士专题:基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT

博士专题:基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术讲课讲稿101页PPT
博士专题:基因功能研究技术之基因敲 除及基因编辑技术讲课讲稿
1、合法而稳定的权力在使用得当时很 少遇到 抵抗。 ——塞 ·约翰 逊 2、权力会使人渐渐失去温厚善良的美 德。— —伯克
3、最大限度地行使权力总是令人反感 ;权力 不易确 定之处 始终存 在着危 险。— —塞·约翰逊 4、权力会奴化一切。以 拉着它 的鼻子 走。— —莎士 比
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事,无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实,会谈使人敏捷,写作使人精确。——培根

博士专题:基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT

博士专题:基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术 PPT

靶向基因技术
• 经典方法 :
– 自杀质粒,同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells),难!
• 饱含希望与失望的技术:
– ZFN,被Sigma公司垄断
• 新的里程碑:
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases,类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具,现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有:四环素诱导型; 干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
(一)ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是人工改造的限制性核酸内 切酶,利用不同的锌指结构识别特异DNA序列,利用核酸酶切断靶DNA。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs》
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。

基因敲除方法专题-郭..55页PPT

基因敲除方法专题-郭..55页PPT

生物学家的梦想:随心所欲地操作基因
经典基因操作: 1. Gene trap: 化学诱变; 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组:一般物种几率低, 10-6 ; ES cell 10-2 难! 3.突破性的发现: RNAi-Knockdown; 不完全敲除,临时性。
4.充满梦想却幻灭的ZFN: • 难以完全找到匹配的3连子锌指; • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说: “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 5.完美基因靶向操作: 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术: TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦
前言
Ø什么是基因?
Ø为什么要研究基因?
Ø如何研究?
位置—分类--结构—功能
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定
真核过表达 转基因
基因敲除
进一步验证
定量表达 表达规律-qPCR
体内蛋白水平 验证
Western blotting
如何获取基因
Ø同源克隆: 已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
杆线虫(Caenorhabditis.elegans)
的par-1基因的表达以探讨该基因 的功能,结果反义RNA的确能够阻断 基因的表达,但是奇怪的是,注入正 义链RNA(sense RNA)作为对照,也 同样阻断了基因的表达。这与传统 上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术

分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件

分子生物技术《转基因、基因克隆与基因敲除技术》课件
4、转基因大豆、西红柿、玉米等。
我室构建:
ALA过表达小鼠,体内血红素增加。
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠,证明了其直接靶向细胞因子信 号因子3(Socs3)de 3’UTR.
(博士论文,研究其与宿主基因Igf2的表 达与功能的关系)
成功制作内含子Micro-RNA-483过表达转 基因小鼠—
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
连接
阳性标记基因Neor
打靶载体
HSV-tk 转入胚胎肝细胞
这样打靶载体包含了: 1、部分待剔除的基因片段,(用于与野生型的该基因 进行交换重组) 2、阳性筛选标志基因(Neor ,neomycinresistance gene) 、使细胞具有抵抗G418(能被新 霉素抵抗基因的表达产物分解)的能力。 3、阴性筛选标志基因即胸苷酸激酶(thymidine kinase-tk)基因,来自单纯庖疹病毒(HSV),当它 在受体细胞内合成出tk时,可以分解细胞培养液中加入 更昔洛韦,即gangcyclovir(一种环鸟苷酸底物)而产 生有毒的分解物使细胞死亡,为阴性筛选标志。
胚胎干细胞
HSV-tk
褐色大鼠 、 制 备 基 因 敲 除 的 胚 胎 干 细 胞
A
在特定基因剔除时,利用打靶载体上留下的部分待 剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂,当打 靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时(联 会),打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因,同 时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进 行筛选鉴定。
新霉素抗性基因 (neo)是真核表达载体的 常用筛选标志 ,neo基因编码新霉素磷酸转 移酶Ⅱ(NPTⅡ) ,能催化G418、卡那霉素 等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之 失去抗菌活性

基因敲除ppt课件

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LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体,获得相应的转基因 小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点 间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
(1)在胚胎干细胞(ES )中通过置换型载体进 行同源重组,向基因组靶位点引入选择标记基因, 并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中,发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突 变,同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因,含有HSV - tk (胸苷 激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白(TK)可使无毒性的丙氧鸟苷(GANC)转变为毒性核苷酸而 杀死细胞。
外源 基因
整合到染色体 的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等,因而可以 应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA, 导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用,也可以看作是 基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
(2)显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”,此 转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。 (3)“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配,Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点,从而达到靶基因的失活或敲除。
此外,还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’

