PCR技术的原理和应用
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1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等 人 在《Science》上 发 表
1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。
1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术
结果
FQ-PCR
每产生一条DNA链，就切断一条探针
每切断一条探针，就产生一个荧光信号
信号强度与结合探针的DNA分子数成正 比
定量PCR与定性PCR的本质区别
PCR循环
定性PCR
定量PCR
检测“期”
平台期
指数扩增期
检测“量” 终产物量 起始模板量
常规PCR技术的不足
操作相对复杂，不安全 扩增产物污染引起的假阳性 只能定性不能定量 不能揭示核酸水平与疾病发生发展的相关性
2.退火(annealing)
降温使引物与模板结合形成模板－引物复合物
3.延伸(elongation)
耐热聚合酶作用下合成新的DNA链
PCR 循环 第一步 － 变性 （９３～９８℃）
PCR循环
PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃）
PCR循环
PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃）
PCR循环
第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制
PCR循环
PCR循环
PCR循环次数与DNA产量关系
循环次数
1
21
2பைடு நூலகம்
22
3
23
10 210
20 220
30 230
DNA的链数 2 4 8
1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
logYn logYn
FQ-PCR
以 外 参 或 内 参 为 标 准，通 过 对 PCR 终 产 物 的 分析 或 PCR 过 程 的 监 测， 对 PCR 起 始 模 板 量 进行 定量。
荧光探针： TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon
荧光染料： SYBR Green I、Eva Green
3.多重PCR (multiplex PCR)
多对引物在同一个PCR反应体系中同时扩增几个不同靶 区域的PCR扩增技术
4.PCR－SSP 和 PCR－SSO
特异性引物PCR (PCR-SSP): 采用序列特异性引物进行PCR扩增的基因多态分析技术， 主要用于多态性基因的分型
特异性探针PCR (PCR-SSO) 通过基因特异性的寡核苷酸探针与PCR扩增产物杂交
第二部分
PCR在生物医学研究中的应用
一、PCR技术在生物研究中的应用
1)构建cDNA文库 2)基因突变检测 3)基因表达量检测 4)DNA序列多态性分析 5)DNA片断长度多态性分析
PCR技术在生物研究中的应用
1)构建cDNA文库
mRNA提取--反转录合成单链cDNA—PCR扩增—cDNA克隆
PCR原理与特点
PCR: Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
• 一种选择性体外扩增DNA片断的技术 • 广泛应用于生物医学的研究中 • 是分子生物学的主流技术，是所有扩增技术中
应用范围最广的一种技术。
PCR原理与特点
PCR反应过程
1.变性(denature)
加热使双链DNA变成单链DNA
PCR技术的原理和应用
Polymerase Chain Reaction
主要内容
PCR原理与特点
PCR在生物医学研究中的应用
第一部分 PCR原理与特点
PCR 发展简史
PCR (Polymerase Chain Reaction)
1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成 功实验发明了PCR
理论上：Yn=X·２n
n J型
PCR循环
实际上：Yn=X·(1+E)n E为效率，位于0至1之间
平台期
指数期 不可检测期
n S型
PCR反应体系
Mg2+
模板(DNA or RNA)(template)
DNA 耐热聚合酶(Taq polymerase)
dCTP dGTP
一对引物(primers)
dTTP
脱氧核苷酸（dNTPs） 反应缓冲体系(reaction buffer)
dATP Primer
PCR促进剂
Taq DNA聚合酶
PCR反应的特点
• 灵敏度高 • 快捷 • 简便 • 对样品纯度要求低 • 可以相对定量
PCR扩增产物的分析方法
1、凝胶电泳分析法
琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法
琼脂糖凝胶电泳图
PCR扩增产物的分析方法
1、凝胶电泳分析法
琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法
主要PCR类型
1.常规PCR 2.荧光定量PCR 3.原位PCR 4.RT－PCR 5.多重PCR 6.PCR－SSO 和 PCR－SSP
荧光定量PCR原理 Fluorescence Quantitative PCR
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 。 荧光信号超过荧光背景，开始增加，进入指数扩增期时。
☻Ct 值 (Cycle，threshold )
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
Ct值的意义
FQ-PCR
Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次
扩增
Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct
荧光定量PCR主要优点
一、闭管化学，污染机会少。 二、实现真正的样本核酸准确定量。 三、宽广的动力学范围，无需梯度稀释。 四、探针使用，特异性更强。 五、光谱分析，敏感性更高。 六、高度自动化， 操作简单，无需后处理。
FQ-PCR
与结果分析相关的两个重要概念： 荧光阈值与Ct值
☻荧光阈值 (threshold )
值不同
Ct值 原始拷贝数 ?
FQ-PCR
Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系
1.原位PCR (in situ PCR)
把原位杂交的细胞定位技术与PCR扩增相结合的技术， 主要用于基因的细胞定位、组织分布和基因表达的检测
2.反转录PCR （RT－PCR）
以mRNA为模板，通过反转录产生的cDNA为模板进行 PCR扩增
1989 12月《Science》杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。
1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术
结果
FQ-PCR
每产生一条DNA链，就切断一条探针
每切断一条探针，就产生一个荧光信号
信号强度与结合探针的DNA分子数成正 比
定量PCR与定性PCR的本质区别
PCR循环
定性PCR
定量PCR
检测“期”
平台期
指数扩增期
检测“量” 终产物量 起始模板量
常规PCR技术的不足
操作相对复杂，不安全 扩增产物污染引起的假阳性 只能定性不能定量 不能揭示核酸水平与疾病发生发展的相关性
2.退火(annealing)
降温使引物与模板结合形成模板－引物复合物
3.延伸(elongation)
耐热聚合酶作用下合成新的DNA链
PCR 循环 第一步 － 变性 （９３～９８℃）
PCR循环
PCR循环 第二步 － 退火 （３７～６５℃）
PCR循环
PCR循环 第三步 － 延伸 （７０～７５℃）
PCR循环
第一个 PCR 循环 － 靶序列完成复制
PCR循环
PCR循环
PCR循环次数与DNA产量关系
循环次数
1
21
2பைடு நூலகம்
22
3
23
10 210
20 220
30 230
DNA的链数 2 4 8
1024 1,048,576 1,073,741,824 10亿
PCR特点：高效扩增、忠实复制
logYn logYn
FQ-PCR
以 外 参 或 内 参 为 标 准，通 过 对 PCR 终 产 物 的 分析 或 PCR 过 程 的 监 测， 对 PCR 起 始 模 板 量 进行 定量。
荧光探针： TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon
荧光染料： SYBR Green I、Eva Green
3.多重PCR (multiplex PCR)
多对引物在同一个PCR反应体系中同时扩增几个不同靶 区域的PCR扩增技术
4.PCR－SSP 和 PCR－SSO
特异性引物PCR (PCR-SSP): 采用序列特异性引物进行PCR扩增的基因多态分析技术， 主要用于多态性基因的分型
特异性探针PCR (PCR-SSO) 通过基因特异性的寡核苷酸探针与PCR扩增产物杂交
第二部分
PCR在生物医学研究中的应用
一、PCR技术在生物研究中的应用
1)构建cDNA文库 2)基因突变检测 3)基因表达量检测 4)DNA序列多态性分析 5)DNA片断长度多态性分析
PCR技术在生物研究中的应用
1)构建cDNA文库
mRNA提取--反转录合成单链cDNA—PCR扩增—cDNA克隆
PCR原理与特点
PCR: Polymerase Chain Reaction 聚合酶链式反应
• 一种选择性体外扩增DNA片断的技术 • 广泛应用于生物医学的研究中 • 是分子生物学的主流技术，是所有扩增技术中
应用范围最广的一种技术。
PCR原理与特点
PCR反应过程
1.变性(denature)
加热使双链DNA变成单链DNA
PCR技术的原理和应用
Polymerase Chain Reaction
主要内容
PCR原理与特点
PCR在生物医学研究中的应用
第一部分 PCR原理与特点
PCR 发展简史
PCR (Polymerase Chain Reaction)
1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成 功实验发明了PCR
理论上：Yn=X·２n
n J型
PCR循环
实际上：Yn=X·(1+E)n E为效率，位于0至1之间
平台期
指数期 不可检测期
n S型
PCR反应体系
Mg2+
模板(DNA or RNA)(template)
DNA 耐热聚合酶(Taq polymerase)
dCTP dGTP
一对引物(primers)
dTTP
脱氧核苷酸（dNTPs） 反应缓冲体系(reaction buffer)
dATP Primer
PCR促进剂
Taq DNA聚合酶
PCR反应的特点
• 灵敏度高 • 快捷 • 简便 • 对样品纯度要求低 • 可以相对定量
PCR扩增产物的分析方法
1、凝胶电泳分析法
琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法
琼脂糖凝胶电泳图
PCR扩增产物的分析方法
1、凝胶电泳分析法
琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、核酸探针杂交法 3、PCR-ELISA法 4、荧光PCR法
主要PCR类型
1.常规PCR 2.荧光定量PCR 3.原位PCR 4.RT－PCR 5.多重PCR 6.PCR－SSO 和 PCR－SSP
荧光定量PCR原理 Fluorescence Quantitative PCR
荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值 。 荧光信号超过荧光背景，开始增加，进入指数扩增期时。
☻Ct 值 (Cycle，threshold )
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
Ct值的意义
FQ-PCR
Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次
扩增
Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct
荧光定量PCR主要优点
一、闭管化学，污染机会少。 二、实现真正的样本核酸准确定量。 三、宽广的动力学范围，无需梯度稀释。 四、探针使用，特异性更强。 五、光谱分析，敏感性更高。 六、高度自动化， 操作简单，无需后处理。
FQ-PCR
与结果分析相关的两个重要概念： 荧光阈值与Ct值
☻荧光阈值 (threshold )
值不同
Ct值 原始拷贝数 ?
FQ-PCR
Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系
1.原位PCR (in situ PCR)
把原位杂交的细胞定位技术与PCR扩增相结合的技术， 主要用于基因的细胞定位、组织分布和基因表达的检测
2.反转录PCR （RT－PCR）
以mRNA为模板，通过反转录产生的cDNA为模板进行 PCR扩增