CrisperCas技术介绍 ppt课件

CrisperCas技术介绍 ppt课件
•可针对多个基因靶向,对多基因疾病的研究有着重要作用。
Crispr Cas9隐患
•生态系统或被改变
除了农业,研究人员正在考虑CRISPR如何能被或者说应当被用于野外的 生物体。大部分注意力集中在一种被称为基因驱动的方法上,因为它能 迅速将被编辑基因在整个种群中传播。很多研究人员非常担心,改变整 个种群或将其全部清除会对生态系统产生无法预知的灾难性后果:这可 能意味着其他害虫会出现,或者影响食物链上处于较高位置的捕食者。 他们还担心,引导性RNA会随着时间的推移发生突变。随后,这种突变将 席卷整个种群,产生始料未及的影响。
• crRNA( CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白 在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。而通过人工 设计这两种 RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA (singleguide RNA ),足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切 割。
•基因编辑成为较小型特殊作物和动物的一个可行选择。过去 几年间,研究人员利用该方法对小型猪进行了基因改造,并 且获得了抗病小麦和水稻。他们还在通过基因改造获得没有 角的牛、抵抗疾病的山羊和富含维生素的甜橙等方面取得进 步。
•在干细胞或者受精卵中定向切除致病基因,用预期的DNA模 板片段进行增添和修复。
目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型,在II型系统中 pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC 和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点,在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥 作用。

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件

基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件

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(二)条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后,已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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12
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
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FLP/FRT 系统
• 该系统与Cre/loxP系统相同,也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑,Flp/FRT系统是Cre/loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中,重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似,Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子,同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target,FRT)与loxP位点非常相似, 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时,FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同,Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃,而Flp重组酶为30℃。 因此,Cre/loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题:基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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II、基因敲除:可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除,又称基因打靶,是一种遗传工程技术,是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组,能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上,从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
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ZFN 技术原理
锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)是人工改造的限制性核酸内 切酶,利用不同的锌指结构识别特异DNA序列,利用核酸酶切断靶DNA。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基;
• 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列,通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基, TGEK是多个螺旋间的连接序列;
• 一篇大鼠 《Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs》
• 两篇斑马鱼 《Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs 》
经典方法 :
自杀质粒,同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells),难!
饱含希望与失望的技术:
ZFN,被Sigma公司垄断
新的里程碑:
TALEN
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TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)的靶向 基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具,现已应用于细胞、酵母、 斑马鱼与大鼠等各类研究对象。 技术原理: 表达一个重组核酸酶,在靶点识别结构域的作用下,核酸酶识别靶点核 酸序列,并发挥内切酶活性,从而打断目标基因,完成基因敲除的过程。
切割诱发DNA损伤修复机制 (nonhomologous end-joining, NHEJ)。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
TAL 靶点识别模块
X2
FokI
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TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
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TALEN 发展过程
1989年 植物病原体黄单胞菌属 (Xanthomonas spp.) avrBs3 基因被克隆。
2007年 发现其序列特异性核酸结合特性, avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块,重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸(Repeat Variant Di-residue, RVD) 对 应识别一个目标碱基
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
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TALEN的最前沿
2011年8月, Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章,另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
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人工构建TALE模块识别指定核酸序列
102碱基模块单元
…… 14 – 18个重复 真核表达
34氨基酸单元
…… 14 – 18个重复
特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
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TALEN 发展过程
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TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对
TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点
• 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白(ZFN)可以在指定区域切断 DNA双链。
2
ZFN 技术
研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑,比如基因 敲除。已建立有ZFN库,识别多种DNA序列,但还不能达 到识别任意靶DNA的目的,其应用受到一定的限制。
锌指核酸酶介导的定向染色体删除 3
4
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• (点)突变:Silent;Missense; Nonsense;Frame shift (基因敲除, Knockout) • 片段删除 • 片段插入 目的与用途:生物模型;表达工具;基因治疗
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靶向基因技术
4. TALEN真核表达质粒转入 (卵)细胞,表达TALEN 重组蛋白
5. 检测突变效率,筛选( 移码)突变体
X2 X2
Mut
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选择确定TALE靶点
靶点的DNA序列特征: 相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点
参考文献:Cermak et al., Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting, Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 12, e82.
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》
• 一篇综述
《Move over ZFN》
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TALEN靶向(基因敲除)技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
在线靶点选择设计软件:https:///node/add/talef-off/
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TALE识别模块串联构建
• TAL的核酸识别单元 为34aa模块中的双连 氨基酸(RVD)
• RVD与A、G、C、T 有恒定的对应关系, 即NI识别A,NG识别T, HD识别C,NN识别G, 非常简单明确
• 欲使TALEN特异识 别某一核酸序列(靶 点),只须按照靶点 序列将相应TAL单元 (14 -18个)串联克 隆即可。
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具专利保护的克隆构建系统
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ห้องสมุดไป่ตู้专利保护的克隆构建系统
步骤一:靶点识别单元串联
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具专利保护的克隆构建系统
步骤二:TALEN表达质粒构建
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真核表达TALEN质粒对
将靶点识别模块克隆入真核表达载体,得到Talen质粒对 靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含 有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。
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